魏海軍 肖凡

[摘要] 目的 探討B(tài)DNF 受體酪氨酸蛋白激酶B（TrkB）通路對硫化氫（H2S）減輕同型半胱氨酸（Hcy）誘導大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響。 方法 將雄性SD大鼠隨機分為六組，分別為對照組、損傷組（Hcy，0.6 μmol）、損傷+保護組[Hcy（0.6 μmol）+NaHS（100 μmol/kg）]、對照+保護組[正常+NaHS（100 μmol/kg）]及抑制保護組[Hcy（0.6 μmol）+NaHS（100 μmol/kg）+BDNF/TrkB的特異性抑制劑K252a（1 μg/d）]、對照+抑制組（正常+K252a 1 μg/d），每組8只;Tunel染色法分析大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的凋亡情況，蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）分析Caspase-3、Bcl-2在海馬中的表達。 結(jié)果 與損傷組比較，損傷+保護組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元著色細胞數(shù)減少，著色變淺，凋亡百分率明顯降低（P<0.01），并且Caspase-3蛋白相對表達量明顯降低，而Bcl-2蛋白相對表達量升高（P<0.01）;與損傷+保護組比較，抑制保護組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞凋亡率明顯增高（P<0.01），Caspase-3蛋白相對表達水平升高，而Bcl-2蛋白相對表達水平降低（P<0.01）。 結(jié)論 BDNF/TrkB通路參與硫化氫減輕同型半胱氨酸誘導的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡。

[關鍵詞] BDNF/TrkB通路;硫化氫;同型半胱氨酸;海馬神經(jīng)元凋亡

[中圖分類號] R743.3? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2022）02-0034-03

Effect of BDNF/TrkB pathway on hydrogen sulfide attenuating homocysteine-induced apoptosis of hippocampal neurons in rats

WEI Haijun1? ?XIAO Fan2

1.School of Medicine， Hunan Polytechnic of Environment and Biology， Hengyang? ?421005， China; 2.Clinical Research Institute， Affiliated Nanhua Hospital， University of South China， Hengyang? ?421001， China

[Abstract] Objective To explore the effect of brain-derived neurotrophic factor （BDNF） receptor/tyrosine kinase receptor B （TrkB） pathway on hydrogen sulfide （H2S） attenuating homocysteine （Hcy）-induced apoptosis of hippocampal neurons in rats. Methods Male SD rats were randomly divided into 6 groups， namely， the control group， the injury group （Hcy， 0.6 μmol）， the injury+protection group （Hcy [0.6 μmol]+NaHS [100 μmol/kg]）， the control+protection group （normal+NaHS [100 μmol/kg]） and the inhibition+protection group （Hcy [0.6 μmol]+NaHS [100 μmol/kg]+specific inhibitor of BDNF/TrkB [K252a （1 μg/d]）， the control+inhibition group （normal+K252a [1 μg/d]）， with 8 rats in each group. Apoptosis of hippocampus neurons in CA1 region of rats was analyzed by Tunel staining， and the expressions of Caspase-3 and Bcl-2 in the hippocampus was analyzed by protein blotting （Western blot）. Results Compared with the injury group， the number of stained neurons in the CA1 region of hippocampus in the injury+protection group decreased with lighter coloration， and the apoptosis rate was significantly lower（P<0.01）. Meanwhile， the relative expression of Caspase-3 protein significantly decreased while that of Bcl-2 protein elevated（P<0.01）. Compared with the injury+protection group， the rate of apoptosis in the CA1 region of hippocampus in the inhibition+protection group was significantly higher（P<0.01）.Meanwhile，the relative expression of Caspase-3 protein elevated while that of Bcl-2 protein decreased（P<0.01）. Conclusion BDNF/TrkB pathway is involved in H2S attenuating homocysteine-induced apoptosis in rat hippocampal neurons.

[Key words] Brain-derived neurotrophic factor/tyrosine kinase receptor B pathway; Hydrogen sulfide; Homocysteine; Apoptosis of hippocampal neurons

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）在腦內(nèi)的累積會易化應激認知功能障礙，成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一種危險因素，尤其與老年癡呆的發(fā)生發(fā)展密切相關[1]。因此，有關Hcy損傷神經(jīng)系統(tǒng)的機制及其預防、治療具有重要研究價值。而硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）在神經(jīng)保護方面發(fā)揮重要作用，尤其是在阿爾茨海默?。ˋzheimer′s disease，AD）中起到保護作用，其機制包括抗氧化、抗凋亡等[2]。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是神經(jīng)系統(tǒng)中的重要神經(jīng)營養(yǎng)因子，并且在硫化氫的神經(jīng)保護作用中發(fā)揮重要作用，本研究將從BDNF受體酪氨酸蛋白激酶B（TrkB）通路的新角度，采取Tunel染色法、Western blot的方法，分析H2S對Hcy損傷神經(jīng)元后引起的神經(jīng)元凋亡率、Caspase-3、Bcl-2蛋白表達的影響，探討H2S減輕同型半胱氨酸導致的海馬神經(jīng)元凋亡是否與BDNF/TrkB通路有關，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1 實驗動物? 雄性SD大鼠（260～300 g），由長沙斯萊克景達實驗動物有限公司提供。實驗過程都遵守國家頒布的《實驗動物管理條例》的規(guī)定，且獲得本單位醫(yī)學實驗動物倫理委員會的批準。動物許可證號：SYXK（湘）2015-0001，及試驗場所為南華大學。

1.1.2 試劑? NaHS和Hcy由Sigma公司提供;兔抗Caspae-3、鼠抗Bcl-2由單抗武漢博士德公司提供。

1.2 方法

1.2.1 動物分組? 將雄性SD大鼠隨機分為6組，分別是對照組、損傷組（Hcy，0.6 μmol）、損傷+保護組[（Hcy（0.6 μmol）+NaHS（100 μmol/kg）]、對照+保護組[（正常+NaHS（100 μmol/kg）]及抑制保護組[Hcy（0.6 μmol）+NaHS（100 μmol/kg）+BDNF受體酪氨酸蛋白激酶B（TrkB）的特異性抑制劑K252a（1 μg/d）]、對照+抑制組[正常+K252a（1 μg/d）]，每組各8只。

1.2.2 給藥方法? 對照組側(cè)腦室注射等體積生理鹽水7 d;損傷組側(cè)腦室注射0.6 μmol的Hcy 7 d;損傷+保護組進行腹腔注射NaHS[100 μmol/（kg·d）]2 d后，再同時進行側(cè)腦室注射Hcy（0.6 μmol/d）7 d;對照+保護組進行腹腔注射NaHS[100 μmol/（kg·d）]2 d后，再同時進行側(cè)腦室注射等體積的生理鹽水7 d;抑制保護組進行側(cè)腦室注射K252a（1 μg/d）2 d后及腹腔注射NaHS[100 μmol/（kg·d）]2 d后，再同時進行側(cè)腦室注射 Hcy（0.6 μmol/d）7 d。

1.2.3 Western blot測定海馬Caspase-3、Bcl-2蛋白表達水平? 在冰上將RIPA裂解液加入海馬組織中進行研磨及高速離心10 min后，收集海馬組織勻漿上清液進行測定各樣本蛋白濃度（BCA法），再進行電泳、轉(zhuǎn)印，轉(zhuǎn)印后將PVDF膜放入TTBS緩沖液中（搖動5 min），再將其取出放入脫脂奶粉中（搖動1 h）后，加入一抗孵育（4℃封閉過夜），再加入二抗孵育（37℃震蕩1 h），最后進行顯影成像并采用AlphEase FC軟件分析Caspase-3、Bcl-2條帶灰度值。

1.2.4 石蠟切片Tunel染色分析大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡? 將大鼠海馬組織進行切片脫蠟、水合、蛋白酶K消化（30 min），加入Tunel反應液（60 min），DAB顯色（10 min），蘇木素復染（3 s），溫水返藍（10 min）后，進行脫水、透明、封片，綠光源熒光顯微鏡分析并拍照。首先鏡下定位海馬CA1區(qū)（100×），再觀察取圖（200×），Tunel陽性細胞核為棕黃色，Tunel陰性細胞核為藍色，采用Image ProPlus 6.0對Tunel陽性細胞計數(shù)。

1.3 觀察指標及評價標準

通過檢測各組大鼠海馬 CA1 區(qū)神經(jīng)元的凋亡陽性率（細胞內(nèi)有棕黃色細膩顆粒彌漫或棕黃色粗顆粒分布者為陽性細胞）及凋亡相關蛋白Caspase-3、Bcl-2的表達。神經(jīng)元的凋亡陽性率越高，Caspase-3表達上調(diào)及Bcl-2表達下調(diào)代表神經(jīng)元凋亡程度越嚴重[3]。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用LSD-t檢驗分析進行兩兩比較，而隨機成組設計使用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 H2S可拮抗Hcy導致的大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡

實驗表明，與損傷組比較，損傷+保護組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元著色細胞數(shù)減少，著色變淺，凋亡百分率明顯降低（P<0.01）。見表1、封三圖5。并且Caspase-3蛋白相對表達量明顯降低，而Bcl-2蛋白相對表達量升高（P<0.01）。見表1。提示H2S 可拮抗 Hcy 導致的大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡。

2.2 K252a 可抑制 H2S 對 Hcy導致的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的拮抗作用

實驗表明，與損傷+保護組比較，抑制保護組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞凋亡率明顯增高（P<0.01）。見表2、封三圖6。Caspase-3蛋白相對表達水平升高而Bcl-2蛋白相對表達水平降低（P<0.01）。見表2。提示硫化氫減輕同型半胱氨酸誘導的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡與BDNF/TrkB通路有關。

3 討論

同型半胱氨酸是甲硫氨酸代謝出現(xiàn)的一種含硫氨基酸，其生存和清除在人體內(nèi)會保持一個動態(tài)平衡的過程。同型半胱氨酸上升是心腦血管疾病發(fā)展的關鍵危險因素，也有數(shù)據(jù)認為同型半胱氨酸的上升，可能造成患者認知功能障礙。研究發(fā)現(xiàn)，老年癡呆患者同型半胱氨酸水平高于健康體檢人員，H2S水平低于健康人群，且與病情嚴重程度具有密切關聯(lián)[4]。本研究通過對SD雄性大鼠進行側(cè)腦室注射Hcy以建立Hcy神經(jīng)毒性動物模型，實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，損傷組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞核呈棕黃色，且著色細胞數(shù)多，著色深，凋亡率明顯升高，Caspase-3蛋白相對表達水平增加而Bcl-2蛋白相對表達水平降低;表明Hcy可引起大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡，這也進一步證實了Hcy的神經(jīng)危害。

在一氧化氮（nitrogen monoxide，NO）、一氧化碳（carbon monoxide，CO）被發(fā)現(xiàn)之后，H2S也被發(fā)現(xiàn)是一種內(nèi)源性氣體分子，具備神經(jīng)保護的特性[5-7]，它在霍奇金病（Hodgkin disease，HD）、阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease，AD）、肌萎縮側(cè)索硬化（amyotrophiclateralsclerosis，ALS）、帕金森?。≒arkinson′s disease，PD）、腦缺血、熱性驚厥（febrileseizure，F(xiàn)S）等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起到重要作用[8]。細胞凋亡其實是一種細胞主動自毀過程，它受到基因的調(diào)控。其中Caspase-3是一種加速凋亡的基因，它在正常大腦發(fā)育及細胞的凋亡中起著很大作用，生理條件下的Caspase-3是沒有活性的，但是當它接收到凋亡信號刺激后就會被活化，進一步導致DNA裂解，從而引發(fā)細胞凋亡[9]。Bcl-2是阻礙凋亡的基因，Bcl-2蛋白水平增高時可抑制因氧自由基導致的細胞凋亡[10]。本研究結(jié)果顯示，與損傷組比較，損傷+保護組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元著色細胞數(shù)減少，著色變淺，凋亡百分率明顯降低，并且Caspase-3蛋白相對表達量明顯降低而Bcl-2蛋白相對表達量升高;提示H2S可拮抗 Hcy導致的大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡。李國風等[3]研究指出，H2S可顯著抑制局灶性腦缺血損傷導致的神經(jīng)元凋亡，表明H2S在抗神經(jīng)元凋亡方面起著重要作用，但是其機制需進一步深入挖掘和研究。

BDNF是一種神經(jīng)保護因子[11-13]，它主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外周神經(jīng)系統(tǒng)中，其作用體現(xiàn)為具有神經(jīng)修復、神經(jīng)再生的特性[14]。BDNF及BDNF/TrkB通路在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究中受到廣泛的關注。TrkB是神經(jīng)營養(yǎng)蛋白酪氨酸激酶受體家族的一員，其在學習記憶中發(fā)揮著重要作用[15]。本研究結(jié)果顯示，與損傷+保護組比較，抑制保護組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞凋亡率明顯增高，Caspase-3蛋白相對表達水平升高而Bcl-2蛋白相對表達水平降低;提示硫化氫減輕同型半胱氨酸誘導的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡與BDNF/TrkB通路有關。

綜上所述，本文為H2S拮抗Hcy神經(jīng)細胞凋亡的研究提供了理論基礎，但是還需要在未來的研究中更加深入地進行探索。

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（收稿日期：2021-06-08）

3812501908261