趙 磊, 李 慧, 潘景仁, 王旦輝, 江 勤, 肖 璐

(1. 新疆醫(yī)科大學校醫(yī)院, 新疆 烏魯木齊, 830011;2. 新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院 中醫(yī)科, 新疆 烏魯木齊, 830028;3. 新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市婦幼保健院 中醫(yī)科, 新疆 烏魯木齊, 830000)

非小細胞肺癌是人類常見惡性腫瘤之一，患者往往預(yù)后不良[1]。當人體處于免疫抑制狀態(tài)時，腫瘤會出現(xiàn)“免疫逃逸”[2]。近年來，中藥已被越來越多地應(yīng)用于抗腫瘤治療中，扶正消積湯作為臨床常用方劑，可增強化療藥物的抗腫瘤作用[3-4]。研究[5]發(fā)現(xiàn)，扶正消積湯可改善結(jié)腸癌患者的免疫力。但關(guān)于扶正消積湯能否通過調(diào)控免疫功能抑制肺癌腫瘤的生長，目前尚不明確。本研究構(gòu)建肺癌LA-4細胞荷瘤小鼠模型，探討扶正消積湯對荷瘤小鼠腫瘤生長、免疫調(diào)節(jié)的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞株與動物

鼠肺癌細胞株LA-4(北京中科院細胞庫); 無特定病原體(SPF)級C57BL/6小鼠30只，雄性, 6～8周齡，體質(zhì)量17～23 g, 購自武漢漢生生物有限公司，動物許可證編號為SYXK(浙)2021-0017, 動物防疫合格證編號為(漢)動防合字第20200031號。飼養(yǎng)條件: 溫度21～25 ℃, 濕度40%～70%, 自由活動，正常飼養(yǎng)。動物實驗符合“3R”原則[6]。

1.2 中藥制備方法

扶正消積湯組方為黨參15 g、黃芪15 g、茯苓12 g、白術(shù)20 g、陳皮15 g、苡仁30 g、仙鶴草30 g、白花蛇舌草30 g、炙甘草10 g。清洗藥材，煎煮后過濾, 60～80 ℃隔水蒸，濃縮成生藥量1 g/mL, 4 ℃儲存。

1.3 儀器與試劑

鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-2(IL-2)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(XY-SJH-N1027, XY-SJH-N1123, 蘇州金唯智生物有限公司)檢測，兔抗鼠CD3、CD4、CD8抗體(ab1535, ab1624, ab1811, Abcam, 美國), BD FACSCanto Ⅱ分析型流式細胞儀(天津儀器廠), JD-SY96S全自動多功能酶標儀(天津儀器廠)。

1.4 方法

1.4.1 肺癌荷瘤小鼠模型建立: DMEM培養(yǎng)基(10%胎牛血清、10萬U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素)培養(yǎng)細胞，條件37 ℃、5%CO2飽和濕度, 24 h換液。制備1×106/mL細胞懸液。在24只小鼠右側(cè)前肢腋下消毒后注射0.2 mL, 10 d后見皮下約5 mm的腫瘤表明模型構(gòu)建成功[7]。

1.4.2 處理及分組: 將24只荷瘤小鼠隨機分為4組，即模型組(同劑量生理鹽水灌胃)、低劑量組(125 mg/kg扶正消積湯灌胃)、中劑量組(250 mg/kg扶正消積湯灌胃)、高劑量組(500 mg/kg扶正消積湯灌胃)，每組6只,1次/d, 共28 d。將6只正常小鼠設(shè)為對照組，給予等量生理鹽水(量同低劑量組)灌胃, 1次/d, 共28 d。每4 d測量荷瘤小鼠腫瘤長徑(a)和短徑(b), 根據(jù)V=ab2/2計算腫瘤體積。

1.4.3 胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)及抑瘤率: 最后一次給藥后24 h, 斷頸法處死小鼠，剝離瘤體、脾臟、胸腺，計算抑瘤率、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。抑瘤率=(1-給藥組瘤質(zhì)量/模型組瘤質(zhì)量)×100%; 胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量(mg)/小鼠體質(zhì)量(g); 脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量(mg)/小鼠體質(zhì)量(g)。

1.4.4 流式細胞術(shù)檢測小鼠外周血T淋巴細胞亞群水平: 各組小鼠最后一次給藥后24 h摘除眼球取血，加入紅細胞裂解液，離心(1 000轉(zhuǎn)/min, 離心半徑10 cm, 10 min), 去上清，重懸，加入CD3、CD4和CD8一抗(1∶200、1∶200、1∶100), 室溫避光孵育15 min, 上機檢測CD4+T細胞、CD8+T細胞百分比，并計算CD4+/CD8+值。

1.4.5 小鼠血清TNF-α、IL-2表達水平檢測: 采用ELISA法檢測TNF-α、IL-2水平。

1.4.6 淋巴細胞轉(zhuǎn)化及特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)殺傷活性測定: 制備脾臟單細胞懸液，裂解紅細胞，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌，按照4×105/mL密度接種96孔板, 5 μg/mL的ConA孵育72 h后測量570 nm處光密度(OD)值。制備的小鼠脾細胞為效應(yīng)細胞，對數(shù)生長期LA-4細胞為靶細胞，相同數(shù)量細胞共培養(yǎng)24 h后測量490 nm處OD值。計算CTL殺傷活性，公式為[1-(實驗孔OD-效應(yīng)細胞對照孔OD)/靶細胞對照孔OD]×100%。每組5個復孔。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 扶正消積湯對荷瘤小鼠腫瘤生長的影響

給藥第20、24、28天，不同劑量扶正消積湯組小鼠腫瘤體積均小于模型組，且高劑量組小鼠腫瘤體積小于低劑量組、中劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。不同劑量扶正消積湯組小鼠的腫瘤質(zhì)量低于模型組，抑瘤率高于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 高劑量組的腫瘤質(zhì)量低于低劑量組、中劑量組，抑瘤率高于低劑量組、中劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。低劑量組小鼠的腫瘤體積、質(zhì)量及抑瘤率與中劑量組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1、表1。

A: 4組荷瘤小鼠腫瘤體積比較(與模型組比較, *P<0.05; 與高劑量組比較, #P<0.05);

表1 4組荷瘤小鼠腫瘤質(zhì)量和抑瘤率比較

2.2 扶正消積湯對荷瘤小鼠免疫器官指數(shù)的影響

模型組小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)低于對照組，中劑量組、高劑量組脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)高于模型組，高劑量組脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)高于低劑量組、中劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 低劑量組脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)與模型組比較，低劑量組脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)與中劑量組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組小鼠免疫器官指數(shù)比較 mg/g

2.3 扶正消積湯對荷瘤小鼠外周血T淋巴細胞亞群的影響

模型組小鼠外周血CD4+T細胞水平、CD4+/CD8+值低于對照組, CD8+T細胞水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 中劑量組、高劑量組CD4+T細胞水平、CD4+/CD8+值高于模型組, CD8+T細胞水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 而低劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05); 低劑量組、中劑量組CD4+T細胞水平、CD4+/CD8+值低于高劑量組, CD8+T細胞水平高于高劑量組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。低劑量組T淋巴細胞亞群水平與中劑量組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3、圖2。

2.4 扶正消積湯對荷瘤小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化及CTL殺傷活性的影響

模型組小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化及CTL殺傷活性均低于對照組，中劑量組、高劑量組則高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 而低劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05); 低劑量組、中劑量組小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化及CTL殺傷活性均低于高劑量組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 而低劑量組與中劑量組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表3 各組小鼠外周血T淋巴細胞亞群水平比較

圖2 流式細胞術(shù)檢測各組小鼠外周血T淋巴細胞亞群水平

表4 各組小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化及CTL殺傷活性比較

2.5 扶正消積湯對荷瘤小鼠血清TNF-α、IL-2水平的影響

模型組小鼠血清TNF-α、IL-2水平均低于對照組，中劑量組、高劑量組血清TNF-α、IL-2水平均高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 而低劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05); 低劑量組、中劑量組小鼠血清TNF-α、IL-2水平均低于高劑量組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 而低劑量組與中劑量組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表5。

表5 各組小鼠血清TNF-α、IL-2水平比較 pg/mL

3 討 論

中醫(yī)理論[8-10]認為，肺癌病因為氣血不通、痰毒凝聚，治療原則以扶正為主，消瘀化痰為輔。扶正消積湯中的白術(shù)、黃芪可起到扶正益氣功能，甘草、石斛可生津滋陰，三七、仙鶴草具有清熱解毒、補虛虧及抑癌散瘀功能，雞內(nèi)金可健脾消積，豬苓、薏苡仁可化濁抑癌[11-16]。臨床研究[17-18]表明，扶正消積湯可改善腫瘤患者的臨床癥狀。研究[19]發(fā)現(xiàn)，扶正消積湯可抑制人肺腺癌SPC-A1細胞增殖，促進凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，扶正消積湯可抑制肺癌荷瘤小鼠腫瘤生長，且抑制作用呈濃度依賴性。

惡性腫瘤患者存在免疫功能低下的情況，胸腺、脾臟是人體最重要的免疫器官，其質(zhì)量的改變可反映人體的免疫功能[20]。本研究結(jié)果顯示，中劑量、高劑量扶正消積湯治療可顯著升高荷瘤小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，提示扶正消積湯可增強荷瘤小鼠的免疫功能。淋巴細胞體外轉(zhuǎn)化是評估淋巴細胞功能的指標之一。CTL作為重要的效應(yīng)細胞，其殺傷活性是評價機體細胞免疫功能的重要指標，也是評價藥物對免疫系統(tǒng)影響的重要方法[21]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，中劑量組、高劑量組小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化程度及CTL殺傷活性均顯著升高。由此表明，扶正消積湯可通過增加免疫器官質(zhì)量、提高淋巴細胞轉(zhuǎn)化程度以及增強CTL殺傷活性而改善荷瘤小鼠免疫功能。

T淋巴細胞在人體抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用，其中CD4+T淋巴細胞分泌 TNF-α、IL-2 等細胞因子，提高人體免疫應(yīng)答, CD8+T淋巴細胞則起到負向調(diào)控作用。CD4+/CD8+值下降，提示人體免疫功能處于抑制狀態(tài)[22]。臨床研究[23-24]發(fā)現(xiàn)，肺癌患者機體存在免疫功能抑制情況，如CD4+T淋巴細胞減少, CD8+T淋巴細胞增多, CD4+/CD8+值顯著降低。本研究結(jié)果顯示，中劑量、高劑量扶正消積湯治療可提高荷瘤小鼠CD4+T細胞水平，降低CD8+T細胞水平，并提高CD4+/CD8+值。TNF-α、IL-2等細胞因子在腫瘤發(fā)生發(fā)展及免疫治療中起著至關(guān)重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，中劑量、高劑量扶正消積湯還可提高荷瘤小鼠血清TNF-α、IL-2水平，提示扶正消積湯可能通過促進TNF-α、IL-2等細胞因子的分泌，活化T細胞，提高免疫功能，進而起到抗腫瘤的作用。

綜上所述，扶正消積湯可抑制肺癌荷瘤小鼠腫瘤生長，改善荷瘤小鼠免疫功能，促進CD8+T細胞分泌IL-2、TNF-α。然而，扶正消積湯含有多種藥物成分，其具體機制有待進一步研究證實。