劉茁，彭莎莎，陳建芝，周亞林，李成剛，王丹*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.雜交水稻國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410125；3.衡陽(yáng)市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，湖南 衡陽(yáng) 421001；4.麻陽(yáng)苗族自治縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，湖南 懷化 419400)

由革蘭陰性菌水稻黃單胞菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)引起的白葉枯病是水稻最嚴(yán)重的細(xì)菌性病害[1]，往往會(huì)使水稻枯死，導(dǎo)致大幅度減產(chǎn)，在熱帶和亞熱帶地區(qū)，受害水稻一般減產(chǎn)20%～30%，嚴(yán)重的達(dá)50%，甚至顆粒無(wú)收[2]。

水稻黃單胞菌在固體培養(yǎng)基上呈現(xiàn)表面光滑的黃色菌落，通過(guò)葉片傷口進(jìn)入水稻細(xì)胞后在維管束細(xì)胞擴(kuò)散[3]。迄今已報(bào)道至少有45 個(gè)水稻白葉枯病抗性基因，其中38 個(gè)抗性基因被定位[4]。目前，已克隆Xa1、Xa2、Xa3/Xa26、Xa4、xa5、Xa10、xa13、Xa14、Xa21、Xa23、xa25、Xa27、Xa31、xa41、Xa45等15 個(gè)抗性基因[5–6]。已報(bào)道的抗病基因中，有29 個(gè)顯性基因、15 個(gè)隱性基因，這些基因有近1/3 分布在水稻第11 號(hào)染色體上。此外，第4、6 號(hào)染色體上也有較多分布。近期研究發(fā)現(xiàn)，第4 號(hào)染色體上分布有多個(gè)Xa1的等位基因[6]，說(shuō)明這些抗性基因存在基因的復(fù)制和功能進(jìn)化。水稻中已鑒定并分離、克隆的主效抗病基因有11 個(gè)，分別是Xa1、Xa3/Xa26、Xa4、xa5、Xa10、xa13、Xa21、Xa23、xa25、Xa27和xa41[3]，其中只有Xa1編碼典型的 NLR 類抗性蛋白，其他基因的編碼產(chǎn)物均是非典型的抗性蛋白[7]。

目前，利用常規(guī)連鎖分析已繪制了約40 個(gè)白葉枯病抗性的QTL[8]。在以往的研究中，基于連鎖分析的QTL 作圖法通常被用于鑒定水稻的功能基因[9]?？拱兹~枯病的QTL 分別位于水稻的8 條染色體上，其中共有11 個(gè)基因座(Xa3/Xa26，Xa4，Xa10，Xa21，Xa22(t)，Xa23，Xa30(t)，Xa32(t)，Xa35(t)，Xa36(t)和Xa39)定位于11 號(hào)染色體上；5 個(gè)基因座(Xa11，Xa2，Xa14，Xa31(t)和Xa38)定位于4 號(hào)染色體；3 個(gè)基因座(Xa7、Xa27和xa33(t))位于6 號(hào)染色體；3 個(gè)基因座(Xa29(t)、xa34(t)和Xa40(t))定位于1 號(hào)染色體[8]。Xa25[10]和xa32(t)[11]定位于12號(hào)染色體上；xa5[12]位于5 號(hào)染色體上；xa8[13]位于7 號(hào)染色體上；xa13[14]位于8 號(hào)染色體上。根據(jù)提供抗白葉枯病QTL 的水稻亞群分類，5 個(gè)基因座(xa5、Xa7、xa13、xa24和xa34(t))來(lái)自?shī)W斯稻；10個(gè)基因座(xa2、Xa4、Xa11、Xa14、Xa16、Xa18、xa25、Xa26、xa28和Xa39)來(lái)自秈稻；9 個(gè)基因座(Xa21、Xa23、Xa27、Xa29(t)、Xa30(t)、Xa32(t)、Xa35(t)，Xa38和Xa40(t))來(lái)自水稻的野生近緣種[15]?；诳拱兹~枯病QTL，9 個(gè)主要Xa基因已被克隆并鑒定，包括Xa21、Xa11、Xa3/Xa26、xa5、Xa27、xa13、Xa25、Xa10和Xa23[16–17]。

前期研究中，利用水稻群體RDP–I[18]全基因組關(guān)聯(lián)分析已成功鑒定了多個(gè)水稻抗稻瘟病和耐寒基因[19]。ZHANG 等[20]在172 份秈稻種質(zhì)中分別接種6 個(gè)白葉枯小種，利用全基因組關(guān)聯(lián)分析鑒定到12 個(gè)白葉枯抗性位點(diǎn)，并且在第2、3、6～10 號(hào)染色體上鑒定了顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，證實(shí)了全基因組關(guān)聯(lián)分析具有較高的相對(duì)分辨率。KIM 等[21]利用Ilpum與P8(對(duì)韓國(guó)白葉枯菌小種具有廣譜抗性的R基因受體)雜交獲得的F2和 BC2F2群體進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析和精細(xì)定位，鑒定了主效抗病基因Xa43(t)，并將其界定為位于DNA 標(biāo)記IBb27os11_14 和S_BB11.ssr_9 之間的大約119 kb 片段。

筆者用700 000 個(gè)單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記SNP 對(duì)RDP–I 群體中的216 份水稻種質(zhì)進(jìn)行白葉枯菌P2小種[22]接種鑒定，對(duì)RDP–I 群體接種P2 的結(jié)果進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)，運(yùn)用Tassel 軟件來(lái)確定每個(gè)SNP 和表型之間的關(guān)聯(lián)，共鑒定出59 個(gè)QTL 和40 個(gè)候選基因?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻群體RDP–I 由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。采用的216 份水稻種質(zhì)，大致可分為6個(gè)亞群，包括秈稻46 份、香型稻6 份、熱帶粳稻48份、溫帶粳稻53 份、混合稻30 份、奧斯稻30 份；另有3 份不明確。白葉枯小種P2 來(lái)源于菲律賓小種，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻基因組實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

試驗(yàn)于2018 年在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)進(jìn)行。

將水稻種子浸泡3 d 后用濕毛巾包裹，置于37 ℃烘箱催芽12～24 h。挑選發(fā)芽一致的種子，種植于溫室小桶中，每小桶2 株水稻苗。按照文獻(xiàn)[20]的方法；白葉枯小種P2 于30 ℃、蛋白胨和蔗糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d，細(xì)菌塊懸浮在無(wú)菌水中，濃度為1.0×108cfu/mL。

1.2.1 水稻接種白葉枯小種后的表型鑒定

在水稻分蘗期(種植后約60 d)，用白葉枯小種P2 接種3 株水稻頂部的3 片完全展開(kāi)的劍葉[23]，15 d 后，在接種葉片上測(cè)量損傷長(zhǎng)度。重復(fù)2 次，以獲得平均病斑長(zhǎng)度。依據(jù)王海鳳等[24]對(duì)白葉枯抗性的判別方法，對(duì)水稻種質(zhì)進(jìn)行抗性分級(jí)：平均病斑長(zhǎng)度小于2 mm，為免疫(I)，0 級(jí)；平均病斑長(zhǎng)度大于等于2 mm 且小于 15 mm，為高度抗性(HR)，1級(jí)；平均病斑長(zhǎng)度大于等于15 mm 且小于30 mm，為中度抗性(MR)，3 級(jí)；平均病斑長(zhǎng)度大于等于30 mm 且小于 50 mm，為中度敏感(MS)，5 級(jí)；平均病斑長(zhǎng)度大于等于50 mm 且小于100 mm，為敏感(S)，7 級(jí)；平均病斑長(zhǎng)度大于等于100 mm，為高度敏感(HS)，9 級(jí)。

1.2.2 水稻基因型檢測(cè)

利用MCCOUCH等[25]報(bào)道的700 000個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)芯片對(duì)水稻種質(zhì)進(jìn)行基因型分析，在Tassel 4.0 軟件中過(guò)濾掉低質(zhì)量的SNP 位點(diǎn)，選擇最小等位基因頻率大于5%以及缺失率小于0.1 的SNP 位點(diǎn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

1.2.3 水稻抗白葉枯基因全基因組關(guān)聯(lián)分析

使用PLINK 的連鎖不平衡修剪工具共篩選出277 524 個(gè)次要等位基因頻率大于5%且缺失數(shù)據(jù)比率小于0.1 的SNPs，用于216 個(gè)種質(zhì)的關(guān)聯(lián)分析。運(yùn)用Tassel軟件分析接種后每個(gè)SNP 和每個(gè)接種的白葉枯病斑長(zhǎng)度之間的關(guān)聯(lián)。使用R 包qqman 繪制曼哈頓圖和Q– Q 圖[26]。

1.2.4 水稻抗白葉枯病相關(guān)QTL 的定位

通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析，獲得了114 個(gè)與白葉枯病抗性相關(guān)聯(lián)的SNP(–lgP≥5.0)。為降低假陽(yáng)性，以在200 kb 的基因組間隔內(nèi)具有至少2 個(gè)顯著相關(guān)的SNP 位點(diǎn)為標(biāo)準(zhǔn)，定位抗病相關(guān)的QTL。在國(guó)家水稻數(shù)據(jù)中心(http://www.ricedata.cn/)及NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中尋找已克隆或定位的白葉枯病抗性相關(guān)基因的信息，與所檢測(cè)的QTL 進(jìn)行共定位。

1.2.5 抗白葉枯病相關(guān)候選基因分析

從獲得的與白葉枯病抗性相關(guān)聯(lián)的SNP(lgP≥5.0)，參考日本晴(NPB)基因組數(shù)據(jù)(MSU v7.0)(http://rice.plantbiology.msu.edu/) ， 在 每 個(gè) 峰 值SNP(–lgP≥5.0)附近2 Mb 區(qū)域定位所有類型已報(bào)告與白葉枯抗性相關(guān)的R基因和防御相關(guān)基因，并列出所有基因以及注釋信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻RDP-I 群體抗白葉枯病的表型

對(duì)水稻RDP–I 群體216 份種質(zhì)進(jìn)行白葉枯病抗性鑒定的結(jié)果表明，高抗種質(zhì)16 個(gè)，占群體的7.4%；中抗種質(zhì)34 個(gè)，占群體的15.7%；中感種質(zhì)36 個(gè)，占群體的16.7%；感病種質(zhì)98 個(gè)，占群體的45.4%；高感種質(zhì)32 個(gè)，占群體的14.8%。在整個(gè)群體中，抗病種質(zhì)占23.1%，感病種質(zhì)占76.9%，沒(méi)有免疫種質(zhì)，表明該群體總體對(duì)白葉枯小種P2表現(xiàn)為感病。

水稻群體中亞群的抗病表型直方圖(圖1–a)表明，溫帶粳稻亞群平均病斑長(zhǎng)度最短，奧斯稻亞群平均病斑長(zhǎng)度最長(zhǎng)。氣泡圖(圖1–b)顯示，氣泡自上而下分別代表1～9 級(jí)抗病等級(jí)，氣泡大小代表種質(zhì)數(shù)目，通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，在抗病等級(jí)≤3(表型表現(xiàn)為抗病)時(shí)，溫帶粳稻亞群中含有32 個(gè)種質(zhì)，而熱帶粳稻亞群僅有5 個(gè)種質(zhì)，混合型水稻有8 個(gè)種質(zhì)。

圖1 RDP-I 群體的亞群抗病表型Fig.1 Disease resistance phenotype in subpopulations of RDP-I

對(duì)216 份水稻種質(zhì)的表型數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)在50個(gè)抗性種質(zhì)中溫帶粳稻亞群的種質(zhì)最多，占總數(shù)的64%，熱帶粳稻亞群的種質(zhì)僅占10%，混合型水稻亞群的種質(zhì)占18%。該結(jié)果同群體材料中亞群白葉枯病抗性分布較一致。此外，高抗的16 個(gè)種質(zhì)分別來(lái)自亞洲(75%)、非洲(6.25%)、北美洲(6.25%)、南美洲(6.25%)以及歐洲(6.25%)，其中亞洲大部分抗性種質(zhì)來(lái)自日本(表1)。

表1 水稻高抗種質(zhì)亞群及地區(qū)分布Table 1 Subpopulation and regional distribution of high resistant varieties

2.2 水稻RDP-I 群體抗白葉枯病的全基因組關(guān)聯(lián)分析

基于216 份水稻種質(zhì)的抗病表型數(shù)據(jù)及700 000個(gè)SNP 基因型數(shù)據(jù)，選擇MLM 模型進(jìn)行抗病表型數(shù)據(jù)和SNP 標(biāo)記的全基因組關(guān)聯(lián)分析。在閾值[–lgP≥5.0]判定SNP 標(biāo)記與抗病表型關(guān)聯(lián)的顯著性，共檢測(cè)到114 個(gè)相關(guān)聯(lián)的SNP 位點(diǎn)，覆蓋全部染色體?？共”硇完P(guān)聯(lián)分析結(jié)果如圖2 所示，曼哈頓圖中紫色實(shí)線以上代表抗病相關(guān)性顯著的位點(diǎn)。

圖2 白葉枯病抗病表型全基因組關(guān)聯(lián)分析Fig.2 Genome-wide association analysis of rice blast resistance phenotype

以SNP 上、下游200 kb 范圍內(nèi)至少2 個(gè)顯著相關(guān)SNP 位點(diǎn)作為1 個(gè)QTL，對(duì)GWAS 結(jié)果所檢測(cè)的114 個(gè)抗病相關(guān)SNP 進(jìn)行QTL 分析。由表2可知，在除第3、5 號(hào)外的10 條染色體上，定位到59 個(gè)白葉枯病抗性相關(guān)位點(diǎn)(qBBRs)。第8 號(hào)染色體上的分布最多，為16 個(gè)，其中最關(guān)聯(lián)的SNP 標(biāo)記(SNP–8.15871032)位于第8 號(hào)染色體上。將這些檢測(cè)的qBBRs 同已克隆或定位的白葉枯病抗性相關(guān)基因進(jìn)行共定位，共定位了5 個(gè)已克隆的白葉枯病抗性基因，分別是Xa27、xa13、Xa3/Xa26、Xa10、Xa25。分析發(fā)現(xiàn)，這5 個(gè)基因中，xa13為負(fù)調(diào)控因子，表達(dá)量下調(diào)，其余4 個(gè)均為抗病反應(yīng)的正調(diào)控因子。

表2(續(xù))

2.3 白葉枯病抗性候選基因分析

基于QTL 數(shù)據(jù)及閾值(–lgP≥5.0)的SNP 位點(diǎn)，結(jié)合水稻參考基因組注釋(MSU v7.0)(http://rice.plantbiology.msu.edu/)，對(duì)水稻每條染色體上較高閾值SNP 位點(diǎn)以及這些位點(diǎn)附近40 kb 區(qū)段候選基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，共獲得了40 個(gè)白葉枯抗性候選基因(表3)，包含編碼富含亮氨酸蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、F–box 類型蛋白、MYB 家族蛋白、細(xì)胞色素、泛素酶等蛋白的基因。

表3 水稻RDP-I 群體40 個(gè)白葉枯病抗性候選基因Table 3 Forty candidate genes in rice RDP-I population for bacterial blight resistance

表3(續(xù))

3 討論

對(duì)RDP–I 群體216 份水稻種質(zhì)進(jìn)行白葉枯病抗性評(píng)估，其中溫帶粳稻亞群平均抗性水平最高，其平均病斑長(zhǎng)度最短，奧斯稻亞群平均抗性水平最低，平均病斑長(zhǎng)度最長(zhǎng)，秈稻、香型稻、熱帶粳稻、混合型水稻亞群的平均抗性水平居中。對(duì)高抗種質(zhì)的亞群分布進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)來(lái)自溫帶粳稻亞群的種質(zhì)最多， 16 個(gè)高抗種質(zhì)中有15 個(gè)種質(zhì)屬于溫帶粳稻，只有1 個(gè)種質(zhì)屬于混合型水稻，這與群體分布結(jié)果相一致。此外，高抗種質(zhì)中有12 個(gè)種質(zhì)來(lái)自亞洲(75%)，可能與亞洲地區(qū)的白葉枯病抗性選擇較高有關(guān)。

選擇混合線性模型MLM 對(duì)抗病表型及700 000個(gè) SNP 基因型進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，共檢測(cè)到分布于12 條染色體上的114 個(gè)相關(guān)聯(lián)SNP 位點(diǎn)。對(duì)這些SNP 位點(diǎn)進(jìn)行QTL 分析，發(fā)現(xiàn)在除3 號(hào)和5 號(hào)外的10 條染色體上定位到59 個(gè)qBBRs，P值介于5.02 和8.78 之間。將這些qBBRs 同已克隆或定位的基因進(jìn)行共定位，發(fā)現(xiàn)5 個(gè)位點(diǎn)(qBBR6–2、qBBR8–19、qBBR11–7、qBBR11–6、qBBR12–6)共定位了5 個(gè)白葉枯病抗性相關(guān)基因，全部為已克隆的基因，分別位于第6、8、11、12 號(hào)染色體上。這 5 個(gè)位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的峰值 SNP 分別為 SNP–6.23780194、SNP–8.26377179、SNP–11.28386092、SNP–11.23821429、SNP–12.17594747。其余54 個(gè)顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)為首次發(fā)現(xiàn)。從閾值相對(duì)較高的SNP位點(diǎn)附近共篩選到40 個(gè)抗白葉枯病候選基因，其編碼鋅指蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、富亮氨酸重復(fù)等類型蛋白?；谝陨涎芯?，后續(xù)工作將主要集中于候選基因的鑒定以及白葉枯病抗性基因的克隆與功能分析，為水稻抗病提供有效的抗性基因，為培育廣譜抗性水稻品種打下基礎(chǔ)。