彭艷，劉躍武，劉伯涵，陳信波

（1.作物基因工程湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)信息與智能科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

高溫是限制植物生長和產(chǎn)量的關(guān)鍵因素之一[1]，而通常稱為“伴生脅迫”的高溫干旱復(fù)合脅迫在熱帶和亞熱帶的水稻主要種植區(qū)非常普遍。有研究[2-4]表明，在復(fù)合脅迫條件下觀察到的生理和分子水平反應(yīng)與單獨暴露于任何一種脅迫下的反應(yīng)有較大的差異。生殖期（特別是開花期）被認(rèn)為是對高溫和干旱脅迫最敏感的時期[5]。開花期高溫會使水稻花期變短，花時分散，柱頭上花粉的粒數(shù)、花粉萌發(fā)率、花粉活力、花藥開裂系數(shù)以及結(jié)實率顯著下降，進(jìn)而影響產(chǎn)量[6-9]。而開花期高溫干旱復(fù)合脅迫能誘導(dǎo)花藥異常開裂，導(dǎo)致柱頭上萌發(fā)的花粉數(shù)量減少、育性下降，且脅迫持續(xù)的時間越長，育性越低，最終影響產(chǎn)量和品質(zhì)[5,10]。

植物miRNAs 是一類由內(nèi)源基因編碼的大小約20～24 nt 的非編碼單鏈小分子RNA，通過與mRNA 3'-UTR 互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致mRNA 降解或翻譯抑制來調(diào)控基因的表達(dá)[11]。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)許多水稻miRNAs 在逆境脅迫中發(fā)揮著重要的作用。在高溫脅迫下，過表達(dá)miR169R-5P 能通過調(diào)節(jié)靶基因OsHAP2F的表達(dá)來增強(qiáng)水稻開花期的耐熱性[12]。本研究中，筆者擬通過數(shù)據(jù)庫檢索和文獻(xiàn)挖掘，對高溫脅迫和高溫干旱復(fù)合脅迫下水稻（N22）花藥和授粉雌蕊的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，旨在探尋在高溫和高溫干旱復(fù)合脅迫下花藥和授粉雌蕊中均差異表達(dá)的敏感基因，通過分析其表達(dá)模式、染色體分布以及所富集的功能和參與的代謝途徑，預(yù)測這些敏感基因可能受哪些上游miRNAs 的調(diào)控，為水稻抗性新品種選育提供潛在的分子標(biāo)記，同時也為完善miRNAs 及關(guān)鍵基因在伴生脅迫下的調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)。

1 數(shù)據(jù)來源與分析方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

高溫和高溫干旱復(fù)合脅迫下水稻N22 的花藥和授粉雌蕊中基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)來自NCBI 數(shù)據(jù)庫生物數(shù)據(jù)集GSE57154[13]和文獻(xiàn)[14]。在生物數(shù)據(jù)集GSE57154 中一共選取了3 個處理的14 個樣本。對照處理包括 3 個正常生長的水稻花藥樣本GSM1376277、GSM1376278、GSM1376279 和3 個正常生長的水稻授粉雌蕊樣本 GSM1376301、GSM1376302、GSM1376303，生長在自然光照條件下，相對濕度75%～85%，晝、夜溫度分別為29、21 ℃。高溫處理包括3 個受高溫脅迫的水稻花藥樣本GSM1376295、GSM1376296 和GSM1376297, 其處理條件為：晝、夜溫度分別設(shè)置為38、21 ℃，相對濕度為75%，07:30—08:30 從29 ℃逐漸升高至38 ℃，并保持在38 ℃直至14:30。高溫干旱復(fù)合脅迫處理包括3 個受高溫干旱復(fù)合脅迫的水稻花藥樣本GSM1376289、GSM1376290、GSM1376291 和2個高溫干旱復(fù)合脅迫的水稻授粉雌蕊樣本GSM1376307、GSM1376308。高溫干旱復(fù)合脅迫條件為：干旱脅迫從主蘗抽穗前5 d 開始，當(dāng)水稻開花期劍葉相對含水率保持在60%～70%時，38 ℃下熱處理6 h（08:30—14:30）。從文獻(xiàn)[14]中收集高溫脅迫下水稻授粉雌蕊中基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)。其對照和高溫處理的條件與生物數(shù)據(jù)集GSE57154 的條件一致。

高溫脅迫下響應(yīng)的水稻miRNAs 表達(dá)數(shù)據(jù)來自文獻(xiàn)[15-16]；干旱脅迫下響應(yīng)的miRNAs 表達(dá)數(shù)據(jù)來自文獻(xiàn)[17-18]；高溫干旱復(fù)合脅迫響應(yīng)的miRNAs 表達(dá)數(shù)據(jù)來自文獻(xiàn)[19]。

1.2 分析方法

1.2.1 差異表達(dá)分析

采用GEO2R 對高溫和高溫干旱復(fù)合脅迫下水稻花藥和授粉雌蕊的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析，通過比較花藥和授粉雌蕊中對照組數(shù)據(jù)和脅迫處理數(shù)據(jù)來篩選差異表達(dá)的基因。篩選的準(zhǔn)則如下：

式中：FC（fold change）為倍數(shù)變化，F(xiàn)DR（false discovery rate） 為錯誤發(fā)現(xiàn)率。同時滿足公式（1）和（2）的基因即為差異表達(dá)基因（DEGs）。在高溫和高溫干旱復(fù)合脅迫下的花藥和授粉雌蕊中均差異表達(dá)的基因即視為敏感基因。

為了鑒定高溫、干旱和高溫干旱復(fù)合脅迫下水稻中差異表達(dá)miRNAs（DE-miRNAs），通過比較對照組數(shù)據(jù)和脅迫處理數(shù)據(jù)來篩選具有差異表達(dá)的miRNAs，滿足公式（1），則視為高溫、干旱和高溫干旱復(fù)合脅迫下的DE-miRNAs。

1.2.2 基因的功能分類和富集分析

利用生物信息學(xué)工具STRING v11.0[20]進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域、GO 功能、UP_KEYWORDS 以及RCTM通路的富集分析。選取滿足公式（2）的注釋和通路用于進(jìn)一步分析。

1.2.3 敏感基因上游miRNAs 的預(yù)測與高信度miRNAs 的鑒定

利用植物 miRNAs 靶基因在線預(yù)測軟件psRNATarget[21]對敏感基因的上游miRNAs 進(jìn)行預(yù)測。所有參數(shù)除將最大期望值設(shè)置為3 外，其他均按照軟件所述設(shè)置嚴(yán)格的篩選標(biāo)準(zhǔn)，敏感基因的DNA 序列從RAP-DB（https://rapdb.dna.affrc. go.jp/）數(shù)據(jù)庫中獲取，miRNAs 數(shù)據(jù)庫選擇 miRBase Release 21 進(jìn)行匹配。

獲得預(yù)測的miRNAs 后，將其與在高溫、干旱或高溫干旱復(fù)合脅迫下水稻中的DE-miRNAs 數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，得到預(yù)測的miRNAs 在干旱、高溫、高溫干旱復(fù)合脅迫下的差異表達(dá)數(shù)據(jù)，這些差異表達(dá)的預(yù)測miRNAs 即有可能是高溫和高溫干旱復(fù)合脅迫下水稻花藥和授粉雌蕊中敏感基因的高信度miRNAs。

1.2.4 維恩分析

通過在線工具“An interactive tool for comparing lists with Venn's diagrams” venny 2.1（https://bioinfog p.cnb.csic.es/tools/venny/）編制Venn 圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫和高溫干旱復(fù)合脅迫下水稻花藥和授粉雌蕊中DEGs 的鑒定與分析

高溫脅迫下，共有1153 個基因在花藥中差異表達(dá)，其中186 個上調(diào)，967 個下調(diào)；630 個基因在授粉雌蕊中差異表達(dá)，其中上調(diào)的259 個，下調(diào)的371 個。高溫干旱復(fù)合脅迫下，在花藥中共鑒定出1484 個基因差異表達(dá)，其中表達(dá)上調(diào)的基因1185 個，下調(diào)的299 個；2672 個基因在授粉雌蕊中差異表達(dá)，其中上調(diào)的1381 個，下調(diào)的1291 個。這些結(jié)果表明，無論是在花藥還是授粉雌蕊中，高溫干旱復(fù)合脅迫下DEGs 的數(shù)量均明顯高于單一的高溫脅迫；高溫脅迫下在花藥和授粉雌蕊中表達(dá)上調(diào)的基因數(shù)量明顯低于下調(diào)基因的數(shù)量，而高溫干旱復(fù)合脅迫下的結(jié)果卻剛好相反，上調(diào)的基因數(shù)明顯高于下調(diào)的基因數(shù)。說明無論是花藥還是授粉雌蕊都主要是通過下調(diào)基因的表達(dá)來抵御高溫脅迫，通過上調(diào)基因的表達(dá)來抵御高溫干旱復(fù)合脅迫。

高溫和高溫干旱復(fù)合脅迫下花藥和授粉雌蕊中DEGs 的分布見圖1。結(jié)果顯示，共有304 個基因在高溫脅迫和高溫干旱復(fù)合脅迫下的花藥中差異表達(dá)；在授粉雌蕊中，有293 個基因既在高溫脅迫下差異表達(dá)，又在高溫干旱復(fù)合脅迫下差異表達(dá)；高溫脅迫下，在花藥和授粉雌蕊中均差異表達(dá)的基因有95 個；在高溫干旱復(fù)合脅迫下，有380個基因在花藥和授粉雌蕊中差異表達(dá)。但僅有47個基因在高溫脅迫和高溫干旱復(fù)合脅迫下的花藥和授粉雌蕊中均差異表達(dá)，說明這47 個差異表達(dá)的基因在脅迫下的水稻花藥和授粉雌蕊中起著非常重要的作用，是脅迫下花器官中的敏感基因。

圖1 高溫和高溫干旱復(fù)合脅迫下水稻花藥和授粉雌蕊中DEGs 的韋恩圖Fig. 1 The Venn diagram analysis on the DEGs in rice anthers and p ollinated p istils under he at s tress and c ombined heat and drought stress

2.2 47 個敏感基因的表達(dá)分析及染色體分布

高溫和高溫干旱復(fù)合脅迫下水稻花藥和授粉雌蕊中的47 個敏感基因的表達(dá)及注釋見表1。從表1 可以看出，這47 個敏感基因主要由熱激蛋白、伴侶蛋白、鈣結(jié)合蛋白和折疊酶等基因家族組成，其中，2 個類鈣調(diào)蛋白基因CML36在高溫和高溫干旱復(fù)合脅迫下的花藥中表達(dá)上調(diào)，但在授粉雌蕊中表達(dá)下調(diào)，表明這2 個敏感基因在逆境脅迫下的表達(dá)具有組織特異性，但對不同種類脅迫的應(yīng)答沒有特異性；OMTN4在高溫脅迫下表達(dá)下調(diào)，但在高溫干旱復(fù)合脅迫下表達(dá)上調(diào)，說明OMTN4在逆境脅迫下的表達(dá)具有脅迫特異性；RS5僅在高溫脅迫下的花藥中表達(dá)下調(diào)，在授粉雌蕊中及高溫干旱復(fù)合脅迫下的花器官中表達(dá)均上調(diào)；其余43 個敏感基因在高溫和高溫干旱復(fù)合脅迫下的水稻花藥和授粉雌蕊中表達(dá)一致，除PSD2和UMAMIT7表達(dá)下調(diào)外，其他41 個敏感基因（包括熱激蛋白、伴侶蛋白、折疊酶、糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因等）均上調(diào)其表達(dá)。染色體分布分析發(fā)現(xiàn)，47 個敏感基因在除10 號染色體外的其他染色體上都有分布，但在1～6 號染色體具有較高的靶向頻率。

表1(續(xù))

2.3 47 個敏感基因所富集的蛋白結(jié)構(gòu)域

47 個敏感基因的INTERPRO 蛋白結(jié)構(gòu)域的富集分析結(jié)果表明，敏感基因主要富集到25 個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域（圖2），主要為熱休克蛋白（包括4個HSP70和13 個小熱休克蛋白）、伴侶蛋白（主要是ClpB 和DnaJ）、四肽重復(fù)、FKBP 型肽脯氨酰順反異構(gòu)酶和EF-hand 蛋白結(jié)構(gòu)域。而類HSP20 伴侶、小熱休克蛋白HSP20 和α 晶體蛋白/Hsp20 結(jié)構(gòu)域是富集基因數(shù)量較多的結(jié)構(gòu)域，所富集基因數(shù)分別為14、13和13。

圖2 47 個敏感基因的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域富集分析結(jié)果Fig.2 INTERPRO protein domains enrichment analysis result of 47 sensitive genes

2.4 47 個敏感基因的功能富集分析

47 個敏感基因的功能富集分析結(jié)果（圖3） 表明，敏感基因主要富集到16 個GO 術(shù)語，包括9個生物學(xué)過程（biological process，BP）和7 個細(xì)胞組分（cellular component，CC），沒有顯著富集的分子功能。生物學(xué)過程主要富集在對熱響應(yīng)、對壓力的反應(yīng)以及對活性氧的反應(yīng)等與脅迫密切相關(guān)的過程以及蛋白質(zhì)折疊；細(xì)胞組分主要富集于細(xì)胞質(zhì)、胞內(nèi)和胞質(zhì)部分。在RCTM 途徑富集分析中發(fā)現(xiàn)，47 個敏感基因主要富集于8 條代謝途徑，其中細(xì)胞對壓力的反應(yīng)、類固醇激素受體的HSP90 伴侶循環(huán)以及細(xì)胞對熱應(yīng)激的反應(yīng)是排在前3 位顯著富集的途徑，且細(xì)胞對壓力的反應(yīng)途徑所富集的基因最多（6 個）。此外，敏感基因還顯著富集于HSF1 依賴性轉(zhuǎn)錄激活、HSF1 介導(dǎo)的熱休克反應(yīng)調(diào)控、蛋白質(zhì)甲基化、粒作用和翻譯后蛋白質(zhì)修飾等基本的生物代謝途徑和熱激響應(yīng)途徑。UP_KEYWORDS 分析共獲得了12 個顯著富集的UP_KEYWORDS 術(shù)語，其中應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是排在前3 位的顯著富集的UP_KEYWORDS 術(shù)語；富集基因數(shù)最多的是應(yīng)激反應(yīng)和螺旋線圈，分別有17、10 個基因，此外，敏感基因還顯著富集于鈣、ATP 結(jié)合、選擇性拼接、重復(fù)、輪狀淀粉酶、異構(gòu)酶、分子伴侶、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和TPR 重復(fù)。綜合以上情況可知，47 個敏感基因在高溫和高溫干旱復(fù)合脅迫下的花藥和授粉雌蕊中主要參與了一些基本的以及與脅迫密切相關(guān)的生物學(xué)過程和代謝途徑，還參與了蛋白質(zhì)甲基化和類固醇激素受體的HSP90 伴侶循環(huán)。

圖3 47 個敏感基因的功能富集分析結(jié)果Fig.3 The functional enrichment analysis result of 47 sensitive genes

2.5 高溫、干旱和高溫干旱復(fù)合脅迫下 DEmiRNAs 鑒定以及47 個敏感基因的上游miRNAs 預(yù)測

通過文獻(xiàn)檢索和差異表達(dá)分析，分別鑒定出154、339、22 個在高溫、干旱和高溫干旱復(fù)合脅迫下差異表達(dá)的水稻miRNAs。對47 個敏感基因的上游miRNAs 進(jìn)行預(yù)測，獲得了49 個潛在的miRNAs。將49 個潛在的miRNAs 與表1 中差異表達(dá)的miRNAs 進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)49 個潛在的miRNAs 中有28個miRNAs在干旱或高溫或高溫干旱復(fù)合脅迫下差異表達(dá)，說明這28 個差異表達(dá)的miRNAs 可能是其對應(yīng)的13 個敏感基因的潛在上游miRNAs（表2）。已有研究證實LOC_Os06g46270 （OMTN4）是osa-miR164 的靶基因[20]，說明通過敏感基因的DNA 序列可預(yù)測其可能受哪些miRNAs 的調(diào)控。

表2 敏感基因的miRNAs 預(yù)測Table 2 The putative miRNAs of sensitive genes

3 結(jié)論與討論

本研究采用生物信息學(xué)手段，從水稻花器官轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出47 個在高溫脅迫和高溫干旱復(fù)合脅迫下的花藥和授粉雌蕊中均差異表達(dá)的敏感基因，并對其表達(dá)模式、所富集的蛋白結(jié)構(gòu)域、功能和代謝途徑以及可能受哪些上游miRNAs 的調(diào)控進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：熱休克蛋白、伴侶蛋白以及折疊酶的表達(dá)上調(diào)，將有利于水稻花器官對抗脅迫誘導(dǎo)的胞內(nèi)蛋白損傷，增強(qiáng)水稻抗性。因為熱休克蛋白和分子伴侶是逆境脅迫應(yīng)答的主要功能蛋白[22]，熱休克蛋白能利用其分子伴侶的活性促進(jìn)變性蛋白正確的重折疊來防止蛋白的沉淀，從而使得細(xì)胞能對抗高溫誘導(dǎo)的胞內(nèi)蛋白的損傷；而折疊酶如蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（PDIs）在植物氧化還原信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白質(zhì)折疊中起重要作用。有研究[23-25]發(fā)現(xiàn)，擬南芥中的PDIs在花中的表達(dá)量較高，且逆境脅迫能誘導(dǎo)PDI表達(dá)的迅速上升，以抵御脅迫，增強(qiáng)植物的抗性。高溫干旱復(fù)合脅迫下，谷類作物花中熱休克蛋白和糖轉(zhuǎn)運(yùn)與積累的調(diào)節(jié)是決定不同基因型品種耐逆性的關(guān)鍵因素[26]，糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在糖的運(yùn)輸和積累中起重要作用。本研究中，糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因UTR3在2 種脅迫下的表達(dá)上調(diào)，說明其可能是逆境脅迫下提高水稻抗性的關(guān)鍵基因。UMAMIT7作為生長素誘導(dǎo)蛋白基因，在水稻不同發(fā)育階段各器官的轉(zhuǎn)錄組分析中發(fā)現(xiàn)其在灌漿籽粒、花和花蕾中的表達(dá)量最高[27]。本研究中，UMAMIT7在2 種脅迫下的花藥和授粉雌蕊中的表達(dá)下調(diào)，說明其可能不利于水稻開花和灌漿。在脅迫條件下具有組織特異性的類鈣調(diào)蛋白CML 可能對生殖期水稻育性起關(guān)鍵作用。有研究[28-29]表明，類鈣調(diào)蛋白CML 在調(diào)控花粉發(fā)育、花粉管生長以及逆境脅迫方面起重要作用，但在2 種逆境脅迫下對水稻花藥和授粉雌蕊的影響還有待進(jìn)一步研究。有研究[30-31]表明，OMTN4在高溫脅迫和干旱脅迫下的表達(dá)水平均會顯著降低，而過表達(dá)OMTN4會降低水稻生殖期的抗旱性。本研究中，OMTN4在高溫脅迫下表達(dá)下調(diào)，但在高溫干旱復(fù)合脅迫下的表達(dá)水平顯著提高，說明OMTN4可能在高溫干旱復(fù)合脅迫下產(chǎn)生了不同于單獨暴露在高溫或干旱脅迫下的表達(dá)模式，不利于水稻生殖期的耐逆性。

富集分析結(jié)果顯示，47 個敏感基因主要富集于與脅迫相關(guān)的蛋白結(jié)構(gòu)域、生物學(xué)過程以及代謝途徑。富集的小熱休克蛋白（sHSP）是植物抗逆過程中的第一條防線[32]，而HSP70 蛋白可增強(qiáng)植物對多種非生物逆境脅迫的抗性[33]，還可通過調(diào)節(jié)活性氧的含量來抑制水稻細(xì)胞的程序性死亡[34]。作為HSP100 和HSP70 分子伴侶家族成員的ClpB 和DnaJ 在對抗高溫脅迫等多種逆境過程中起著非常重要的作用[35-36]。EF-hand 結(jié)構(gòu)域是一種與Ca2+結(jié)合有關(guān)的螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)能通過與Ca2+的快速結(jié)合或分離，增強(qiáng)植物對非生物脅迫的耐受性[37]。四肽重復(fù)與伴侶蛋白有特定的相互作用，且與水稻抗性有關(guān)[38]。FKBP 型肽脯氨酰順反異構(gòu)酶在脅迫反應(yīng)中也起著重要作用[39]。說明高溫脅迫和高溫干旱復(fù)合脅迫下花藥和授粉雌蕊中絕大多數(shù)敏感基因的功能都與抗逆相關(guān)，這為進(jìn)一步深入研究高溫干旱脅迫下水稻花器官中關(guān)鍵響應(yīng)基因的生理功能提供依據(jù)。

miRNAs 的生物學(xué)功能與其靶基因的功能密切相關(guān)。miRNAs 可通過調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)在植物生長發(fā)育、激素響應(yīng)和抗逆等多個方面起至關(guān)重要的作用。由于植物miRNA 對靶基因的識別具有高度保守性，一般不會超過4 個堿基的錯配，這為通過逆向思維獲得敏感基因可能的上游miRNAs 提供了可能。結(jié)合敏感基因表達(dá)分析、富集分析以及上游miRNAs 的預(yù)測結(jié)果，可推斷2 種脅迫條件下，osa-miR5144-3p、osa-miR2878-3p、osa-miR1848、osa-miR1862e/f/g、osa-miR529b 和osa-miR5498 可能在水稻花器官防止蛋白沉淀、促進(jìn)蛋白正確折疊中起重要的作用；而osa-miR164、osa-miR156 和osa-miR5162 則可能在水稻生殖期間對水稻育性、抽穗、衰老以及磷脂代謝中起關(guān)鍵作用，但這些miRNAs 對水稻花器官的具體影響還有待進(jìn)一步驗證。