喬克威，滕進(jìn)婧，周小云，李健，劉明新，楊華*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南省農(nóng)作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

MLP 蛋白是一種神秘果素類似蛋白[1]。1995年，MASUDA 等[2]在神秘果果實(shí)中克隆了該神秘果素基因；2006 年，TSUKUDA 等[3]從粗皮檸檬（Citrusjambhiri）中克隆了RlemMLP2和RlemMLP3 基因；2010 年，GAHLOTH 等[4]從月橘中克隆了MLP基因。SO-ICHIRO 等[5]發(fā)現(xiàn)葡萄MLP 蛋白對(duì)胰蛋白酶有抑制作用。李夢(mèng)蕓[6]對(duì)金柑進(jìn)行冷馴化，發(fā)現(xiàn)隨著冷馴化時(shí)間的延長(zhǎng)，金柑中MLP2–2基因的相對(duì)表達(dá)量上升，認(rèn)為該基因在金柑冷脅迫響應(yīng)過(guò)程中起作用。對(duì)MLP2–2基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)MLP2-2 蛋白與豆類Kunitz 蛋白家族蛋白酶抑制劑同源性較高。大部分蕓香科植物中都含有Kunitz 蛋白，該蛋白可以對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白酶活性進(jìn)行調(diào)控[7]，抑制植物內(nèi)源性蛋白活力，阻止蛋白的降解[8]。對(duì)MLP2–2基因的生物信息學(xué)分析也預(yù)示MLP2-2 蛋白與胰蛋白酶存在互作。為驗(yàn)證MLP2-2蛋白在金柑冷脅迫中對(duì)蛋白酶的抑制功能，筆者對(duì)金柑進(jìn)行冷馴化，促使金柑體內(nèi)MLP2–2基因表達(dá)后提取葉片RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cds 序列，以構(gòu)建pBRT7- MLP2-2 過(guò)表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)入Rosetta（DE3）大腸桿菌進(jìn)行工程菌表達(dá)，以獲得目的蛋白MLP2-2；將獲得的純化蛋白添加到正常金柑葉片總蛋白提取液中，以金柑葉片總蛋白降解率的變化來(lái)驗(yàn)證MLP2-2 蛋白對(duì)金柑葉片總蛋白中蛋白酶的抑制作用?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

2 年生金柑苗由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)柑橘改良中心提供；過(guò)表達(dá)載體質(zhì)粒購(gòu)于武漢伯遠(yuǎn)生物科技有限公司；大腸桿菌DH5α 購(gòu)自天根生化公司。

RNA 提取、反轉(zhuǎn)錄、切膠回收和蛋白濃度檢測(cè)等試劑盒均購(gòu)自擎科生物科技有限公司；Rosetta（DE3）大腸桿菌工程菌、Binding buffer、Washing buffer、Elution buffer 均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1MLP2–2基因的生物信息學(xué)分析

運(yùn)用NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）分析MLP2-2 蛋白氨基酸序列和保守結(jié)構(gòu)域；采用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析MLP2-2 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)；利用SWiSS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/）分析MLP2-2 蛋白構(gòu)型等信息。

1.2.2 金柑MLP2–2基因的克隆與載體構(gòu)建

根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)MLP2-2 同源蛋白編碼序列（登錄號(hào)為AB213396.1），全長(zhǎng)672 bp，編碼223 氨基酸殘基，運(yùn)用SnapGene 軟件設(shè)計(jì)其cds 區(qū)域的PCR 引物，上游引物，5'-ATGAAGATTTCATTAGC AACAACAC-3'；下游引物，5'-TTACACAGACGTT GATCTTTCTG-3'。

冷馴化金柑幼苗，提取葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 序列[9]。PCR 擴(kuò)增目的基因，凝膠電泳分離產(chǎn)物，檢測(cè)目的條帶。切膠回收MLP2-2 條帶，經(jīng)北京擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序比對(duì)后侵染DH5α，用含有卡那霉素的抗性培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌，挑選單克隆抗體，用LB 培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增，提取質(zhì)粒。將菌落PCR 產(chǎn)物送往北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.3 MLP2-2 蛋白表達(dá)及檢測(cè)

參照Z(yǔ)HAO 等[10]的方法，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Rosetta （DE3）感受態(tài)細(xì)胞。參照李鎖[11]的方法，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。參考汪家政等[12]的方法，采用鎳柱純化蛋白，采用SDS-PAGE 檢測(cè)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量、蛋白濃度及雜蛋白含量，采用Western Blot 檢測(cè)MLP2-2 蛋白表達(dá)。

1.2.4 金柑蛋白降解率的檢測(cè)

液氮研磨金柑葉片至粉末，取0.5 g 粉末，添加1 mL PBS 緩沖液，冰浴30 min，其間每隔5 min振蕩混勻1 次。4 ℃、20 000 r/min 離心30 min，取上清再次離心，上清液備用。分2 組各取100 μL蛋白提取液，對(duì)照組加入1 μL ddH2O，測(cè)試組加入1 μL MLP2-2 蛋白，25 ℃孵育，分別在10、20、30 h 取樣，使用BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)樣品中的蛋白濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 金柑MLP2-2 基因的結(jié)構(gòu)特征

依據(jù)NCBI 網(wǎng)站對(duì)MLP2–2分析發(fā)現(xiàn)，MLP2-2蛋白的氨基酸序列為：MetKISLATTLSFLILALASN SLLVLGTSSVPEPLLDVNGNKVESTLQYYIVSAI WGAGGGGVSLHGGRNGYCPLDVIQLPSDTQNG IKLTLSPYNNSTIVRESADLNLRFSVLLSGRDYC NEQPLWKVDNYDAASGKWFITTGGLDGHPGAE TLLNWFKLEKIGNFPGTYKIVHCPSVCESCVKLC NNVGRSFEDGVRRLVLVRDDEPAFPVVLIPATER STSV。

對(duì)序列進(jìn)行cds 保守區(qū)段預(yù)測(cè)，結(jié)果（圖1-a）發(fā)現(xiàn)該蛋白存在反應(yīng)位點(diǎn)環(huán)結(jié)構(gòu)，同時(shí)與豆類Kunitz蛋白酶抑制劑同源性較高。

運(yùn)用TMHMM 軟件分析MLP2-2蛋白序列, 結(jié)果（圖1-b）發(fā)現(xiàn)，MLP2-2 蛋白存在2 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)，屬于多次跨膜蛋白。

運(yùn)用SWISS-MODEL 軟件對(duì)MLP2-2 蛋白序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白由2 個(gè)亞基構(gòu)成，與胰蛋白酶抑制劑有同源性（圖1-c）。

圖1 MLP2-2 蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.1 Structure analysis of MLP2-2

2.2 pBRT7-MLP2-2 過(guò)表達(dá)載體

將PCR 產(chǎn)物送樣測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中目的基因一致。將測(cè)序后的MLP2–2基因片段轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pBRT7，構(gòu)建pBRT7-MLP2-2 表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，隨機(jī)挑選18個(gè)陽(yáng)性菌株搖床培養(yǎng)，提取菌液進(jìn)行PCR 鑒定。結(jié)果如圖2 所示，除2、3 號(hào)菌株外，均擴(kuò)增出目的條帶，說(shuō)明其余16 個(gè)菌株均成功轉(zhuǎn)入MLP2–2基因。測(cè)序結(jié)果與MLP2-2 基因序列一致，表明pBRT7-MLP2-2 過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建成功。載體結(jié)構(gòu)如圖3 所示。

圖2 pBRT7-MLP2-2 原核表達(dá)載體的菌落PCR 驗(yàn)證Fig.2 Verification of the pBRT7-MLP2-2 prokaryotic expression vector by colony PCR

圖3 pBRT7-MLP2-2 原核表達(dá)載體圖譜Fig.3 Map of the pBRT7-MLP2-2 prokaryotic expression vector

2.3 MLP2-2 蛋白融合表達(dá)情況

收集菌液，分別對(duì)誘導(dǎo)前總蛋白、20 ℃培養(yǎng)菌上清液、20 ℃培養(yǎng)菌體沉淀、37 ℃培養(yǎng)菌上清液、37 ℃培養(yǎng)菌體沉淀等5 組進(jìn)行SDS-PAGE 蛋白凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)目的蛋白位點(diǎn)和表達(dá)量。如圖4-a所示，目的蛋白主要集中于菌體沉淀中，當(dāng)培養(yǎng)溫度在37 ℃時(shí)，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量較高。

收集菌液沉淀，分別對(duì)孵育流出液、洗雜流出液、洗脫流出液等組分分組處理，制備樣品，進(jìn)行蛋白質(zhì)凝膠電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，孵育流出液和洗雜流出液樣品特異性較低。對(duì)不同濃度洗脫液組分分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)洗脫液中咪唑濃度為500 mmol/L 時(shí)，蛋白樣品特異性強(qiáng)，洗脫效果最好，蛋白濃度最高（圖4-b）。

圖4 His-MLP-2-2 融合蛋白表達(dá)及鎳瓊脂糖親和層析純化SDS-PAGE 分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of the expression of His-MLP-2-2 fusion protein and nickel agarose affinity chromatography of the fusion protein

對(duì)His-MLP-2-2 單獨(dú)進(jìn)行SDS-PAGE 蛋白凝膠電泳，檢驗(yàn)蛋白條帶濃度及雜蛋白含量。結(jié)果（圖5-a）發(fā)現(xiàn)，純化蛋白單一性較強(qiáng)，雜蛋白含量較低，蛋白純化效果較好。

為確定所獲得的純化蛋白為目的蛋白，Western Blot 技術(shù)方法，用TMB 顯色試劑盒顯色。結(jié)果如圖5-b 所示，在對(duì)應(yīng)位置出現(xiàn)明顯目的條帶，證明該蛋白為目的蛋白。

圖5 His-MLP2-2 純化蛋白SDS-PAGE 及Western Blot 分析Fig.5 SDS-PAGE analysis and Western Blot analysis of the final purified His-MLP2-2 protein

2.4 MLP2-2 抑制金柑葉片總蛋白降解的效果

MLP2-2 蛋白對(duì)金柑葉片總蛋白的降解率檢測(cè)結(jié)果（表1）表明，在0～10 h，對(duì)照組和添加MLP2-2蛋白組的降解率差別小，降解率為3.3%～3.7%。至20 h 時(shí)，對(duì)照組金柑蛋白降解率上升，降解率達(dá)6.5%，而添加MLP2-2 蛋白的處理組，其金柑總蛋白降解率基本保持3.4 %左右。至30 h 時(shí)，對(duì)照組金柑葉片總蛋白降解率大幅上升，達(dá)到19.2%，而添加MLP2-2 的處理組的蛋白降解率基本，維持在3.0%左右。說(shuō)明MLP2-2 具有蛋白酶抑制劑活性，能抑制金柑葉片中總蛋白質(zhì)的降解。

表1 金柑蛋白提取液在不同時(shí)間段內(nèi)的總蛋白降解率Table 1 Degradation r ate of tot al protein i n e xtraction fr om kumquat leaves at different times

3 結(jié)論與討論

研究表明，植物的抗凍有“耐受”和“避免”2 種機(jī)制[13-14]。避免凍害類植物以種子的形式越冬或在組織中積累大量的抗凍物質(zhì)，種子干燥后無(wú)法結(jié)冰，從而避免冰凍的危害；耐受凍害類植物既能忍受胞外冰晶的形成，又可避免胞內(nèi)冰晶的形成，在低于胞外冰晶形成的溫度時(shí)，耐受凍害類植物才會(huì)出現(xiàn)凍害。由于耐受凍害類植物一般會(huì)產(chǎn)生抗凍蛋白，可以使冰晶鈍化，細(xì)胞不會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的破損。前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，金柑突然受到冰凍脅迫后，葉片細(xì)胞嚴(yán)重失水，大量的細(xì)胞出現(xiàn)破損，最后死亡；而經(jīng)歷冷馴化的金柑受到冰凍脅迫后，葉片細(xì)胞失水也很嚴(yán)重，大量的細(xì)胞出現(xiàn)破損，但將其轉(zhuǎn)移至溫室后，葉片細(xì)胞得到修復(fù)，植株表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗凍能力。金柑的抗凍表象有別于已知的2 種抗凍機(jī)制，推測(cè)在金柑中存在自身修復(fù)的抗凍機(jī)制。前期的研究也表明，MLP2–2基因在金柑冷馴化過(guò)程中會(huì)特異性表達(dá)。對(duì)冷馴化誘導(dǎo)金柑幼苗表達(dá)MLP2–2基因并克隆得到該基因，生物信息學(xué)研究表明，MLP2–2與豆類Kunitz 蛋白酶抑制劑同源性較高；MLP2-2與胰蛋白酶存在互作。MLP2–2轉(zhuǎn)入大腸桿菌構(gòu)建工程菌，經(jīng)大量表達(dá)獲得目的基因蛋白，經(jīng)抑制蛋白酶活性研究推測(cè)，MLP2-2 是一種Kunitz 蛋白酶抑制劑。雙子葉植物中普遍存在Kunitz 蛋白，Kunitz蛋白能夠調(diào)控蛋白酶的活性, 有效抑制植物內(nèi)源性蛋白活力，避免蛋白質(zhì)過(guò)度降解, 促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡[7]。本研究中，對(duì)金柑蛋白降解率進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)金柑冷馴化過(guò)程中MLP2–2的特異性表達(dá)，抑制了金柑葉片細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶活性，減緩了細(xì)胞內(nèi)功能蛋白的降解，從而維持了細(xì)胞的基本功能，增強(qiáng)了金柑抗冷脅迫能力。至于MLP2-2 蛋白抑制了哪些蛋白酶，保護(hù)了哪些蛋白還需要進(jìn)一步研究。