張 淼， 史新月， 董 娜， 于志軍， 劉敬澤

(河北師范大學 生命科學學院，河北 石家莊 050024)

DNA甲基化是表觀遺傳學的重要研究內(nèi)容和前沿熱點，在生物的生長發(fā)育及環(huán)境響應過程中發(fā)揮著重要作用.其主要通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，將S-腺苷甲硫氨酸的甲基轉(zhuǎn)移到特定堿基上實現(xiàn)化學修飾，發(fā)生位點包括腺嘌呤的N-6位、胞嘧啶的N-4位、鳥嘌呤的N-7位或胞嘧啶的C-5位等[1].該過程可導致基因沉默、組蛋白修飾和磷酸化，某些情況下還可能導致基因激活[2].越來越多的證據(jù)表明，DNA甲基化與許多生物過程密切相關(guān)[3-5].如在結(jié)直腸癌細胞中發(fā)現(xiàn)大量異常的甲基化基因，這些基因的非啟動子區(qū)域甲基化水平總體較低，啟動子區(qū)域甲基化程度明顯較高[6].研究表明，若癌基因的甲基化水平降低或去甲基化可激活其基因表達或?qū)е氯旧w空間的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定；若抑癌基因甲基化水平升高則使其表達下調(diào)或?qū)е翫NA損傷修復受抑制，進而對細胞周期或細胞凋亡等生物學過程產(chǎn)生明顯影響[1].

DNA甲基化在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)座元件失活和基因組印記等過程中發(fā)揮重要作用[7-9]，其通過基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控參與許多基本的生物過程，并可調(diào)控生物對非生物脅迫的響應[9].研究表明，DNA甲基化水平與熱應激、冷應激和光照等環(huán)境因素密切相關(guān)[10-11]，不同個體的DNA甲基化差異可引起表型變異，進而適應不同的環(huán)境[12-16].

昆蟲綱是節(jié)肢動物門乃至動物界最大的類群，其形態(tài)復雜，具有變態(tài)發(fā)育等特有生理過程.DNA甲基化可調(diào)節(jié)昆蟲胚胎發(fā)育、參與基因印記、調(diào)控級型和翅型分化、影響性別決定和介入抗藥性形成等[17]，如DNA甲基化在蜜蜂分化為工蜂和蜂王的過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，將剛孵化的蜜蜂幼蟲DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3基因沉默后，幼蟲可發(fā)育為蜂王[18-19].不同飼養(yǎng)方式導致的散居和群居型的飛蝗Locustamigratoria，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶 1(DNMT1)、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶2(DNMT2)和DNA甲基結(jié)合蛋白存在顯著的表達差異[20].白背飛虱SogatellafurciferaDNA甲基化的含量影響翅發(fā)育，短翅型的DNA甲基化含量(5.81 %)高于長翅型(2.40 %)[21].隨著現(xiàn)代生物學技術(shù)的不斷發(fā)展，有關(guān)DNA甲基化在昆蟲生長發(fā)育及環(huán)境脅迫響應等過程中的功能及調(diào)控機制的研究越來越深入.

1 昆蟲DNA甲基轉(zhuǎn)移酶

DNA甲基化一般發(fā)生在真核基因組的胞嘧啶殘基上，通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)將其轉(zhuǎn)化為5-甲基胞嘧啶(5-mC).哺乳動物具有完善的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)，包括DNMT1,DNMT2和3個DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3(DNMT3A，DNMT3B和DNMT3L)，而昆蟲DNA甲基轉(zhuǎn)移酶僅包括DNMT1,DNMT2,DNMT3A和DNMT3B，目前尚未發(fā)現(xiàn)DNMT3L[22].其中DNMT1為維持性甲基化酶，主要維持先前建立的甲基化模式[23]；DNMT3為從頭合成甲基化酶，即通過從頭合成方式建立新的DNA甲基化[24]；而DNMT2家族為RNA甲基轉(zhuǎn)移酶，具有較弱的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性[23-25].

1.1 昆蟲DNMTs的種類

昆蟲DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的類型及數(shù)量因物種不同而有差異[26].最早是在西方蜜蜂Apismellifera中鑒定到DNMTs(DNMT1，DNMT2和DNMT3)，在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中沒有鑒定到DNMT1和DNMT3[27]，在飛蝗Locustamigratoria中鑒定到DNMT1，DNMT2和DNMT3.家蠶Bombyxmori的BM-DNMT1基因保留了維持甲基化的功能，但他對金屬離子的敏感性不同于哺乳動物DNMT1[22].家蠶、沙漠蝗Schistocercagregaria和赤擬谷盜Triboliumcastaneum等也只存在DNMT1和DNMT2，未鑒定到DNMT3基因[28]，因此推測家蠶和沙漠蝗的甲基化形成和維持機制有可能不同于哺乳動物，其DNMT1可能綜合了哺乳動物DNMT1和DNMT3的功能[11].

對不同昆蟲的DNMTs的種類及數(shù)量進行綜合比較發(fā)現(xiàn)，除造紙胡蜂Polistesdominula和多胚跳小蜂Copidosomafloridanum外，大多數(shù)的膜翅目和全部的半翅目昆蟲都有一套完整的DNA甲基化酶體系(DNMT1，DNMT2和DNMT3)；而在鱗翅目和鞘翅目昆蟲中均沒有發(fā)現(xiàn)DNMT3；雙翅目昆蟲中只發(fā)現(xiàn)了DNMT2，直翅目昆蟲中均檢測到了DNMT1和DNMT2(表1).

表1 不同昆蟲DNMTs的種類及數(shù)量

昆蟲DNMTs的結(jié)構(gòu)具有一定的特殊性.與人的DNMT1相比，在家蠶和蜜蜂中鑒定到的DNMT1的C-端結(jié)構(gòu)相對保守，而N-端結(jié)構(gòu)則存在差異[29].人DNMT1的C-末端催化結(jié)構(gòu)為6個保守的DNA結(jié)合活性基序(motifⅠ，motifⅣ，motifⅥ，motifⅧ，motifⅨ，motifⅩ).其中有2個DNA結(jié)合活性基序(motifⅠ和motifⅩ)折疊構(gòu)成S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)結(jié)合位點；存在于motifⅣ中的脯氨酸和半胱氨酸，可提供甲醇基輔助DNMT1的C-端催化作用[30-31]；人DNMT1的N-末端具有參與細胞內(nèi)定位、催化活性調(diào)節(jié)等功能，其結(jié)構(gòu)包括可結(jié)合DNA甲基化相關(guān)蛋白(DMAP1)的帶電結(jié)構(gòu)域、核定位信號(nuclear localization signal，NLS)、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)結(jié)合位點、復制焦點靶向區(qū)域(replication focus targeting sequence，RFTS)、鋅離子結(jié)合域CXXC以及2個運送DNMT1至復制叉的Polybromo結(jié)構(gòu)域鄰近溴代同源結(jié)構(gòu)域(bromo adjacent homoloy，BAH)[32-36].在昆蟲中，其DNMT1的N-末端結(jié)構(gòu)無DMAP1和PCNA結(jié)合位點以及核定位信號，表明其可能與人DNMT1的作用模式不同[37].與DNMT1相比，DNMT2的C-末端催化區(qū)域更為保守，且其N-末端缺乏可變結(jié)構(gòu)區(qū)域[38].昆蟲的DNMT2在氨基酸長度和結(jié)構(gòu)分布位置都與人的DNMT2最為接近，但研究發(fā)現(xiàn)果蠅DNMT2在C-末端motifⅧ的位置缺乏可結(jié)合DNA和SAM的延伸結(jié)構(gòu)[38].

與DNMT1和DNMT2相比，昆蟲DNMT3的研究尚不深入.不同昆蟲的DNMT3僅C-端的催化區(qū)域相對保守，其他區(qū)域差異較大[37].昆蟲絕大多數(shù)單拷貝的DNMT3僅存在脯氨酸-色氨酸-色氨酸-脯氨酸(proline tryptophan tryptophan proline，PWWP)結(jié)構(gòu)域，而且僅在少數(shù)昆蟲的DNMT3A中發(fā)現(xiàn)了鋅離子結(jié)合域CXXC(ZnD)[31].

1.2 昆蟲DNMTs的功能

昆蟲DNMTs的功能與植物和哺乳動物存在差異.哺乳動物的甲基化主要發(fā)生在CG二核苷酸上，并且由DNMTl和DNMT3A/B催化完成[39]；植物的DNA甲基化在CG和非CG上都有可能發(fā)生，并且由DNMT3A/B的同源蛋白DRMl/2和植物特有的甲基轉(zhuǎn)移酶CMT3催化非CG甲基化，而DNMT1的同源蛋白MET1可維持CG甲基化[40].昆蟲DNMTs與哺乳動物的功能差異主要體現(xiàn)在DNMT2和DNMT3，如果蠅DmDNMT2基因的過量表達可延長果蠅生命周期，因此推測其可能與保證果蠅正常的生命周期有關(guān)[41]，哺乳動物DNMT2又稱天冬氨酸t(yī)RNA甲基轉(zhuǎn)移酶1，與tRNA的甲基修飾密切相關(guān)[42].蜜蜂DNMT3被抑制時，其卵和一齡幼蟲傾向于發(fā)育成蜂王，還會導致參與攝食的重要基因dynactinp62的CG甲基化水平改變，因此DNMT3可能在蜜蜂營養(yǎng)控制等級分化過程中發(fā)揮作用[43].意大利蜜蜂Apismellifera的DNMT3可調(diào)節(jié)基因表達和選擇性剪接.飛蝗的DNMT3則參與了散居型和群居型的行為轉(zhuǎn)變[44].

DNMT1在昆蟲性腺發(fā)生和后代存活中發(fā)揮重要作用[45-46].家蠶丟失了DNMT3的同源基因，而DNMT1優(yōu)先作用于半甲基化的DNA[47]，表明DNMT1在家蠶中主要作為維持性甲基化酶發(fā)揮作用，盡管推測其可能在從頭合成甲基化中也起輔助作用[48].地中海煙粉虱Bemisiatabaci的DNMT1和DNMT3則與熱應激反應有關(guān)[49].

2 昆蟲DNA甲基化模式和水平

在生物體內(nèi)，DNA甲基化主要發(fā)生在3種位點，分別是對稱的CpG和CHG位點以及非對稱的CHH位點(H=C，T或A)[50].植物DNA甲基化主要發(fā)生在核基因組中近著絲粒區(qū)域的轉(zhuǎn)座子、重復序列、基因間隔區(qū)和基因主體等區(qū)域的CpG,CHG和CHH位點[51].脊椎動物DNA甲基化是一種全局性的甲基化模式，即在整個基因組中都會發(fā)生[52].與脊椎動物不同，許多無脊椎動物基因組中的甲基化和非甲基化DNA近乎等量，且呈鑲嵌分布[52].昆蟲的甲基化分布在整個基因組中，但主要集中在昆蟲保守基因區(qū)(內(nèi)含子和外顯子)[53]，且偏好發(fā)生于看家基因、序列保守基因及編碼基因[54-55]，進而使昆蟲廣泛表達的基因甲基化程度明顯高于特異性表達的基因[20].多數(shù)昆蟲甲基化主要發(fā)生在CpG位點，如家蠶CpG甲基化在基因區(qū)中最為豐富，而轉(zhuǎn)座子和啟動子沒有檢測到甲基化[40].在沙漠蝗重復的rDNA和轉(zhuǎn)座子序列中均檢測到DNA甲基化，且群居和散居蝗蟲神經(jīng)中樞的甲基化程度存在明顯差異[55].果蠅的甲基化主要發(fā)生在CpT和CpA處，但其早期基因表達并不通過DNA甲基化調(diào)控，而是受順式調(diào)控元件、非編碼RNA和miRNA以及包括多梳蛋白(pcG)和三胸蛋白復合體(trxG)在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子控制[56].

昆蟲全基因組水平的甲基化程度遠低于哺乳動物，目前大多數(shù)昆蟲的胞嘧啶甲基化水平約為0～1 %，哺乳動物和鳥類的甲基化水平為3 %～10 %，魚類和兩棲動物的甲基化水平約為10 %，植物的DNA甲基化水平高達50 %[22].極少數(shù)昆蟲可能不存在DNA甲基化，如赤擬谷盜成蟲；果蠅DNA甲基化只發(fā)生在胚胎發(fā)育的早期階段，整個基因組的胞嘧啶甲基化水平不到1 %；意大利蜜蜂的胞嘧啶甲基化水平約為0.8 %[28]；約0.11 %的家蠶DNA發(fā)生甲基化[57]；佛羅里達弓背蟻Camponotusfloridanus的基因甲基化率為0.14 %～0.16 %，印度跳蟻Harpegnathossaltator的基因甲基化率為0.11 %～0.12 %[49]；麗蠅蛹集金小蜂Nasoniavitripennis雌成蟲胞嘧啶甲基化率為0.18 %[46]；沙漠蝗成蟲的腦和后胸神經(jīng)節(jié)胞嘧啶甲基化率分別為1.3 %和1.4 %[45].到目前為止，甘藍夜蛾Mamestrabrassicae幼蟲和成蟲組織甲基化水平最高，約為10 %[22].雖然昆蟲的DNA甲基化水平遠低于哺乳動物和植物，但越來越多的研究表明，DNA甲基化在昆蟲中發(fā)揮著非常重要的作用[49].

3 昆蟲DNA甲基化的作用及調(diào)控

昆蟲DNA甲基化參與調(diào)控胚胎發(fā)育、基因組印記、性別決定、表型可塑性、等級分化、社會行為、滯育和殺蟲劑抗性等多種生物學過程.

DNA甲基化在昆蟲胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮作用，如家蠶BmDNMTs在胚胎發(fā)育過程中尤其是在胚胎早期表達量相對較高；在經(jīng)鹽酸處理導致滯育終止的家蠶卵中，BmDNMTs表達水平顯著升高[58].通過KEGG分析表明，甲基化可能通過調(diào)節(jié)細胞分化、代謝、凋亡和磷酸化參與調(diào)控家蠶胚胎發(fā)育[59].通過對G2/M期特異性E3泛素蛋白連接酶(G2E3)進行分析，表明基因甲基化后，磷酸化途徑被激活，從而促進胚胎信號轉(zhuǎn)導、物質(zhì)合成等胚胎發(fā)育過程中的關(guān)鍵活動，推測高甲基化與胚胎滯育有關(guān)，并可能通過抑制細胞周期和細胞凋亡來調(diào)節(jié).這些發(fā)現(xiàn)將有助于揭示在昆蟲早期胚胎發(fā)育和昆蟲滯育過程中DNA甲基化和基因表達之間的潛在聯(lián)系.

DNA甲基化參與昆蟲的表型可塑性.在生物體不同發(fā)育階段，DNA甲基化存在很大差異，會對細胞的轉(zhuǎn)錄表達產(chǎn)生影響，從而影響其表型[60].對于昆蟲來說，DNA甲基化可能會影響其翅型分化、等級分化等重要表型.如不同翅型的白背飛虱的DNA甲基化程度存在差異，表明 DNA甲基化可能參與調(diào)控其翅型分化[21].表觀遺傳機制被認為是生物體連接基因和環(huán)境的橋梁[61].營養(yǎng)是導致蜜蜂等級分化的關(guān)鍵因素[43,61].如蜜蜂的DNMT3基因被沉默后，通常會誘導工蜂發(fā)育為蜂王或蜂王樣成蟲，證明DNA甲基化在蜜蜂等級分化中具有重要作用[43]，也進一步證明幼蟲階段是等級分化的關(guān)鍵期[62].同時甲基化差異可導致保幼激素(JH)響應基因的差異表達，從而影響更多基因表達[63]，進而導致等級分化[64].

DNA甲基化在基因組印記中也發(fā)揮重要作用.基因組印記是表觀遺傳修飾的重要形式，可導致基因或染色體區(qū)域的改變[65].在高度社會化的二倍體有性生殖昆蟲中，其基因組中來自父源和母源的基因之間存在著潛在沖突，其來源就是基因印記并涉及DNA的甲基化.在完全群居的膜翅目昆蟲，基因印記在機體父源基因表達過程中發(fā)揮了重要的作用[66-67].

DNA甲基化在調(diào)控昆蟲性二型過程中發(fā)揮作用.如對桃蚜Myzuspersicae全基因組甲基化模式的研究發(fā)現(xiàn)，雄性和無性雌性之間存在差異基因表達，且CPG甲基化是桃蚜DNA甲基化的主要形式，與其他昆蟲不同的是，在基因外顯子的3′端甲基化程度較高.結(jié)果顯示與無性繁殖的雌性蚜蟲相比，雄性的甲基化程度顯著降低，但值得注意的是，雄性的X染色體基因高度甲基化.鑒于甲基化基因在性別間的表達有顯著差異，Mathers等[68]認為性別偏向基因的差異甲基化在蚜蟲性別分化中起作用.此外，在歐洲熊蜂Bombusimpatiens、桔粉介殼蟲Planococcuscitri、印度跳蟻和佛羅里達弓背蟻等昆蟲中均發(fā)現(xiàn)DNA甲基化模式在雌、雄成蟲間存在明顯不同[21,69-70]，也表明DNA甲基化可能參與性別分化的調(diào)控.

在社會性昆蟲中，DNA甲基化的模式會對其行為可塑性和社會行為產(chǎn)生一定影響，尤其在膜翅目(螞蟻、蜜蜂、黃蜂和葉蜂)中更為突出[71-72].蜜蜂是典型的社會性昆蟲，工蜂和蜂王雖然都是經(jīng)受精卵發(fā)育而來，發(fā)育的最終方向卻有所不同.研究發(fā)現(xiàn)蜂王與工蜂的甲基化模式有很大不同，因此其分化可能是通過特定的DNA甲基化改變實現(xiàn)的.此外，同一蜂巢蜜蜂的分工不同，其DNA甲基化模式也有區(qū)別，如采蜜蜂和保育蜂的DNA甲基化模式存在差異[73].造紙胡蜂作為相對較為原始的社會性昆蟲，在其基因組內(nèi)也發(fā)現(xiàn)存在與其等級分化相關(guān)的特異性甲基化DNA[74].

DNA甲基化參與昆蟲的免疫應答過程.用氮胞苷或地西他濱藥理清除白紋伊蚊Aedesalbopictus的甲基組，蚊子表型無明顯變化，但出現(xiàn)與應對寄生蟲攻擊相似的轉(zhuǎn)錄變化.這種變化具特異性，可導致蚊子感染負荷降低，表明DNA甲基化可能是影響其媒介能力的關(guān)鍵因素[75].家蠶感染胞質(zhì)多角體病毒(BmCPV)后，其中腸和脂肪體中分別存在27個基因的差異表達和差異甲基化，且在被感染的中腸中，G2/M期特異性E3泛素蛋白連接酶樣基因低甲基化，表明DNA甲基化可能在家蠶宿主與病毒的相互作用中起作用[76].

4 昆蟲DNA甲基化的研究方法

隨著基因芯片和高通量測序技術(shù)廣泛應用，DNA甲基化的研究方法得到了快速發(fā)展，為表觀遺傳研究提供了更為有效的手段[77].目前，昆蟲DNA甲基化研究主要通過2種方式進行.一是生物信息學預測，CpG O/E 密度圖已成為當前預測昆蟲中有無DNA甲基化存在的主要依據(jù)[37].基因序列CpG位點的甲基化水平可通過CpG O/E值(標準化的CpG含量)預測，主要利用序列中CpG的頻率與C和G頻率乘積的比值進行計算[37].根據(jù)該物種基因組中所有基因的CpG O/E 值進行聚類所繪制的密度圖[52]可對其基因組DNA甲基化的情況進行預測[5,31,54].二是實驗研究，大致可分為3類[37]：1) 甲基化特異限制性內(nèi)切酶法，(methylation specific restriction enzyme assays，MSRE)主要利用對識別位點甲基化敏感性不同的限制性內(nèi)切酶進行酶切，對基因的DNA甲基化程度做出初步判斷[78]；2) 甲基化敏感擴增多態(tài)性技術(shù)(methylation sensitive amplified polymorphism，MSAP)，利用HpaII+EcoRI 和MspI+EcoRI 兩組酶，對基因組DNA同時進行雙酶切，從而把這個位點的甲基化信息轉(zhuǎn)化為不同的酶切情況，然后與相應的接頭連接，再經(jīng)過2輪PCR獲得條帶多態(tài)性，從而確定基因組DNA甲基化水平[37]；3) 基因組DNA甲基化測序則是根據(jù)目的序列差異，將測序大致分為CpG富集和非富集2種情況，然后先經(jīng)過重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化，再進行測序[37].在該方法中，重亞硫酸鹽的功能是保留甲基化的胞嘧啶，將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化成尿嘧啶，再經(jīng)PCR后轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏?，最后比較基因組序列信息和轉(zhuǎn)化得到的測序信息，從而獲得胞嘧啶甲基化的情況[37].

對比以上3種方法，MSRE法的優(yōu)點是不需要明確靶標DNA的序列，而MSAP的優(yōu)點在于不用獲取物種的基因組信息，即可研究不同處理、不同種群以及不同發(fā)育階段的甲基化模式.基因組DNA甲基化測序的優(yōu)勢在于通過少量樣本可獲得全基因組DNA甲基化信息，進而降低樣本收集難度.由于酶切位點限制，MSRE法則局限在識別特定序列中CpG島的甲基化信息.MSAP的步驟相對繁瑣，同時也無法完全反映全基因組DNA甲基化的程度.基因組DNA甲基化測序則無法反映低甲基化區(qū)域的信息[37].

5 展 望

DNA甲基化是生物重要的表觀遺傳調(diào)控機制，在多種生物學過程中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用.雖然昆蟲DNA甲基化水平遠低于哺乳動物和植物，但越來越多證據(jù)表明，DNA甲基化在昆蟲中發(fā)揮著重要作用.近年來隨著生命科學技術(shù)的不斷發(fā)展，昆蟲DNA甲基化的研究進展迅速，但是與植物和高等動物相比，DNA甲基化在昆蟲中的研究仍有待深入.總體而言，由于昆蟲種類繁多，生活環(huán)境復雜多樣，昆蟲DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的種類和功能、DNA甲基化模式和水平、作用及調(diào)控都具有明顯特異性.因此深入研究昆蟲DNA甲基化在其生長發(fā)育及多種脅迫響應過程中的作用及其調(diào)控，對系統(tǒng)闡明昆蟲的表觀遺傳調(diào)控機制具有重要的理論意義.近年來，科研人員的關(guān)注點逐漸從基因序列分析層面轉(zhuǎn)到表觀遺傳修飾，并且隨著對基因功能研究方法的不斷改進和完善[79]以及高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，表觀遺傳學將在單堿基分辨率的全基因組DNA甲基化基礎(chǔ)上，更多傾向于特定的DNA區(qū)域甲基化與特定表型之間的關(guān)聯(lián)研究，為后續(xù)深入研究昆蟲DNA甲基化功能組學提供依據(jù)；并通過定點表觀遺傳學改造，為明確DNA甲基化在昆蟲重要生物學性狀及其環(huán)境響應過程中的作用及調(diào)控機制研究奠定基礎(chǔ).