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        乳酸鏈球菌素工業(yè)生產(chǎn)過程的穩(wěn)定性研究

        2022-03-08 00:36:30王兆蘭李海軍張英華鄭德強(qiáng)馬雙雙
        食品與藥品 2022年1期
        關(guān)鍵詞:水溶液效價(jià)鏈球菌

        王兆蘭,李海軍,2,3*,王 超,張英華,鄭德強(qiáng),2,3,馬雙雙

        (1.山東福瑞達(dá)生物科技有限公司,山東 臨沂 276700;2.山東福瑞達(dá)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司,山東 濟(jì)南 250000;3.山東省藥學(xué)科學(xué)院,山東 濟(jì)南 250000)

        乳酸鏈球菌素(nisin)是某些乳酸鏈球菌產(chǎn)生的一種活性多肽物質(zhì),對人體安全無毒副作用,是一種安全、綠色、環(huán)保的生物防腐劑。Nisin的穩(wěn)定性易受溫度、pH、基質(zhì)等影響[1],不僅在一定程度上限制了其在食品加工中的應(yīng)用,影響其最終抑菌效果[2],更重要的是在工業(yè)大生產(chǎn)過程中影響產(chǎn)品的最終收率。目前在nisin的工業(yè)生產(chǎn)中,通常利用高溫方式釋放胞內(nèi)nisin,并用鹽酸調(diào)節(jié)其pH值,實(shí)現(xiàn)其提純過程中的穩(wěn)定性。雖然胞內(nèi)nisin通過高溫作用釋放的過程較快,但大工業(yè)生產(chǎn)時(shí)因罐體體積較大,升、降溫過程所需時(shí)間較長,造成nisin在高溫、低pH條件下維持的時(shí)間較長,可能會導(dǎo)致穩(wěn)定性下降[3]。為了提高nisin在工業(yè)生產(chǎn)過程中的穩(wěn)定性,保證最終收率,本研究模擬工業(yè)生產(chǎn)條件,在40~120 ℃條件下考察不同溫度和pH值對nisin穩(wěn)定性的影響,重點(diǎn)研究產(chǎn)品提純過程中使用不同酸對nisin在穩(wěn)定性方面的影響,以優(yōu)化其制備工藝。

        在nisin的檢測方法方面,目前最常用的為瓊脂擴(kuò)散法,此方法不僅受檢測菌活性影響誤差較大,而且檢測周期也較長。本研究針對現(xiàn)有檢測方法的弊端,開發(fā)使用高效液相法檢測產(chǎn)品效價(jià),有效提高產(chǎn)品檢測效率,且準(zhǔn)確度高,樣品不被破壞[4],更能在一定程度上反應(yīng)效價(jià)下降的實(shí)質(zhì)。

        1 儀器與材料

        1.1 儀器

        1260型高效液相色譜儀(安捷倫);Sorvall RC-6型高速冷凍離心機(jī)(Thermo Fisher);Seven Multi S40 pH計(jì)(梅特勒-托利多);ZHJH-C1115B垂直超凈工作臺(上海智城分析儀器制造公司);SHB-III型臺式循環(huán)水式多用抽濾機(jī)(鄭州長城科工貿(mào));LDZF-75KB-II型立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安),HWS26型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒)。

        1.2 材料與試劑

        1.2.1 主要材料 乳酸鏈球菌素成品及半成品(山東福瑞達(dá)生物科技有限公司);檢測菌:黃色微球菌(NCIB8166);S1培養(yǎng)基(青島海博)。

        1.2.2 主要試劑 乙腈(色譜級);三氟乙酸(分析純);鹽酸(分析純);乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma);酵母粉(安琪酵母)、蛋白胨(吳忠市王國旗生物科技);磷酸氫二鈉(科密歐試劑);氯化鈉(科密歐試劑);葡萄糖(諸城東曉生物科技);吐溫20(無錫亞泰聯(lián)合化工)。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 高效液相檢測方法及驗(yàn)證結(jié)果

        2.1.1 色譜條件 色譜柱:Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相(A:90 %乙腈水溶液,三氟乙酸1 ml/L,B:10 %乙腈水溶液,三氟乙酸1 ml/L),洗脫時(shí)間見表1;檢測波長:215 nm;柱溫:30 ℃;流速:1 ml/min;進(jìn)樣量:20 μl。

        表1 乳酸鏈球菌素洗脫時(shí)間表

        2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品處理 標(biāo)準(zhǔn)品處理:精確稱量乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品(效價(jià)約1000 IU/mg)20,40,60,80,100 mg,置入10 ml量瓶,0.02 mol/L鹽酸水溶液定容并充分震蕩溶解。上樣前使用微孔濾膜過濾。

        樣品處理:將編號1~5的樣品分別稱量100,50,50,25,25 mg,置入10 ml量瓶,0.02 mol/L鹽酸水溶液定容并充分震蕩溶解。上樣前使用微孔濾膜過濾。

        2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 按照上述色譜檢測條件和洗脫方法進(jìn)行檢測,以儀器峰面積Y對乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度X(mg/ml)作標(biāo)準(zhǔn)曲線[5]?;貧w方程為Y=303.59X+16.958,相關(guān)系數(shù)r2=0.9992,表明在乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為1~10 mg/ml范圍內(nèi),乳酸鏈球菌素的質(zhì)量濃度與峰面積之間具有良好的線性關(guān)系。

        2.1.4 乳酸鏈球菌素效價(jià)按下式計(jì)算:

        式中:C測:標(biāo)準(zhǔn)曲線測得的樣液中乳酸鏈球菌素的質(zhì)量濃度,單位mg/ml。C稱:所稱樣品的質(zhì)量濃度,單位mg/ml。效價(jià)單位IU/mg。

        2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品色譜圖 分別對乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品和樣品采用同等條件進(jìn)行檢測。見圖1。由圖1可見,乳酸鏈球菌素的色譜峰約在20~21 min之間,能與其他物質(zhì)有效分離。

        圖1 乳酸鏈球菌素高效液相色譜圖

        2.1.6 方法回收率及檢出限 在乳酸鏈球菌素樣品中添加乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品,計(jì)算其加標(biāo)回收率、RSD值及檢出限。由表2可見,樣品加標(biāo)回收率達(dá)91 %以上,RSD值小于5 %,以3倍信噪比計(jì)算檢出限為0.5 mg/ml。

        表2 樣品加標(biāo)回收率

        2.1.7 高效液相法與國標(biāo)瓊脂擴(kuò)散法檢測效價(jià)對比 將編號1~5的樣品分別稱量100,50,50,25,25 mg置入10 ml量瓶,用0.02 mol/L鹽酸水溶液定容并充分震蕩溶解,上樣前使用微孔濾膜過濾;按照上述色譜檢測條件和洗脫方法進(jìn)行檢測,并按照2.1.4項(xiàng)計(jì)算方法進(jìn)行效價(jià)計(jì)算。高效液相法與國標(biāo)瓊脂擴(kuò)散法(參見食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑乳酸鏈球菌素GB 1886.231-2016[6])相比,其相對誤差小于6 %(見表3),與瓊脂擴(kuò)散法相比誤差小于10 %,表明高效液相法可用于乳酸鏈球菌素含量的檢測[7]。

        表3 高效液相法與國標(biāo)瓊脂擴(kuò)散法檢測效價(jià)對比

        2.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果

        2.2.1 Nisin水溶液在不同pH、不同溫度條件下的穩(wěn)定性 將nisin半成品固體溶解成較高效價(jià)的溶液,等分5份,用鹽酸調(diào)pH值分別為2.0,3.0,4.0,5.0和6.0,每份樣品各分為3份密閉分裝,分別置于65,75,85 ℃水浴鍋內(nèi),定期取樣使用高效液相法監(jiān)測其效價(jià)。結(jié)果表明,在pH 2.0(圖2A)和3.0(圖2B)時(shí),65~85 ℃條件下nisin水溶液的效價(jià)變化較小,pH 4.0(圖2C)時(shí),隨著溫度增加,效價(jià)稍有下降;pH 5.0(圖2D)及6.0(圖2E)時(shí),隨著溫度增加,效價(jià)下降趨勢明顯。pH小于3.0時(shí)乳酸鏈球菌素在85 ℃依然穩(wěn)定。

        圖2 不同pH條件下nisin水溶液穩(wěn)定性

        2.2.2 Nisin水溶液在pH 2.0、不同溫度條件下的穩(wěn)定性 因pH2.0時(shí)乳酸鏈球菌素較穩(wěn)定,為了優(yōu)化在工業(yè)生產(chǎn)過程nisin的生產(chǎn)工藝,現(xiàn)將溶液pH調(diào)節(jié)為2.0,于40,60,80,100,120 ℃條件下分別作用20,40,60,80,100 min,用高效液相法檢測其效價(jià)。結(jié)果表明,pH 2.0時(shí)(圖3),溫度低于120 ℃,60 min以內(nèi)nisin比較穩(wěn)定,在120 ℃條件下維持60 min以上時(shí),nisin效價(jià)明顯下降。

        圖3 pH2.0條件下nisin水溶液穩(wěn)定性

        2.2.3 不同酸制備的nisin的穩(wěn)定性 分別使用硫酸、磷酸、鹽酸、乳酸調(diào)節(jié)nisin發(fā)酵液 pH為2.0~2.5,制備其成品粉末,于37 ℃放置,定期取樣使用液相法檢測其效價(jià)。結(jié)果:使用硫酸制備的nisin成品效價(jià)在一個(gè)月內(nèi)下降55 %;使用乳酸和磷酸制備的nisin成品與對照(鹽酸)相比,其穩(wěn)定性明顯提高。在37 ℃條件下放置3個(gè)月效價(jià)分別下降27.2 %和20 %,對照效價(jià)下降36 %(具體數(shù)據(jù)見圖4)。

        圖4 不同酸制備樣品效價(jià)變化趨勢

        2.2.4 Nisin樣品穩(wěn)定性圖譜分析 將同一樣品在37 ℃條件下分別放置1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月后,取少量樣品存放于-20 ℃。3次留樣使用高效液相法進(jìn)行圖譜分析(見圖5)發(fā)現(xiàn):隨著在37 ℃條件下存儲時(shí)間的延長,樣品效價(jià)下降,且目標(biāo)峰(保留時(shí)間22.5 min)之后的雜峰(保留時(shí)間24 min)占比也在相應(yīng)的增加,表明乳酸鏈球菌素在一定條件下其性質(zhì)有所改變,造成其效價(jià)下降。

        圖5 Nisin 37 ℃存儲過程中雜峰變化趨勢

        3 討論

        本文用HPLC法檢測是通過峰面積來表征活性,但因Nisin的活性受結(jié)構(gòu)等諸多因素影響,為防止其在不同溫度和酸堿度條件下因結(jié)構(gòu)改變造成失活但仍出峰正常,在對實(shí)驗(yàn)樣品活性衰減的定期監(jiān)測過程中,同時(shí)使用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行監(jiān)測,兩種方法結(jié)果一致。然而是否在其他特殊情況下出現(xiàn)出峰正常但活性降低的現(xiàn)象還有待進(jìn)一步研究。

        考慮到在工業(yè)大生產(chǎn)過程中nisin溶液的升溫、降溫不能在短時(shí)間內(nèi)精準(zhǔn)實(shí)現(xiàn),所以本文延長了考察時(shí)間并將考察的溫度范圍擴(kuò)大,便于生產(chǎn)借鑒。不同溫度和酸堿度條件下,nisin穩(wěn)定性有較大差異,會直接導(dǎo)致工業(yè)生產(chǎn)過程中產(chǎn)品收率的波動(dòng),通過HPLC快速、準(zhǔn)確地檢測生產(chǎn)過程中nisin的效價(jià),進(jìn)而優(yōu)化其工藝參數(shù)就顯得尤為重要。本研究使用檢測nisin效價(jià)的HPLC前處理步驟簡單,儀器較普遍,不僅效率高、具有良好的可靠性,還能通過降解產(chǎn)物峰在一定程度上直觀的體現(xiàn)其效價(jià)下降的原因[8],可作為瓊脂擴(kuò)散法的良好補(bǔ)充。

        為了更直接觀察到nisin在不同條件下峰面積、效價(jià)的變化,本實(shí)驗(yàn)使用較高效價(jià)的nisin溶液進(jìn)行考察,但帶菌發(fā)酵液高溫釋放nisin的過程同樣可使用本文所用的HPLC方法進(jìn)行監(jiān)測。另外本研究發(fā)現(xiàn),在存儲過程中,使用磷酸、乳酸制備的nisin成品比使用鹽酸制備的nisin成品相對穩(wěn)定,3個(gè)月內(nèi)其穩(wěn)定性分別提高16 %和8.8 %,這也為nisin的工業(yè)生產(chǎn)提供了新的思路,目前研究者們已經(jīng)探討了許多改善其活性的方法[9-10],但同時(shí)考慮到產(chǎn)品生產(chǎn)成本等因素,還需做進(jìn)一步的研究和探索。

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