王兆蘭，李海軍,2,3*，王 超，張英華，鄭德強,2,3，馬雙雙

（1.山東福瑞達生物科技有限公司，山東 臨沂 276700；2.山東福瑞達醫(yī)藥集團有限公司，山東 濟南 250000；3.山東省藥學科學院，山東 濟南 250000）

乳酸鏈球菌素（nisin）是某些乳酸鏈球菌產生的一種活性多肽物質，對人體安全無毒副作用，是一種安全、綠色、環(huán)保的生物防腐劑。Nisin的穩(wěn)定性易受溫度、pH、基質等影響[1]，不僅在一定程度上限制了其在食品加工中的應用，影響其最終抑菌效果[2]，更重要的是在工業(yè)大生產過程中影響產品的最終收率。目前在nisin的工業(yè)生產中，通常利用高溫方式釋放胞內nisin，并用鹽酸調節(jié)其pH值，實現其提純過程中的穩(wěn)定性。雖然胞內nisin通過高溫作用釋放的過程較快，但大工業(yè)生產時因罐體體積較大，升、降溫過程所需時間較長，造成nisin在高溫、低pH條件下維持的時間較長，可能會導致穩(wěn)定性下降[3]。為了提高nisin在工業(yè)生產過程中的穩(wěn)定性，保證最終收率，本研究模擬工業(yè)生產條件，在40～120 ℃條件下考察不同溫度和pH值對nisin穩(wěn)定性的影響，重點研究產品提純過程中使用不同酸對nisin在穩(wěn)定性方面的影響，以優(yōu)化其制備工藝。

在nisin的檢測方法方面，目前最常用的為瓊脂擴散法，此方法不僅受檢測菌活性影響誤差較大，而且檢測周期也較長。本研究針對現有檢測方法的弊端，開發(fā)使用高效液相法檢測產品效價，有效提高產品檢測效率，且準確度高，樣品不被破壞[4]，更能在一定程度上反應效價下降的實質。

1 儀器與材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀（安捷倫）；Sorvall RC-6型高速冷凍離心機（Thermo Fisher）；Seven Multi S40 pH計（梅特勒-托利多）；ZHJH-C1115B垂直超凈工作臺（上海智城分析儀器制造公司）；SHB-III型臺式循環(huán)水式多用抽濾機（鄭州長城科工貿）；LDZF-75KB-II型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安），HWS26型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒）。

1.2 材料與試劑

1.2.1 主要材料 乳酸鏈球菌素成品及半成品（山東福瑞達生物科技有限公司）；檢測菌：黃色微球菌（NCIB8166）；S1培養(yǎng)基（青島海博）。

1.2.2 主要試劑 乙腈（色譜級）；三氟乙酸（分析純）；鹽酸（分析純）；乳酸鏈球菌素標準品（Sigma）；酵母粉（安琪酵母）、蛋白胨（吳忠市王國旗生物科技）；磷酸氫二鈉（科密歐試劑）；氯化鈉（科密歐試劑）；葡萄糖（諸城東曉生物科技）；吐溫20（無錫亞泰聯合化工）。

2 方法與結果

2.1 高效液相檢測方法及驗證結果

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相（A：90 %乙腈水溶液，三氟乙酸1 ml/L，B：10 %乙腈水溶液，三氟乙酸1 ml/L），洗脫時間見表1；檢測波長：215 nm；柱溫：30 ℃；流速：1 ml/min；進樣量：20 μl。

表1 乳酸鏈球菌素洗脫時間表

2.1.2 標準品和樣品處理 標準品處理：精確稱量乳酸鏈球菌素標準品（效價約1000 IU/mg）20，40，60，80，100 mg，置入10 ml量瓶，0.02 mol/L鹽酸水溶液定容并充分震蕩溶解。上樣前使用微孔濾膜過濾。

樣品處理：將編號1～5的樣品分別稱量100，50，50，25，25 mg，置入10 ml量瓶，0.02 mol/L鹽酸水溶液定容并充分震蕩溶解。上樣前使用微孔濾膜過濾。

2.1.3 標準曲線制作 按照上述色譜檢測條件和洗脫方法進行檢測，以儀器峰面積Y對乳酸鏈球菌素標準溶液濃度X（mg/ml）作標準曲線[5]?；貧w方程為Y=303.59X+16.958，相關系數r2=0.9992，表明在乳酸鏈球菌素標準品質量濃度為1～10 mg/ml范圍內，乳酸鏈球菌素的質量濃度與峰面積之間具有良好的線性關系。

2.1.4 乳酸鏈球菌素效價按下式計算：

式中：C測：標準曲線測得的樣液中乳酸鏈球菌素的質量濃度，單位mg/ml。C稱：所稱樣品的質量濃度，單位mg/ml。效價單位IU/mg。

2.1.5 標準品及樣品色譜圖 分別對乳酸鏈球菌素標準品和樣品采用同等條件進行檢測。見圖1。由圖1可見，乳酸鏈球菌素的色譜峰約在20～21 min之間，能與其他物質有效分離。

圖1 乳酸鏈球菌素高效液相色譜圖

2.1.6 方法回收率及檢出限 在乳酸鏈球菌素樣品中添加乳酸鏈球菌素標準品，計算其加標回收率、RSD值及檢出限。由表2可見，樣品加標回收率達91 %以上，RSD值小于5 %，以3倍信噪比計算檢出限為0.5 mg/ml。

表2 樣品加標回收率

2.1.7 高效液相法與國標瓊脂擴散法檢測效價對比 將編號1～5的樣品分別稱量100，50，50，25，25 mg置入10 ml量瓶，用0.02 mol/L鹽酸水溶液定容并充分震蕩溶解，上樣前使用微孔濾膜過濾；按照上述色譜檢測條件和洗脫方法進行檢測，并按照2.1.4項計算方法進行效價計算。高效液相法與國標瓊脂擴散法（參見食品安全國家標準 食品添加劑乳酸鏈球菌素GB 1886.231-2016[6]）相比，其相對誤差小于6 %（見表3），與瓊脂擴散法相比誤差小于10 %，表明高效液相法可用于乳酸鏈球菌素含量的檢測[7]。

表3 高效液相法與國標瓊脂擴散法檢測效價對比

2.2 穩(wěn)定性實驗方法和結果

2.2.1 Nisin水溶液在不同pH、不同溫度條件下的穩(wěn)定性 將nisin半成品固體溶解成較高效價的溶液，等分5份，用鹽酸調pH值分別為2.0，3.0，4.0，5.0和6.0，每份樣品各分為3份密閉分裝，分別置于65，75，85 ℃水浴鍋內，定期取樣使用高效液相法監(jiān)測其效價。結果表明，在pH 2.0（圖2A）和3.0（圖2B）時，65～85 ℃條件下nisin水溶液的效價變化較小，pH 4.0（圖2C）時，隨著溫度增加，效價稍有下降；pH 5.0（圖2D）及6.0（圖2E）時，隨著溫度增加，效價下降趨勢明顯。pH小于3.0時乳酸鏈球菌素在85 ℃依然穩(wěn)定。

圖2 不同pH條件下nisin水溶液穩(wěn)定性

2.2.2 Nisin水溶液在pH 2.0、不同溫度條件下的穩(wěn)定性 因pH2.0時乳酸鏈球菌素較穩(wěn)定，為了優(yōu)化在工業(yè)生產過程nisin的生產工藝，現將溶液pH調節(jié)為2.0，于40，60，80，100，120 ℃條件下分別作用20，40，60，80，100 min，用高效液相法檢測其效價。結果表明，pH 2.0時（圖3），溫度低于120 ℃，60 min以內nisin比較穩(wěn)定，在120 ℃條件下維持60 min以上時，nisin效價明顯下降。

圖3 pH2.0條件下nisin水溶液穩(wěn)定性

2.2.3 不同酸制備的nisin的穩(wěn)定性 分別使用硫酸、磷酸、鹽酸、乳酸調節(jié)nisin發(fā)酵液 pH為2.0～2.5，制備其成品粉末，于37 ℃放置，定期取樣使用液相法檢測其效價。結果：使用硫酸制備的nisin成品效價在一個月內下降55 %；使用乳酸和磷酸制備的nisin成品與對照（鹽酸）相比，其穩(wěn)定性明顯提高。在37 ℃條件下放置3個月效價分別下降27.2 %和20 %，對照效價下降36 %（具體數據見圖4）。

圖4 不同酸制備樣品效價變化趨勢

2.2.4 Nisin樣品穩(wěn)定性圖譜分析 將同一樣品在37 ℃條件下分別放置1個月、2個月、3個月后，取少量樣品存放于-20 ℃。3次留樣使用高效液相法進行圖譜分析（見圖5）發(fā)現：隨著在37 ℃條件下存儲時間的延長，樣品效價下降，且目標峰（保留時間22.5 min）之后的雜峰（保留時間24 min）占比也在相應的增加，表明乳酸鏈球菌素在一定條件下其性質有所改變，造成其效價下降。

圖5 Nisin 37 ℃存儲過程中雜峰變化趨勢

3 討論

本文用HPLC法檢測是通過峰面積來表征活性，但因Nisin的活性受結構等諸多因素影響，為防止其在不同溫度和酸堿度條件下因結構改變造成失活但仍出峰正常，在對實驗樣品活性衰減的定期監(jiān)測過程中，同時使用瓊脂擴散法進行監(jiān)測，兩種方法結果一致。然而是否在其他特殊情況下出現出峰正常但活性降低的現象還有待進一步研究。

考慮到在工業(yè)大生產過程中nisin溶液的升溫、降溫不能在短時間內精準實現，所以本文延長了考察時間并將考察的溫度范圍擴大，便于生產借鑒。不同溫度和酸堿度條件下，nisin穩(wěn)定性有較大差異，會直接導致工業(yè)生產過程中產品收率的波動，通過HPLC快速、準確地檢測生產過程中nisin的效價，進而優(yōu)化其工藝參數就顯得尤為重要。本研究使用檢測nisin效價的HPLC前處理步驟簡單，儀器較普遍，不僅效率高、具有良好的可靠性，還能通過降解產物峰在一定程度上直觀的體現其效價下降的原因[8]，可作為瓊脂擴散法的良好補充。

為了更直接觀察到nisin在不同條件下峰面積、效價的變化，本實驗使用較高效價的nisin溶液進行考察，但帶菌發(fā)酵液高溫釋放nisin的過程同樣可使用本文所用的HPLC方法進行監(jiān)測。另外本研究發(fā)現，在存儲過程中，使用磷酸、乳酸制備的nisin成品比使用鹽酸制備的nisin成品相對穩(wěn)定，3個月內其穩(wěn)定性分別提高16 %和8.8 %，這也為nisin的工業(yè)生產提供了新的思路，目前研究者們已經探討了許多改善其活性的方法[9-10]，但同時考慮到產品生產成本等因素，還需做進一步的研究和探索。