馬昌豪 ,李洪芹,李懷偉
(1.山東省食品藥品審評(píng)查驗(yàn)中心,山東 濟(jì)南 250014 ;2.菏澤學(xué)院,山東 菏澤 274000;3.菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院,山東 菏澤 274000)
咽炎片由玄參、百部(制)、天冬、牡丹皮、麥冬、款冬花(制)、木蝴蝶、地黃、板藍(lán)根、青果、蟬蛻、薄荷油等十二味藥材組成,具有養(yǎng)陰潤(rùn)肺,清熱解毒,清利咽喉,鎮(zhèn)咳止癢等作用,用于治療慢性咽炎引起的咽干,咽癢,刺激性咳嗽,是治療咽炎的常用藥。麥冬為百合科植物麥冬Ophiopogon japonicus(L.f) Ker-Gawl.的干燥塊根,主產(chǎn)于四川、浙江。山麥冬為百合科植物湖北麥冬Liriope spicata(Thunb.)Lour.var.prolifera Y.T.Ma或短葶山麥冬Liriope muscari(Decne.)Baily的干燥塊根,根據(jù)產(chǎn)地不同習(xí)稱湖北麥冬和福建麥冬[1]。麥冬具有養(yǎng)陰生津,潤(rùn)肺清心的功效,麥冬和山麥冬均收載于《中國(guó)藥典》2020年版,兩者功能主治相同,性狀相近,易混用,日常抽檢中發(fā)現(xiàn)有以山麥冬代替麥冬銷售的情況。中醫(yī)傳統(tǒng)用藥習(xí)慣中并不使用山麥冬,湖北麥冬僅作為地方用藥[2-3],同時(shí)研究[4]表明麥冬質(zhì)量?jī)?yōu)于山麥冬,說(shuō)明麥冬和山麥冬不能混用。
咽炎片制劑中存在麥冬摻偽投料的風(fēng)險(xiǎn),應(yīng)建立相關(guān)檢驗(yàn)方法對(duì)山麥冬替代麥冬投料的情況進(jìn)行檢查。參考相關(guān)文獻(xiàn)[5-7]本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜-串聯(lián)電噴霧三重四級(jí)桿質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS),分別以麥冬中的麥冬皂苷D、湖北麥冬中的山麥冬皂苷B、短葶山麥冬中的短葶山麥冬皂苷C為指標(biāo)性成分,建立咽炎片中麥冬投料的檢測(cè)方法,以判斷咽炎片制劑中是否存在以山麥冬替代麥冬投料的情況。
XS-105電子天平(梅特勒公司)、超聲波清洗器(杭州超聲波有限公司)、QTRAP6500高效液相色譜-串聯(lián)電噴霧三重四級(jí)桿質(zhì)譜(AB SCIEX公司)。
麥冬皂苷D(PS180725-04、Stanford Chemicals),麥冬對(duì)照藥材(121013-201711)、湖北麥冬對(duì)照藥材(121136-201803)、山麥冬皂苷B(111907-201103)和短葶山麥冬皂苷C(111908-201102)均來(lái)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純(Merk化工);水為超純水。
麥冬、湖北麥冬、短葶山麥冬分別購(gòu)于安徽亳州中藥材市場(chǎng)、菏澤鄄城舜王城藥材市場(chǎng),經(jīng)菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院馬海春副主任中藥師檢定均為正品。
色譜柱:Innoval ODS-2(2.1 mm×100 mm,3 μm)色譜柱;流動(dòng)相:乙腈-0.1 %甲酸:(75:25);流速0.3 ml/min,柱溫40 ℃,進(jìn)樣量2 μl。
掃描模式為質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM),具體參數(shù)見(jiàn)表1。
表1 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件
2.3.1 對(duì)照品溶液 取麥冬皂苷D、山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C對(duì)照品適量,分別加甲醇制成濃度為500,250,500 ng/ml對(duì)照品溶液。
2.3.2 藥材溶液 取麥冬對(duì)照藥材、湖北麥冬對(duì)照藥材、短葶山麥冬藥材適量,粉碎,分別稱取0.5 g,加甲醇30 ml,超聲處理30 min,濾過(guò),濾液蒸干,殘?jiān)铀?5 ml使溶解,用水飽和的正丁醇提取2次,每次20 ml,合并正丁醇液,蒸干,殘?jiān)蛹状? ml使溶解,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。
2.3.3 供試品溶液 取咽炎片6片,去除糖衣,研細(xì),加甲醇30 ml,超聲處理30 min,濾過(guò),濾液蒸干,殘?jiān)铀?5 ml使溶解,用水飽和的正丁醇提取3次,每次25 ml,合并正丁醇液,蒸干,殘?jiān)蛹状? ml使溶解,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。
2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)樣品及陰性樣品溶液 按照咽炎片處方配料比,制備標(biāo)準(zhǔn)樣品及缺少麥冬的陰性對(duì)照,按照2.3.3項(xiàng)供試品溶液制備方法制成標(biāo)樣溶液及陰性對(duì)照溶液。
取3種對(duì)照品溶液,參照2.1項(xiàng)和2.2項(xiàng)下條件,進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。色譜圖見(jiàn)圖1~圖3。
圖1 麥冬皂苷D MRM總離子流圖
圖2 短葶山麥冬皂苷C MRM總離子流圖
圖3 山麥冬皂苷B MRM總離子流圖
將2.3.2項(xiàng)和2.3.4項(xiàng)下藥材溶液、標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液、陰性樣品溶液在2.1項(xiàng)和2.2項(xiàng)條件下進(jìn)樣,結(jié)果見(jiàn)圖4~圖8。
圖4 麥冬對(duì)照藥材MRM總離子流圖
圖5 湖北麥冬對(duì)照藥材MRM總離子流圖
圖6 短葶山麥冬藥材MRM總離子流圖
圖7 標(biāo)樣溶液MRM總離子流圖
圖8 陰性樣品溶液MRM總離子流圖
由圖可見(jiàn),麥冬、湖北麥冬對(duì)照藥材及短葶山麥冬藥材分別只檢出與麥冬皂苷D、山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C對(duì)照品保留時(shí)間一致的離子峰,母離子及子離子峰均與對(duì)照品一致。標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液僅檢出與麥冬皂苷D對(duì)照品保留時(shí)間一致的離子峰,陰性樣品溶液未檢出與各對(duì)照品相應(yīng)的離子峰。由此判定,制劑中其他組分及輔料對(duì)目標(biāo)成分無(wú)干擾,該方法可準(zhǔn)確判定咽炎片是否存在麥冬摻偽投料。
分別取麥冬皂苷D、山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋,以3倍信噪比為檢測(cè)限,測(cè)定3種對(duì)照品,結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 對(duì)照品檢測(cè)限
依照上述色譜及質(zhì)譜條件,測(cè)定31批次樣品,結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 樣品測(cè)定結(jié)果
由表3可見(jiàn),有23批次樣品僅檢出麥冬皂苷D,未發(fā)現(xiàn)替代投料;有7批次樣品檢出短葶山麥冬皂苷C,表明混有短葶山麥冬投料;有1批次樣品檢出山麥冬皂苷B,表明混有湖北麥冬投料;有1批次樣品檢出山麥冬皂苷B和短葶山麥冬皂苷C,表明同時(shí)混有湖北麥冬和短葶山麥冬投料。
前期研究中采用薄層色譜和液相色譜法檢查,干擾較多,靈敏度難以滿足要求。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)具有靈敏度高,專屬性強(qiáng)的特點(diǎn),在中藥研究中廣泛應(yīng)用[8-12]。根據(jù)3種指標(biāo)性成分化學(xué)結(jié)構(gòu),選用不同的采集模式,其中山麥冬皂苷B在正離子模式下的母離子信號(hào)響應(yīng)較強(qiáng),短葶山麥冬皂苷C和麥冬皂苷D在負(fù)離子模式下的母離子信號(hào)響應(yīng)較強(qiáng)。為提高檢驗(yàn)靈敏度,分別采用正負(fù)離子模式對(duì)3種指標(biāo)性成分進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
現(xiàn)行藥典收錄的麥冬和山麥冬來(lái)源不同,在常規(guī)的性狀鑒別上常難以區(qū)分。在前期調(diào)研中發(fā)現(xiàn),部分農(nóng)戶種植的麥冬種質(zhì)資源存在問(wèn)題,采收后經(jīng)鑒別為山麥冬,相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)的藥材驗(yàn)收人員對(duì)麥冬的鑒別要點(diǎn)認(rèn)識(shí)不足,導(dǎo)致制劑企業(yè)可能存在混用的風(fēng)險(xiǎn)。本試驗(yàn)建立的液質(zhì)聯(lián)用的檢查方法能夠準(zhǔn)確鑒別麥冬、湖北麥冬和短葶山麥冬,可為咽炎片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提供參考。該制劑中麥冬為提取后投料,后續(xù)的研究中將對(duì)麥冬原粉投料的制劑進(jìn)行研究,為含麥冬類制劑的通用檢查方法的建立提供依據(jù)。