劉 維，張桂菊，閆文月，吳正雪

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250011）

肥胖癥是熱量攝入長期超過消耗，體內(nèi)未消耗的熱量以脂肪的形式儲(chǔ)存起來，導(dǎo)致身體脂肪重量超標(biāo)的代謝性疾病。隨著社會(huì)發(fā)展和生活方式改變，肥胖和超重的人群逐年增多。《中國居民營養(yǎng)與慢性病狀況報(bào)告（2020年）》顯示，我國城鄉(xiāng)居民超重肥胖率持續(xù)上升，6～17歲、6歲以下兒童青少年超重肥胖率分別高達(dá)19 %和10.4 %[1]。有研究表明[2]，全球近10 %兒童有肥胖癥的困擾。受家庭結(jié)構(gòu)變化的影響[3]，國內(nèi)肥胖和超重兒童正逐年增加，如不進(jìn)行干預(yù)，兒童肥胖大概率會(huì)持續(xù)到成年，進(jìn)一步誘發(fā)高血壓、糖尿病、高脂血癥、胰島素抵抗、心功能受損、非酒精性脂肪肝等疾病[4]。研究表明，肥胖癥的產(chǎn)生與全身慢性炎癥反應(yīng)[5]、糖耐量異常[6]、腸道菌群[7]、脂肪細(xì)胞的增生與肥大[8]等因素相關(guān)。

中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)《黃帝內(nèi)經(jīng)》對(duì)肥胖進(jìn)行了論述，“人有肥、有膏、有肉”，“肥貴人則膏梁之疾也”。成人肥胖癥的中醫(yī)分型為：（1）胃腑熱盛，（2）脾虛痰濕，（3）脾腎兩虛[9]。通過前期研究[10-12]，我們發(fā)現(xiàn)兒童肥胖與成人病因病機(jī)有相似性，又與成人有所不同，不可簡(jiǎn)單將其視為成人的“縮影”。小兒脾土本不足，加之當(dāng)下長期高糖高脂飲食的飲食結(jié)構(gòu)，肥甘厚味傷脾，脾主運(yùn)化功能失常，痰濁膏脂內(nèi)生，內(nèi)蘊(yùn)易化熱。兒童肥胖以胃熱濕阻、脾虛濕盛證型最為常見，脾腎兩虛證所占比例相對(duì)較少。

黃芪是豆科植物蒙古黃芪和膜莢黃芪的干燥根部，性溫味甘，入肺、脾兩經(jīng)，可益氣升陽固表、利水行滯通痹；黃連是毛茛科植物黃連的干燥根莖，性寒味苦，入心、脾、胃、肝、膽、大腸經(jīng)，可清熱燥濕、瀉火解毒[13]。黃芪與黃連配伍，二者溫寒相宜，補(bǔ)瀉兼施，既能益氣健脾，又能燥濕化痰，與肥胖癥虛實(shí)夾雜的病機(jī)高度契合。本文應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接相關(guān)技術(shù)探討“黃芪-黃連”藥對(duì)治療兒童肥胖癥，以期為臨床廣泛使用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 “黃芪-黃連”活性成分與靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

以“黃芪”“黃連”作為關(guān)鍵詞在“中國中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)”（http://tcmspw.com/tcmsp.php，TCMSP）進(jìn)行搜索，在“Ingredients”界面以口服利用度（oral bioavailability,OB值）≥30 %，類藥性（drug-like，DL值）≥0.18[14]，進(jìn)行ADME（藥代動(dòng)力學(xué)和藥理學(xué)）屬性篩選，篩選出黃芪和黃連的主要活性成分；之后在TCMSP網(wǎng)站的“Related Targets”面篩選出黃芪和黃連的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。篩選結(jié)束后，通過Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫最新版（https://www.uniprot.org）對(duì)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)照規(guī)范，去除非人源基因后，將蛋白質(zhì)靶點(diǎn)對(duì)照為標(biāo)準(zhǔn)基因名稱。

1.2 預(yù)測(cè)兒童肥胖癥相關(guān)基因靶點(diǎn)

通過人類基因數(shù)據(jù)庫（Gene Cards，https://www.genecards.org）和人類孟德爾遺傳基因數(shù)據(jù)庫（OMIM，https://omim.org），以“childhood obesity”作為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，刪除重復(fù)值后，篩選出兒童肥胖癥（childhood obedity）的基因靶點(diǎn)。

1.3 藥物與疾病共同靶點(diǎn)篩選及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過R語言編程，篩選出“黃芪-黃連”藥對(duì)與兒童肥胖癥的共同靶點(diǎn)；將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING平臺(tái)[15]（https://string-db.org），限定種屬為人類（Homosapiens），構(gòu)建出蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）。

1.4 構(gòu)建藥物-化合物-作用靶點(diǎn)-疾病作用網(wǎng)絡(luò)圖

利用Cytoscape3.7.0軟件（http://www.cytoscape.org），對(duì)篩選出的“黃芪-黃連”藥對(duì)中的藥物、化合物、靶點(diǎn)以及疾病之間的相互關(guān)系構(gòu)建可視化互作網(wǎng)絡(luò)圖。其中藥物、化合物、靶點(diǎn)及疾病用“Node”表示，各節(jié)點(diǎn)之間的聯(lián)系用“Edge”表示。

1.5 GO基因生物過程與KEGG通路富集分析

對(duì)核心靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO基因生物過程富集（gene ontology）[16]、KEGG信號(hào)通路富集（kyoto encyclopedia of genes and genomes）[17]分析，此過程使用Bioconductor生物信息軟件包（http://www.bioconductor.org）處理。并對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.6 藥物有效成分和疾病核心靶點(diǎn)分子對(duì)接驗(yàn)證

從TCMSP數(shù)據(jù)庫下載“黃芪-黃連”藥對(duì)中主要活性物質(zhì)的3D結(jié)構(gòu)，以“.mol2”格式保存。PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org)下載核心靶點(diǎn)蛋白的3D結(jié)構(gòu)，以PDB格式保存。利用PyMol軟件去除核心靶點(diǎn)蛋白的水分子及小分子配體，AutoDock軟件對(duì)其加氫，加電荷，對(duì)受體和配體進(jìn)行分子對(duì)接，通過結(jié)合能的數(shù)值評(píng)價(jià)其結(jié)合活性。

2 結(jié)果

2.1 “黃芪-黃連”活性成分與靶點(diǎn)結(jié)果

在TCMSP數(shù)據(jù)庫以O(shè)B≥30 %，DL≥0.18為篩選條件進(jìn)行篩選，檢索到“黃芪-黃連”活性成分67個(gè)（見表1）。通過TCMSP查詢，得到“黃芪-黃連”藥對(duì)的作用靶點(diǎn)共364個(gè)。將得到的主要活性成分利用Uniprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行篩選，找到各自對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化的基因名，刪除無效和重復(fù)靶點(diǎn)后，得到作用靶點(diǎn)109個(gè)。

2.2 兒童肥胖癥的疾病靶點(diǎn)

通過OMIM 和Gene Cards分別獲取兒童肥胖癥靶點(diǎn)112個(gè)、 6541個(gè)，整理后共得到6600個(gè)兒童糖尿病靶點(diǎn)。

2.3 “黃芪-黃連”藥對(duì)治療兒童肥胖癥共同靶點(diǎn)篩選及互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將藥對(duì)主要成分靶點(diǎn)和兒童肥胖癥靶點(diǎn)進(jìn)行類比分析，共得到藥物與疾病共同作用靶點(diǎn)95個(gè)（見表2）。

利用PPI網(wǎng)絡(luò)對(duì)共同作用靶點(diǎn)進(jìn)行分析，得到85個(gè)節(jié)點(diǎn)和350條邊，對(duì)其中蛋白質(zhì)互作頻次最高的30個(gè)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并繪制圖形（見圖1）。

圖1 蛋白頻次條形圖

由圖1可見，“黃芪-黃連”藥對(duì)的中藥成分與絲裂原激活蛋白激酶8（MAPK8）、表皮生長因子受體（EGFR）、白細(xì)胞介素-6（IL6）有較高的生物結(jié)合活性，可作為其治療兒童肥胖癥的潛在靶點(diǎn)。

2.4 藥物-化合物-作用靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

通過cytoscape3.7.0軟件構(gòu)建藥物-化合物-作用靶點(diǎn)-疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共得到135個(gè)節(jié)點(diǎn)（藥對(duì)1個(gè)，疾病1個(gè)，核心活性成分38個(gè)，靶點(diǎn)95個(gè)）和415條線（見圖2）。

圖2 藥物-化合物-作用靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

通過“NetworkAnalyzer”工具進(jìn)行“度值（degree）”分析，選取度值前5的有效成分作為主要活性成分為：quercetin（槲皮素，drgree：73）、kaempferol（山柰酚，drgree：31）、isorhamnetin（異鼠李素，drgree：15）、7-O-methylisomucronulatol（黃芪異黃烷苷，drgree：15）、formononetin（刺芒柄花素，drgree：11）。

2.5 GO基因生物過程富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析

使用GO基因生物過程富集分析，得到106條生物過程， P值從小到大排列，取前20條生物過程可視化（見圖3）。

圖3 GO功能富集分析圖

由圖3可見，protein heterodimerization activity（蛋白質(zhì)異二聚活性）、DNA-binding transcription activator activity,RNA polymerase II-specific（DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性，RNA聚合酶II特異性）、proximal promoter sequence-specific DNA binding（近端啟動(dòng)子序列特異性DNA結(jié)合）、RNA polymerase II proximal promoter sequence-specific DNA binding（RNA聚合酶II近端啟動(dòng)子序列特異性DNA結(jié)合）、chromatin binding（染色質(zhì)結(jié)合）、ubiquitin-like protein ligase binding（泛素樣蛋白連接酶結(jié)合）等生物過程中靶點(diǎn)較為集中。

通過KEGG富集分析，一共得到信號(hào)通路119條，取P值最小的25條信號(hào)通路可視化（見圖4）。

由圖4可見，PI3K/Akt signaling pathway（PI3K/Akt信號(hào)通路）、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection（卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染）、human cytomegalovirus infection（人巨細(xì)胞病毒感染）、MAPK signaling pathway（MAPK信號(hào)通路）等是靶基因主要集中的信號(hào)通路。

圖4 KEGG通路分析

2.6 藥對(duì)主要活性成分和核心蛋白靶點(diǎn)的分子對(duì)接

通過AutoDock1.5.6軟件對(duì)藥對(duì)主要活性成分核心蛋白靶點(diǎn)分別進(jìn)行對(duì)接，對(duì)接結(jié)合能見表3。

表3 藥對(duì)主要活性成分和核心蛋白靶點(diǎn)對(duì)接

其中isorhamnetin（異鼠李素）、formononetin（刺芒柄花素）同絲裂原激活蛋白激酶8（MAPK8）的結(jié)合能＜-5 kcal/mol。表明異鼠李素（isorhamnetin）和刺芒柄花素（formononetin）與MAPK8具有較好的結(jié)合活性[18]。其對(duì)接圖見圖5。

圖5 有效成分分子對(duì)接圖

3 討論

本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接，構(gòu)建了藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)、有效成分分子對(duì)接圖，對(duì)“黃芪-黃連”藥對(duì)治療兒童肥胖的作用機(jī)制進(jìn)行了預(yù)測(cè)。在篩選出的67個(gè)活性成分中，quercetin（槲皮素）、kaempferol（山柰酚）、isorhamnetin（異鼠李素）、7-O-methylisomucronulatol（黃芪異黃烷苷）、formononetin（刺芒柄花素）、hydroxytyrosol（羥基酪醇）、Calycosin（毛蕊異黃酮）等化合物在藥物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用。槲皮素可促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，影響細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的分泌，發(fā)揮抗炎作用[19]。山柰酚通過抑制IKKβ的活化和IκBα的磷酸化來阻止NF-κB（p65）進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，使相關(guān)炎癥介質(zhì)的釋放受影響，抑制肥大細(xì)胞炎癥反應(yīng)；山柰酚還使骨骼肌PI3K/Akt-GLUT信號(hào)通路閾值增高，改善兒童肥胖癥的主要并發(fā)癥胰島素抵抗，起到降低血糖的作用[20-22]。異鼠李素可通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路影響葡萄糖代謝，進(jìn)而改善肥胖[23]。刺芒柄花素可通過調(diào)節(jié)血脂代謝，減少脂肪沉積[24-25]。羥基酪醇可減少氧化應(yīng)激反應(yīng)和抑制NF-κB的機(jī)制調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞基因表達(dá)譜，進(jìn)而減少巨噬細(xì)胞聚集并改善兒童肥胖癥炎癥[26]。毛蕊異黃酮可通過adiponectin-AMPK-eNO途徑影響周圍血管周圍脂肪組織功能[27]。作為藥物的潛在作用成分，如hederagenin（常春藤苷）、berlambine（氧化小檗堿）等，可作為未來藥理學(xué)作用研究的方向。

本次共篩選出95個(gè)共同作用靶點(diǎn)，其中有絲裂原激活蛋白激酶-8（MAPK-8）、表皮生長因子受體（EGFR）、雌激素受體（ESR-1）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGFA）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等為關(guān)鍵靶點(diǎn)。研究表明MAPK-8對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)為表皮生長因子受體（EGFR）、有絲裂原激活蛋白激酶-8（MAPK-8）、雌激素受體（ESR-1）細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過程有影響，進(jìn)而抑制脂肪細(xì)胞分化[28]。EGFR則可以影響細(xì)胞的生長、增殖和分化等生理過程[29]。Khristi等[30]發(fā)現(xiàn)缺失ESR-1的小鼠更易肥胖。IL-6作為炎癥反應(yīng)的主要介質(zhì)，與內(nèi)分泌也有密切關(guān)系。Margareta等[31]發(fā)現(xiàn)人肥大細(xì)胞功能異?？僧a(chǎn)生IL-6。有研究表明[32-34]促進(jìn)新的血管生成有利于健康的脂肪組織擴(kuò)張，并減少脂肪組織炎癥。PDGF/VEGF生長因子家族在血管生成和內(nèi)皮細(xì)胞生長中發(fā)揮著重要作用，可通過ERK、PI3K/Akt通路誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞遷移、抑制凋亡等[35-36]。統(tǒng)上，“黃芪-黃連”藥對(duì)可能通過抑制炎癥反應(yīng)、抵抗細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖、血管生成等主要途徑發(fā)揮作用。

通過GO富集篩選出的“黃芪-黃連”藥對(duì)的106生物過程主要以蛋白質(zhì)異二聚活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性，RNA聚合酶II特異性、近端啟動(dòng)子序列特異性DNA結(jié)合、RNA聚合酶II近端啟動(dòng)子序列特異性DNA結(jié)合、染色質(zhì)結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合等為主。通過KEGG富集篩選出的119條信號(hào)通路中的靶點(diǎn)富集的前幾條通路中，基因數(shù)目主要集中在PI3K/Akt signaling pathway、hepatitis B、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、human cytomegalovirus infection、MAPK signaling pathway等信號(hào)通路。PI3K/Akt通路與代謝關(guān)系密切[37-38]，其廣泛參與和調(diào)節(jié)合成糖原、脂肪、蛋白質(zhì)，細(xì)胞的存活、增殖和代謝的過程[36]。“黃芪-黃連”藥對(duì)的有效成分可通過直接作用于PI3K/Akt通路或通過雌激素受體等靶點(diǎn)激活A(yù)MPK和mTORC2，進(jìn)而激活PI3K/Akt通路調(diào)節(jié)葡萄糖和脂質(zhì)的代謝[39-41]，改善兒童肥胖。

分子對(duì)接顯示，藥對(duì)的主要活性成分同細(xì)胞有絲分裂、抑制炎癥有較好的結(jié)合活性，表明“黃芪-黃連”藥對(duì)通過影響細(xì)胞有絲分裂和抑制炎癥反應(yīng)影響兒童肥胖癥的發(fā)展。

本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的技術(shù)方法，對(duì)“黃芪-黃連”藥對(duì)治療兒童肥胖癥的可能作用機(jī)制進(jìn)行了闡述，對(duì)其潛在的作用成分、作用靶點(diǎn)、關(guān)鍵生物學(xué)過程、關(guān)鍵通路和可能的分子成分進(jìn)行了論述，為今后中醫(yī)藥治療兒童肥胖癥的研究提供思路。