謝佳慧， 文 藝， 王 艦， 徐 俊

(同濟大學醫(yī)學院，上海 200092)

外泌體是一種由真核細胞分泌的直徑40～150 nm、密度1.13～1.19 g/mL的囊泡結(jié)構(gòu)[1]，表面富含膽固醇、神經(jīng)鞘磷脂、神經(jīng)酰胺等脂類物質(zhì)[2]，膜內(nèi)包含著多種生物活性成分和細胞信號分子，如蛋白質(zhì)、多肽、脂類及mRNA、microRNA、miRNA、DNA等[3]。外泌體作為細胞間信息交流的重要載體[4]，可攜帶內(nèi)容物靶向投遞至特定的部位釋放，在介導微環(huán)境中細胞間信號和物質(zhì)交流上起重要作用[5]，且不同來源、不同環(huán)境下發(fā)揮作用不同，為疾病診治、組織修復治療提供了新思路[6]。目前，對于外泌體的研究幾乎涉及全部機體組織，其中基礎(chǔ)領(lǐng)域中對脂肪干細胞和腫瘤細胞的外泌體功能及相關(guān)作用機制的研究更是近年來熱點之一[7]。

脂肪干細胞來源豐富，便于獲取和操作，分泌外泌體能力強且脂肪干細胞外泌體(adipose-derived stem cells-derived exosomes, ADSCs-Exos)功能眾多[8]，它能通過細胞分化、周期調(diào)控、炎癥趨化等相關(guān)因子影響或改變受體細胞行為，參與機體內(nèi)多種生理進程，如細胞增殖、分化、遷移、凋亡以及損傷修復與再生、血管生成、抗炎反應(yīng)、免疫應(yīng)答等[9]，有很好的研究前景[10]。腫瘤細胞來源的外泌體(tumor-derived exosomes, TEX)既有抑制宿主免疫應(yīng)答[11]，促進腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，在一定條件下又能夠起到抗腫瘤免疫作用，因其雙重性，探索TEX對免疫應(yīng)答作用及其相關(guān)機制在腫瘤診斷及治療中具有重要意義[12]。研究指出干細胞和腫瘤細胞均能分泌大量外泌體，因此研究它們的旁分泌作用對干細胞的轉(zhuǎn)化及腫瘤的治療具有重要的意義。

然而，目前的用于外泌體研究的細胞培養(yǎng)體系中通常需要添加胎牛血清，而血清中帶有大量的牛外泌體，會對后續(xù)提取細胞上清液中的細胞源外泌體的研究產(chǎn)生較強的干擾作用[13]；一些研究中會選擇采用無血清培養(yǎng)法避免干擾，但往往會對細胞活力以及其外泌體效應(yīng)產(chǎn)生很大影響，所以在一些高質(zhì)量的研究中，更傾向于使用含有去除外泌體的血清培液來培養(yǎng)細胞。目前外泌體分離的方法有很多種，但暫時還沒有理想且統(tǒng)一的標準。本研究使用的去除血清外泌體的超離法建立在已有文章報道[14-15]，并研究了其對ADSCs和腫瘤細胞的影響，為獲得理想細胞源外泌體提供可行方法。

1 材料與方法

1.1 材料

原代脂肪干細胞來源于上海美立方醫(yī)療美容醫(yī)院抽脂提取的脂肪組織，且原代脂肪干細胞已完成檢驗鑒定工作。腫瘤細胞為購買自中國科學院細胞庫的胃癌細胞MGC803。

DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，F(xiàn)BS購自澳洲Moregate公司，無外泌體血清購自美國SBI公司，CCK-8試劑盒、細胞凋亡試劑盒、衰老β-Gal半乳糖苷酶染色試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)有限公司,細胞周期試劑盒購自美國BD公司，Alix抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，CD63抗體購自美國圣克魯斯生物技術(shù)公司，TSG101抗體和Actin抗體購自英國Abcam公司，山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG購自美國Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 超離法去除血清外泌體 將FBS分裝到超速離心管中離心(離心半徑88 cm，34 800 r/min，18 h)，使用移液器從上方貼著液面小心吸取上清液，避免擾動底部的沉淀，收集80%左右的上清液，轉(zhuǎn)移到50 mL離心管，混勻后使用0.45 μm的濾器過濾，即可得到無菌的Exo-Free FBS。處理后的Exo-Free FBS可以凍存于-20 ℃。

1.2.2 對比不同血清中外泌體的含量 提取兩種不同血清中外泌體，使用RIPA裂解液裂解外泌體，BCA法測定蛋白濃度，根據(jù)測定的外泌體濃度以每孔上樣15 μg計算每孔上樣量。然后加入1/4體積的5×上樣緩沖液與外泌體混合，放入蛋白煮樣器100 ℃進行蛋白變性10 min，結(jié)束后立即放在冰上待用。使用上海雅酶PAGE凝膠快速制備試劑盒(10%)制備SDS-PAGE凝膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜。用TBST清洗5 min后，放入5%牛奶中，搖床上振蕩封閉2 h。Alix(E6P9B，Rabbit mAb),TSG101(ab125011),CD63(MX-49.129.5)以及Actin(ab8226)抗體孵育過夜，洗膜，接著分別加入對應(yīng)二抗Goat anti-mouse IgG(H+L), HRP conjugate，SA00001-1和Goat anti-rabbit IgG(H+L), HRP conjugate，SA00001-2，室溫孵育2 h。

1.2.3 脂肪干細胞的分離培養(yǎng) 將脂肪組織剪碎，加入0.15%的Ⅰ型膠原酶，37 ℃消化45 min；將懸液離心(離心半徑88 cm,800 r/min,5 min)，即獲得P0代細胞，將細胞接種于含有90% DMEM/F12、10% FBS、10 ng/mL成纖維細胞生長因子(b-FGF)和1%青霉素-鏈霉素雙抗的培養(yǎng)基中,37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),隔天換液，長至80%～90%匯合度時傳代，加0.25%胰酶消化3 min，離心(離心半徑13.5 cm，1 000 r/min，5 min)收集細胞，接種至新鮮培養(yǎng)基中。從P1代開始分成實驗組和對照組，實驗組用10%去外泌體血清(Exo-Free FBS)代替FBS，選取P4代細胞和P6代細胞作為實驗材料。

1.2.4 腫瘤細胞的培養(yǎng) 購買自中國科學院細胞庫的胃癌細胞MGC803，使用90% RPMI-1640和10% FBS配制培養(yǎng)基,培養(yǎng)傳代從P1代開始分成實驗組和對照組，實驗組用10% Exo-Free FBS代替FBS，選取P4代細胞和P6代細胞作為實驗材料。

1.2.5 細胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8)分析 將細胞以5×103/孔鋪至96孔板中，每隔24 h向一組的3個復孔中添加10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h。使用酶標儀測量在450 nm處吸光度(A450)，A450代表細胞活力。持續(xù)檢測6 d繪制生長曲線。

1.2.6 細胞衰老分析 用SA-β-Gal染色試劑盒測定細胞衰老，按照試劑盒說明書進行染色，用光學顯微鏡隨機捕獲多個不同視野的細胞并計數(shù)，計算藍色陽性細胞的比例。

1.2.7 細胞周期分析 6孔板接種106/孔細胞，取對數(shù)生長期的細胞，PBS清洗3次，細胞消化后用PBS清洗3次，用0.5 mL的PBS將細胞重懸，再加入1.5 mL預冷的無水乙醇混勻細胞，懸液放置-20 ℃固定12 h以上。PBS清洗3次，去除乙醇，加入300 μL碘化丙啶染色液，室溫避光染色15 min，使用濾網(wǎng)過濾，流式細胞分析儀上機檢測。Modfit軟件分析各時期細胞情況。

1.2.8 細胞凋亡分析 6孔板接種細胞106/孔培養(yǎng)細胞48 h后，PBS洗滌消化細胞，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)離心(離心半徑13.5 cm，1 000 r/min，5 min)，棄上清液，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數(shù)。取(5～10)×104細胞重懸離心(離心半徑13.5 cm，1 000 r/min，5 min)，棄上清液，加入195 μL Annexin Ⅴ-FITC結(jié)合液輕輕重懸細胞，加5 μL Annexin Ⅴ-FITC，輕輕混勻，加入10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻。室溫避光孵育20 min，隨后置于冰浴中，1 h內(nèi)流式細胞儀檢測。FlowJo軟件分析凋亡細胞比例。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計，采用t檢驗法分析比較組間差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，每個實驗組均重復3次以上。

2 結(jié) 果

2.1 不同類型培養(yǎng)方法對ADSCs細胞活力的影響

比較不同培養(yǎng)方法: 饑餓培養(yǎng)法(Hungry組)、購買的無外泌體血清培養(yǎng)法(SBI Exo-Free組)、超離去除外泌體血清培養(yǎng)法(Exo-Free組)及正常血清培養(yǎng)法(Control組)對ADSCs細胞活力的檢測。配置培養(yǎng)基培養(yǎng)ADSCs，48 h后CCK-8法對細胞活力進行檢測，結(jié)果顯示，饑餓培養(yǎng)的ADSCs活力顯著性降低(P<0.000 1)，兩個去外泌體血清組的細胞活力均明顯降低(P<0.01),其中購買的去外泌體血清與超離法去外泌體的血清之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖1。

圖1 不同類型培養(yǎng)基中ADSCs增殖情況Fig.1 Proliferation of ADSCs in different medium**P<0.01,****P<0.000 1

2.2 去除外泌體的效果

應(yīng)用超離法去除血清外泌體，利用Western印跡法檢測control組，以及Exo-Free組，典型外泌體蛋白標記Alix，TSG101，CD63以及骨架蛋白Actin，結(jié)果清晰表明，超離法能高效去除血清外泌體，見圖2。

圖2 Western印跡法檢測蛋白表達Fig.2 Protein expression was detected by Western blotting

2.3 去外泌體血清對ADSCs和MGC803細胞的增殖情況

應(yīng)用CCK-8法對Exo-Free組Control組的ADSCs和MGC803進行檢測，結(jié)果表明Exo-Free組的ADSCs增殖速度較Conrol組會有一定程度的減慢，且培養(yǎng)時間越長細胞數(shù)量差距越大。腫瘤細胞MGC803的增殖則不受影響，見圖3。

圖3 ADSCs和MGC803的增殖情況Fig.3 The proliferation of ADSCs and gastric cancer MGC803 cells*P<0.05,**P<0.01,****P<0.000 1;P4: P4代細胞，P6: P6代細胞

2.4 ADSCs和MGC803的衰老情況

應(yīng)用SA-β-Gal染色法對Exo-Free組和Control組的ADSCs和MGC803進行染色，隨機選取10個以上視野,將陽性藍色細胞計數(shù)并統(tǒng)計衰老細胞的比例。Exo-Free組的ADSCs和Exo-Free組的MGC803的衰老細胞比例均無明顯變化，見圖4、5。

圖4 ADSCs的SA-β-Gal染色(標尺200 μm)Fig.4 SA-β-Gal staining of ADSCs(scale bar 200 μm)

圖5 MGC803的SA-β-Gal染色圖片(標尺200 μm)Fig.5 SA-β-Gal staining of MGC803 cells(scale bar 200 μm)

2.5 ADSCs和MGC803的細胞周期情況

用細胞周期檢測試劑盒，對固定的對數(shù)期細胞進行染色，流式細胞分析儀檢測，并分析各時期細胞比例，結(jié)果顯示Exo-Free組與Control組ADSCs的S期比例差異無統(tǒng)計學意義，見圖6。Exo-Free組MGC803的S期比例略微的低于Control組，但其差異無統(tǒng)計學意義(P>1)，可以認為對細胞周期變化無影響，見圖7。

圖6 ADSCs的細胞周期流式圖Fig.6 Cell cycle flowcytometry diagram of ADSCs

圖7 MGC803的細胞周期流式圖Fig.7 Cell cycle flowcytometry diagram of MGC803 cells

2.6 ADSCs和MGC803的細胞凋亡情況

用細胞凋亡檢測試劑盒，對細胞進行染色，流式細胞分析儀對細胞進行檢測，分析凋亡細胞比例。結(jié)果顯示Exo-Free FBS的使用對ADSCs的早期凋亡不產(chǎn)生影響，但對晚期凋亡比例產(chǎn)生了顯著性影響，P4和P6代一致顯示Exo-Free FBS組的晚期凋亡比例上升，見圖8；MGC803的實驗組與對照組之間無論早期凋亡還是晚期凋亡差異均無統(tǒng)計學意義，見圖9。結(jié)果表明超離法獲得的去外泌體血清對細胞的早期凋亡無影響，對MGC803的晚期凋亡無影響。

圖8 ADSCs的細胞凋亡流式圖Fig.8 Cell apoptosis flow cytometry diagram of ADSCs**P<0.01,***P<0.001

圖9 MGC803的細胞凋亡流式圖Fig.9 Cell apoptosis flowcytometry diagram of MGC803 cells

3 討 論

外泌體攜帶大量特異性的蛋白質(zhì)以及功能性生物活性物質(zhì)，在體內(nèi)參與細胞通信、細胞遷移、促血管新生和抗腫瘤免疫等生理過程，與多種疾病的發(fā)生和進程密切相關(guān)[16]。由于外泌體的特殊結(jié)構(gòu)和功能，使它具有潛在的應(yīng)用價值，一方面作為診斷多種疾病的生物指標，另一方面也可以作為治療手段，未來作為藥物的天然載體用于臨床治療[17]，已成為再生醫(yī)學領(lǐng)域無細胞治療的理想解決方案[18]。

ADSCs-Exos的研究是近年來熱點之一，ADSCs-Exos可以促進內(nèi)皮細胞增殖和遷移，促使血管生成[19]，且具有良好的耐受性，能降低細胞治療帶來的免疫排斥反應(yīng)的問題[20]，并且能解決干細胞移植的存活率低、致瘤風險等問題[21]，在皮膚損傷修復，神經(jīng)退行性疾病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療，腫瘤診治等多種領(lǐng)域扮演著重要角色[22]，但目前對于ADSCs-Exos的生物成分、功能以及發(fā)揮作用的機制仍存在很多未知，需要繼續(xù)深入研究[23]。TEX的相關(guān)研究領(lǐng)域也是備受關(guān)注，TEX參與腫瘤微環(huán)境中細胞之間的信息傳遞[24]，在癌細胞的生長、遷移、侵襲等過程中發(fā)揮重要作用[25]，而且TEX在介導腫瘤微環(huán)境的過程中機制復雜，呈現(xiàn)一定的雙重性，一方面通過抑制宿主免疫應(yīng)答，促進腫瘤轉(zhuǎn)移[26]，在另一些特定條件下又起到抗腫瘤免疫作用[27]。因此，對不同條件下TEX的成分以及信號傳遞分子機制的研究，有望了解腫瘤免疫相關(guān)機制并開發(fā)腫瘤標志新型分子靶點[28]，為腫瘤早期診斷以及預后判斷提供了新的方向[29]。

然而在研究某種特定的細胞分泌的外泌體時，通常需要提取細胞上清液，而在細胞培養(yǎng)過程中對于大多數(shù)細胞來說，標準培養(yǎng)基須在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中外加FBS作為生長添加物。常用的FBS含有大量的牛源外泌體，這些外泌體含有牛相關(guān)蛋白質(zhì)或miRNA等分子，對于相關(guān)細胞自身分泌外泌體的提取和研究，牛血清中的外泌體可能會造成嚴重的背景問題，從而影響或干擾結(jié)果的判斷。一些研究中直接選擇采用無血清培養(yǎng)法，但饑餓培養(yǎng)法往往對細胞活力影響巨大，所以在一些高質(zhì)量的文獻中[30-34]研究者更傾向于使用含有去除外泌體的血清培液來培養(yǎng)細胞，收集上清液分離細胞外泌體。因此通過適當?shù)姆蛛x技術(shù)獲得去除外泌體的血清，排除血清中外源干擾獲得純凈的細胞源外泌體樣本是必要的。

市面上已存在一些商業(yè)化的無外泌體血清產(chǎn)品，但這些產(chǎn)品不僅價格昂貴并且可能對不同細胞的生長情況造成一定的影響[35]。本研究使用的去除血清外泌體的超離法，即離心(半徑88 cm，34 800 r/min，18 h)取上層約80%的上清液后0.45 μm濾器過濾，是建立在已有文章報道基礎(chǔ)上[14-15]。此方法使用的設(shè)備簡單，操作步驟較少容易實現(xiàn)，Western印跡法結(jié)果顯示去除外泌體的效率極為可觀。一次操作可獲取200 mL左右的去除外泌體血清,凍存后可供后續(xù)使用，與購買的無外泌體血清商品其高達2 500元(50 mL)的費用相比，在大量科研工作的進行過程中操作可行具有經(jīng)濟優(yōu)勢。為研究超離方法獲得的去外泌體血清在細胞生長過程中是否會產(chǎn)生影響，本次選擇了外泌體研究領(lǐng)域較為關(guān)注的兩種細胞進行了研究。在ADSCs中，超離法獲得的去外泌體血清對增殖的影響比購買的無血清外泌體小，且其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，說明超離法比商品化獲得的無外泌體血清更適用于ADSCs的培養(yǎng)。接著，為了驗證超離法獲得的去外泌體血清對細胞生長狀況的影響，將去除外泌體的血清作為實驗組(Exo-Free組)配制培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞與對照組進行對比，在ADSCs中結(jié)果顯示，ADSCs的增殖速度會因血清外泌體的去除顯著降低，細胞數(shù)量差異呈現(xiàn)隨生長時間增加的累積效果，P4代顯示P<0.01,P6代達到P<0.000 1；在細胞周期和細胞衰老的分析中，Exo-Free組均無明顯變化；在細胞凋亡方面，Exo-Free組的ADSCs的早期凋亡無顯著性差異，Exo-Free組的晚期凋亡比例有顯著性升高，具體原因需要進一步探索?？傮w來說，可以認為超離法去除的外泌體對ADSCs的生長狀況并無明顯影響。在腫瘤細胞MGC803中結(jié)果顯示，超離法去除血清外泌體對細胞增殖、衰老和凋亡均不產(chǎn)生影響，Exo-Free組的S期細胞比例有一定的變化，但差異無統(tǒng)計學意義。綜上所述，超離法可以有效去除血清外泌體對細胞外泌體研究的干擾且對ADSCs和腫瘤細胞MGC803的活性不產(chǎn)生影響。特別是在對血清的要求比較高的干細胞上，商品化去外泌體血清可能不適合干細胞生長，改變細胞培養(yǎng)基條件可能會影響干細胞的生物學活性及干細胞外泌體的效應(yīng)。本團隊認為完全可以使用本研究中的超離方法自行制備去外泌體血清，即解決血清外泌體的干擾問題又有一定經(jīng)濟價值。本研究為外泌體研究中的細胞培養(yǎng)用去外泌體血清的獲取提供了新的思路與策略，在饑餓培養(yǎng)和購買昂貴的商業(yè)化去外泌體血清找到了平衡點。

本研究中討論的方法仍存在一些局限性，目前僅針對外泌體的分離去除的應(yīng)用進行驗證，超離法是否也適合對細胞培養(yǎng)液上清液中目標外泌體的提取，是否可以保證外泌體提取過程中不被破壞，在未來的研究中，可以進一步在高分辨率顯微鏡下觀察分離后的外泌體的形態(tài)是否完整，并將分離的外泌體使用到機制研究中，去驗證提取的外泌體是否保持活性且具備相應(yīng)的功能。未來繼續(xù)改進現(xiàn)有的方法，得到理想的外泌體提取技術(shù)，并建立統(tǒng)一的操作體系，探索、開發(fā)及優(yōu)化獲得質(zhì)量均一、能大規(guī)模生產(chǎn)和存儲的外泌體的相關(guān)技術(shù)，將為外泌體研究進展和臨床的應(yīng)用提供技術(shù)基礎(chǔ)。