焦雨帆， 劉飛萍，2， 傅夏燕， 陳其臻， 紀亞忠， 王炎秋

(1. 同濟大學附屬同濟醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，上海 200065； 2. 上海市嘉定區(qū)婦幼保健院，上海 201821)

凍融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer, FET)技術因其具有提高累積妊娠率、降低卵巢過度刺激綜合征發(fā)生率、增加子宮內膜容受性等優(yōu)點，已成為人類輔助生殖技術的重要組成部分。FET的成功與否與多種因素有關，如年齡、胚胎質量、子宮內膜容受性等，而子宮內膜的準備是其中關鍵環(huán)節(jié)，目前最佳子宮內膜準備方案尚無共識。國內外已將多種子宮內膜準備方案應用于臨床，分別為自然周期(natural cycle, NC)方案，激素替代周期(hormone replacement cycle, HRT)方案以及促性腺激素釋放激素激動劑聯合激素替代周期(gonadotropin releasing hormone agonist plus hormone replacement cycle, GnRHa+HRT)方案。本研究通過比較以上3種內膜準備方案，探討何種方案可使FET的患者取得更好的妊娠結局，以期為臨床工作提供參考意見。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2016年7月1日—2018年12月31日至同濟大學附屬同濟醫(yī)院生殖醫(yī)學中心行卵裂期胚胎FET的患者資料，進行回顧性分析。納入標準: 年齡25～34歲；移植2枚胚胎，其中至少移植1枚優(yōu)質胚胎；行FET操作；不孕類型為原發(fā)不孕或繼發(fā)不孕；無嚴重器質性或免疫性疾病者。排除標準: 存在嚴重子宮畸形；黏膜下子宮肌瘤或肌瘤較大嚴重影響子宮腔形態(tài)；子宮腺肌癥(Ⅳ期)；子宮內膜增生、息肉；凍融周期行囊胚移植者；輸卵管積液；免疫因素流產患者；雙方或者其中一方存在染色體異常者；多囊卵巢綜合征患者，資料不全者。

1.2 方法

回顧性分析2016年7月1日—2018年12月31日在同濟大學附屬同濟醫(yī)院生殖醫(yī)學中心進行的605個FET周期患者的臨床資料及胚胎實驗室數據。入選標準為NC、HRT或GnRha+HRT周期。所有納入研究的患者胚胎冷凍均采用玻璃化冷凍技術，移植前行宮腔鏡檢查排除子宮內膜病變、宮腔粘連等。胚胎移植后12 d測血β-hCG以判斷生化妊娠；妊娠者則于移植后30～35 d行陰道超聲檢查以明確孕囊位置、孕囊個數、心管搏動，及是否為異位妊娠；隨訪并記錄患者持續(xù)妊娠情況、分娩及新生兒情況。

1.2.1 超聲測量方法 采用三維能量多普勒超聲顯像儀(美國GE公司，Voluson E10型)，對所有患者均由同一醫(yī)師在內膜轉化日行經陰道超聲監(jiān)測，采用儀器內預定義設置的能量多普勒值對子宮內膜進行120°慢掃: 屏幕顯示最完整的子宮內膜線時測量內膜厚度。應用多平面成像模型描記子宮內膜軌跡，按照30°旋轉切面，手動描記子宮內膜切面軌跡，通過計算機輔助分析成像程序(virtual organ computer-aided analysis, VOCAL)自動生成子宮內膜容積。于子宮頸、體部兩側探查，顯示子宮動脈清晰、規(guī)則的脈沖多普勒血流頻譜，觀察并測定子宮動脈PI、RI、S/D值，每項指標測量3次，取其平均值。

1.2.2 自然周期 在月經周期第12天左右開始行B超監(jiān)測卵泡，同時測定外周血中女性激素，評估卵泡及內膜發(fā)育情況，確定排卵時間，排卵后口服地屈孕酮片(商品名稱: 達芙通)30 mg/d。當B超提示內膜厚度(endometrial thickness, Em)≥8 mm、卵泡直徑為18～20 mm，且雌二醇(estradiol, E2)≥650 pmol/L，于排卵后3 d行卵裂期胚胎移植。

1.2.3 激素替代周期 在月經周期第2～5天起口服戊酸雌二醇(商品名稱: 補佳樂)2～4 mg/d或芬嗎通(17-β雌二醇片)紅片2～4 mg/d，每隔3～5 d予B超監(jiān)測內膜厚度。當Em≥8 mm，E2水平≥650 pmol/L且孕酮(P)<5.0 nmol/L時加用孕激素轉化內膜，予以黃體酮針20～40 mg/d肌內注射或雪諾酮90 mg/d陰道內給藥，并口服地屈孕酮片30 mg/d。

1.2.4 促性腺激素釋放激素激動劑聯合激素替代周期 對于排卵者于排卵后3～5 d后行垂體降調，并給予黃體酮類藥物協(xié)助內膜轉化；對于無排卵或卵泡不破裂黃素化者，予人工周期，同時監(jiān)測內膜變化，在使用黃體酮類藥物轉化內膜的第3～5天予降調。使用貝依(通用名稱為注射用醋酸亮丙瑞林微球，3.75 mg/支，長效GnRHa)，皮下注射，降調成功后予激素替代方案，黃體支持同HRT周期。

1.3 觀察指標

(1) 3組不同周期患者基本資料: 年齡、不孕年限、不孕類型、體質量指數(BMI)、移植凍胚級別等；(2) 在內膜轉化日行陰道三維超聲測量子宮內膜厚度、子宮內膜容積、子宮動脈PI、RI、S/D值；(3) 臨床妊娠結局: 臨床妊娠率、活產率、早產率、足月產率、早期流產率、晚期流產率、異位妊娠率等。

1.4 妊娠結局

臨床妊娠指凍胚移植后5周超聲掃描見孕囊回聲和原始心管搏動。早產定義為妊娠滿28周至不滿37周間分娩；足月產定義為妊娠滿37周至不滿42周間分娩。早期流產指妊娠12周前妊娠終止，晚期流產為妊娠12周至不滿28周間妊娠終止。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 不同子宮內膜準備方案下研究對象基本情況的比較

NC組共納入145個周期，HRT組共納入378個周期，GnRHa+HRT組共納入82個周期，3組子宮內膜準備方案年齡、不孕年限、不孕類型、BMI、移植凍胚級別比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 3種子宮內膜準備方案下研究對象基本情況的比較

2.2 不同內膜準備方案患者內膜轉化日三維超聲各測量指標情況

3種子宮內膜準備方案下內膜轉化日子宮內膜厚度: HRT組為(8.48±1.72) mm，GnRHa+HRT組為(8.27±2.02) mm，NC組為(9.93±1.78) mm，NC組內膜厚度高于HRT組及GnRHa+HRT組，3組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；子宮內膜容積: HRT組為(2.61±0.30)cm3，GnRHa+HRT組為(2.04±0.04) cm3，NC組為(2.96±0.04) cm3，GnRHa+HRT組子宮內膜容積低于HRT組及NC組，3組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。3組患者中子宮動脈血流參數情況差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 3種內膜準備方案患者內膜轉化日三維超聲各測量指標的比較

2.3 不同內膜準備方案下妊娠結局的比較

3組患者足月產率比較，HRT組為57.1%(88/154)；GnRHa+HRT組為58.3%(21/36)；NC組為75.3%(55/73)；自然周期(NC)組的足月產率明顯高于HRT組及GnRHa+HRT組，3組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；組內HRT組與NC組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。而3組患者臨床妊娠率、活產率、早產率、早期流產率、晚期流產率、異位妊娠率差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 3種內膜準備方案下妊娠結局的比較

2.4 凍融胚胎移植患者足月產的影響因素分析

以凍融胚胎移植患者足月產妊娠結局為因變量，單因素Logisitic回歸分析表明，不孕類型、雙胎妊娠及內膜調理方案3項指標對凍融胚胎移植患者是否足月產的影響均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4；進一步多因素Logistic回歸分析結果表明，不孕類型、雙胎妊娠及內膜調理方案為凍融胚胎移植患者是否足月產的獨立影響因素(P<0.05)，其中內膜調理方案中以NC為參考，HRT及GnRHa+HRT兩種方案凍融胚胎移植患者足月產的可能性均降低，其OR值及95%CI分別為0.452(0.239～0.853)、0.415(0.173～0.995)，見圖1。

表4 影響凍融胚胎移植患者足月產的單因素logistic回歸分析

圖1 影響凍融胚胎移植患者足月產的多因素Logistic回歸分析Fig.1 Multivariate analysis of factors associated with full-term deliveries

3 討 論

目前IVF-ET治療已成為不孕癥患者最有效的治療方式。相較于鮮胚移植，凍融胚胎移植可顯著降低卵巢過度刺激綜合征的發(fā)生[1]，并可于FET前行充分的內膜準備以降低子宮內膜及子宮環(huán)境的不利影響因素，提高其移植效率。隨著胚胎的玻璃化冷凍保存技術的成熟，其胚胎質量和發(fā)育潛能與新鮮胚胎相接近[2]，故FET已經成為輔助生殖助孕過程中的一種常規(guī)技術。

3.1 不同子宮內膜準備方案的優(yōu)劣性對比

本研究納入了進行NC組、HRT組、GnRHa+HRT組3種內膜準備方案的605個周期。NC較為接近生理狀態(tài)，因為有自然排卵后的黃體形成。HRT周期則需在移植后予甾體激素行黃體支持。GnRHa+HRT周期適用于盆腔子宮內膜異位癥或子宮腺肌癥合并不孕癥的患者以及反復著床失敗的患者。促性腺激素釋放激素激動劑通過與GnRH競爭性結合垂體前葉促性腺激素分泌細胞上的受體，導致垂體不再釋放促性腺激素，實現垂體的降調，從而抑制內源促性腺激素的釋放，有利于改善子宮內膜容受性，調節(jié)免疫活性作用，改善胚胎著床。

3.2 不同內膜準備方案患者子宮內膜厚度、內膜容積及子宮動脈血流參數情況

本研究發(fā)現，在FET周期中臨床妊娠組內膜轉化日子宮內膜厚度為(8.86±1.97) mm，大于未臨床妊娠組[(8.32±1.59) mm]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。故認為內膜厚度與臨床結局呈正相關，與大多數的文獻報道結果一致。一項納入3 601名不孕婦女IVF-ET周期的多中心回顧性研究發(fā)現，HCG日的內膜厚度影響IVF-ET的妊娠結局，當內膜厚度<8 mm時臨床妊娠率與活產率較低[3]。Groenewoud等[4]認為在FET周期中內膜厚度尚不能預測其妊娠結局。Yuan等[5]的一項大數據研究中，共研究了10 000多個IVF/ICSI新鮮周期，結果發(fā)現，子宮內膜厚度小于8 mm的患者臨床妊娠率明顯低于子宮內膜厚度在8～11 mm的患者(分別為23%和37.2%)。

子宮內膜容受性(endometrial receptivity, ER)是指內膜允許囊胚定位，黏附，侵入，并誘導內膜間質發(fā)生一系列變化，最終使胚胎著床。反映ER的指標主要有子宮內膜厚度、子宮內膜容積、子宮內膜或子宮動脈多普勒數據及CD4+、CD8+、CD14+等分子標志物[6]。子宮內膜容積反映了整個宮腔子宮內膜的情況，內膜厚度與內膜容積具有顯著相關性。本研究中，黃體轉化日子宮內膜容積: HRT組為(2.61±0.30)cm3，GnRHa+HRT組為(2.04±0.04)cm3，NC組為(2.96±0.04)cm3，3組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與3組內膜厚度差異相一致。Mayer等[7]在一項回顧性隊列研究中發(fā)現，妊娠組與未妊娠組子宮內膜容積存在顯著差異，妊娠率隨子宮內膜容積增大而升高，與本研究結果一致。

子宮內膜及內膜下血流灌注的缺失往往伴隨著子宮動脈的高阻狀態(tài)[8]。本研究中3組內膜準備方案患者內膜轉化日子宮動脈血流參數無明顯差異性，臨床妊娠率亦無顯著性差異。一項研究在胚胎移植當天評估了70名女性，發(fā)現臨床妊娠和未妊娠女性之間子宮動脈PI和RI以及子宮內膜下PI和RI相似[9]。但有學者認為子宮動脈阻力可以反映ER并影響妊娠結局，該研究顯示胚胎移植日子宮動脈高PI、RI與不良妊娠結局有關，而子宮內膜血流PI、RI相較于子宮動脈降低[10]。盡管子宮動脈高阻力常與不良妊娠結局有關，但其并不能直接反映內膜血供，對于妊娠結局的影響仍需進一步分析探討[6]。作為一種非侵入性檢查，經陰道三維超聲測量子宮內膜容積、子宮內膜血流參數、子宮動脈血流參數可預測子宮內膜容受性，可以指導臨床醫(yī)師進行FET胚胎移植時機的選擇。

3.3 不同子宮內膜準備方案對妊娠結局的影響

揭慧英等[11]的研究發(fā)現，NC周期、HRT周期兩種內膜準備方案的胚胎著床率及臨床妊娠率無明顯差異。一項2016年的Meta分析結果顯示，NC周期患者的臨床妊娠率明顯高于HRT周期，推測HRT周期臨床妊娠率的降低可能與治療過程中子宮內膜容受性受損以及胚胎種植窗的提前關閉有關[12]。Kalem等[13]的研究同樣證實，NC周期、HRT周期的著床率、臨床妊娠率及活產率并無差別。本研究根據患者內膜特征，選擇不同的內膜處理方案，3組均獲得了較滿意的臨床結局。

3.4 凍融胚胎移植患者足月產的影響因素分析

本研究結果表明，不同的內膜調理方案、雙胎妊娠及不孕類型為足月產的獨立影響因素。相比于HRT及GnRHa周期患者，NC周期患者足月產率顯著增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。原發(fā)不孕的FET患者足月產率較繼發(fā)者高2.170倍(OR=2.170,95%CI: 1.270～3.709)。單胎妊娠患者足月產率較雙胎妊娠患者高2.103倍(OR=2.103,95%CI: 1.132～3.907)。

雙胎妊娠為高危妊娠，易發(fā)生各種妊娠期并發(fā)癥，如早產、胎兒窘迫、產后出血等。早產是雙胎妊娠最常見的并發(fā)癥之一[14]。本研究發(fā)現，對于年齡<35歲的不孕患者，單胎妊娠足月產的可能性為雙胎妊娠的2.103倍(OR=2.103,95%CI=1.132～3.907)。建議對35歲以下年輕患者行單胚移植，以求更好的圍產期結局。

本研究發(fā)現，原發(fā)不孕患者足月產率為繼發(fā)性不孕患者的2.170倍(OR=2.170,95%CI=1.270～3.709)。故推測，繼發(fā)不孕為足月產危險因素，可能既往妊娠尤其流產等導致子宮內膜的損傷，從而導致胎盤形成不良、宮頸機能不全等，但具體機制需進一步探究[15-16]。

NC方案中，子宮內膜發(fā)育為機體生理狀態(tài)下，通過自身內源性激素調控。本研究發(fā)現，相比于HRT及GnRHa+HRT方案，NC組患者具有更高的足月產率。因此，對于有自然排卵的患者盡可能選用NC方案，可能獲得更好的妊娠結局。

綜上所述，本研究通過回顧性分析單中心的3種不同的子宮內膜處理方案，對臨床妊娠結局的影響，結果顯示3組早產率、早期自然流產率、晚期流產率、異位妊娠率等妊娠結局，差異均無統(tǒng)計學意義，而足月產率3組比較，差異有統(tǒng)計學意義。具體機制尚待擴大樣本量，設計多中心的隨機對照試驗和系統(tǒng)性評價，進行深入分析。