宋秀軍，盧敬泰，牛冬梅，趙廣利，呂 進，王 碩，李 娜，張陽東（.火箭軍特色醫(yī)學(xué)中心，北京 00088；.火箭軍96606 部隊醫(yī)院，河南洛陽 47003）

電離輻射對人體會造成嚴(yán)重傷害，長期影響健康，甚至導(dǎo)致腫瘤[1-2]。在職業(yè)暴露及輻射事故中，對輻射損傷做出及時有效的評估是當(dāng)前研究的熱點之一。因此，尋找合適的生物標(biāo)志物對早期快速篩查接觸人群具有重要意義。目前國內(nèi)外學(xué)者通過研究已將多種miRNAs 用于腫瘤診斷、治療和預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物[3-4]。本研究通過低密度流體芯片技術(shù)，分析篩選經(jīng)X射線誘導(dǎo)的外周血淋巴細(xì)胞差異表達的miRNAs，為尋找新的輻射相關(guān)的生物標(biāo)志物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 采集7 例健康成年男性外周血液標(biāo)本。受試者平均年齡 32 周歲。所有受試者均征得書面知情同意，研究方案經(jīng)火箭軍特色醫(yī)學(xué)中心倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 儀器與試劑 直線加速器（由火箭軍特色醫(yī)學(xué)中心放療科提供，瑞典Elekta 公司Precise 型）；實時熒光定量PCR 儀（ABI7900，ABI 公司）；PRMI 1640 培養(yǎng)液和胎牛血清均購自美國Gibco公司；microRNA 提取試劑盒（mirVana? miRNA Isolation Kit）、microRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription Kit）、miRNA 引物和探針、microRNA 定量檢測試劑（TaqMan?Universal PCR Master Mix）、miRNA 低密度流體芯片（Taqman Low Density Array，TLDA）均購自美國ABI 公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本的采集與分組：所有受試者均采集外周血各20 ml，分別用2Gy 與4 Gy X射線（吸收劑量率為1.0Gy／min）體外照射，于12h 和24h 分離淋巴細(xì)胞。以未照射的人外周血淋巴細(xì)胞為對照組。

1.3.2 miRNA 的提?。河胢icroRNA 提取試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA。具體步驟如下：加入600μl裂解液3min，充分裂解細(xì)胞；加入1.25 倍體積的無水乙醇，充分混勻；將混合液吸入至過濾柱內(nèi)，10 000 r/min 離心15s，棄去管內(nèi)液體；加入700μl miRNA Wash Solution 1，離心10s，棄去管內(nèi)液體；加入500μl miRNA Wash Solution 2/3，按以上步驟離心，棄去管內(nèi)液體，重復(fù)此步驟；將離心柱重新放入收集管內(nèi)，離心1min；加入50μl Nucleasefree Water，離心30s，洗脫RNA。

1.3.3 miRNA 芯片檢測：采用Taqman 低密度流體芯片檢測不同劑量照射后人外周血淋巴細(xì)胞miRNA表達譜變化。TaqManArray MicroRNA 芯片分為A，B 板，可同時檢測760 種成熟miRNAs的表達。加入特異性莖環(huán)引物反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA 后，采用ABI PRISM 7900 測序儀進行差異表達miRNA的篩選。反應(yīng)條件為：50℃ 2min；95℃ 10min；95℃15s，60℃ 1min，共45 個循環(huán)，獲得每種miRNA 特異性擴增曲線。

1.3.4 結(jié)果判讀 miRNA 相對表達量計算方法：以對照組中U6 miRNA的表達量為內(nèi)參，△△Ct法[5-6]計算各組miRNA 相對對照組表達量的倍數(shù)。公式為：Fold change=-△△Ct=-（△Ct實驗組-△Ct對照組）；△Ct=Ct待測樣品-Ct內(nèi)參。結(jié)果判讀：表達結(jié)果以≥2 和＜-2 為結(jié)果表達異常。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 使用 SPSS 19.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 X射線照射人外周血淋巴細(xì)胞差異表達的miRNAs 經(jīng)2 Gy 與4 Gy X射線照射人外周血淋巴細(xì)胞12h 或24h 后，對760 種miRNAs 進行差異表達的篩選。結(jié)果顯示，經(jīng)2Gy X射線照射12h 后表達升高的miRNAs 有178 種，表達降低的miRNAs 有32 種；2Gy X射線照射24h 后表達升高的miRNAs 有343 種，表達降低的miRNAs 有28 種。經(jīng)4Gy X射線照射12h 后表達升高的miRNAs 有105 種，表達降低的miRNAs 有441 種； 經(jīng)4Gy X射線照射24h 后表達升高的miRNAs 有121 種，表達降低的miRNAs 有303 種。

2.2 X射線照射人外周血淋巴細(xì)胞miRNA 的時間反應(yīng)性 為篩選出具有時間效應(yīng)性的miRNAs，對差異表達的miRNAs 進一步分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2 Gy X射線照射人外周血淋巴細(xì)胞12h 和24h 可以誘導(dǎo)48 種隨時間的延長而表達上調(diào)的miRNAs，53 種隨時間的延長而表達下調(diào)的miRNAs，見圖1a，1b；4Gy X射線照射人外周血淋巴細(xì)胞12h 和24h 可誘導(dǎo)32 種隨時間的延長而表達上調(diào)的miRNAs，14 種隨時間的延長而表達下調(diào)的miRNAs，見圖1a，1b。其中20 種miRNAs 同時表現(xiàn)出時間反應(yīng)性，即隨著照射時間的延長而升高，其升高倍數(shù)為0.25～27.43 倍,見圖1a，2。8 種miRNA 隨著照射時間的延長而降低，其下調(diào)倍數(shù)為0.11～13.84 倍，見圖1b。

圖1 X射線照射人外周血淋巴細(xì)胞具有時間反應(yīng)性差異表達的miRNAs

2.3 X射線照射人外周血淋巴細(xì)胞miRNA 的劑量反應(yīng)性 為篩選出具有劑量效應(yīng)性的miRNAs，對差異表達的miRNAs 進一步分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)2Gy 和4Gy X射線照射人外周血淋巴細(xì)胞12h 后，可以誘導(dǎo)12 種隨劑量的增加而表達上調(diào)的miRNAs，45 種隨劑量的增加而表達下調(diào)的miRNAs，見圖3a，3b；經(jīng)2Gy 和4Gy X射線照射人外周血淋巴細(xì)胞24h 后，可誘導(dǎo)19 種隨劑量的增加而表達上調(diào)的miRNAs，56 種隨劑量的增加而表達下調(diào)的miRNAs（見圖3a，3b）。2Gy 與4Gy X射線照射人外周血淋巴細(xì)胞12h 或24h 可以誘導(dǎo)34 種miRNAs 隨劑量的增加而表達上調(diào)及77 種miRNAs 隨劑量的增加而表達下調(diào)，且表現(xiàn)出特定時間點的劑量反應(yīng)性；其中僅有2 種miRNAs 同時表現(xiàn)出對2Gy 與4Gy 的劑量反應(yīng)性，即隨著照射劑量的升高而升高，其升高倍數(shù)為0.16～1.12 倍，見圖3a，4。24 種miRNAs 同時表現(xiàn)出對2Gy 與4Gy 的劑量反應(yīng)性，隨著劑量的增加而降低，其下調(diào)倍數(shù)為0.08～45.34，見圖3b。

圖2 X射線照射人外周血淋巴細(xì)胞具有時間反應(yīng)性且表達上調(diào)的miRNAs

圖3 X射線照射人外周血淋巴細(xì)胞具有劑量反應(yīng)性差異表達的miRNAs

圖4 X射線照射人外周血淋巴細(xì)胞具有劑量反應(yīng)性且表達上調(diào)的miRNAs

2.4 四種差異表達的miRNAs PCR 單管驗證 選取一種在芯片結(jié)果中具有時間反應(yīng)性且表達上調(diào)的miRNA 即has-miRNA-21，三種在芯片結(jié)果中不同時間點和劑量點表達升高或降低的miRNAs 即 hasmiRNA-424，has-miRNA-505 和has-miRNA-423-5p進行PCR 方法的單管驗證，其與芯片結(jié)果不完全一致，總體表現(xiàn)為表達水平低于芯片檢測水平，見圖5。

圖5 四種差異表達的miRANs PCR 單管驗證

3 討論

核輻射事故的發(fā)生往往具有不可預(yù)測性，會給公眾造成嚴(yán)重后果。尋找準(zhǔn)確、簡便、快速的輻射應(yīng)急反應(yīng)生物標(biāo)志物具有重要意義。目前有以染色體畸變?yōu)榇淼募?xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)是輻射生物劑量的金標(biāo)準(zhǔn)[7-8]。此外，美國哥倫比亞大學(xué)研發(fā)了自動化分析淋巴細(xì)胞微核和淋巴細(xì)胞γ-H2AX的技術(shù)平臺[9]，REPIN 等[10]利用此技術(shù)平臺實現(xiàn)微量血淋巴細(xì)胞微核分析并建立了劑量上限為5Gy的劑量效應(yīng)曲線。但是這些評估方法有其局限性，非常費時而且難以廣泛應(yīng)用，因此尋找能夠早期快速評估輻射損傷程度的微創(chuàng)生物標(biāo)志物更具有明顯的優(yōu)勢。

miRNAs 廣泛存在于真核生物中，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡及基因調(diào)控中起重要作用[11]。近年來，miRNAs 作為微創(chuàng)生物標(biāo)志物已顯示良好的應(yīng)用前景，被應(yīng)用于篩查腫瘤等復(fù)雜疾病[12-14]。因有其獨特的優(yōu)勢，如采集方便、在室溫下或經(jīng)過反復(fù)凍融循環(huán)后的相對穩(wěn)定性、可高通量快速檢測、高特異度和敏感度等特點，所以是一種理想的生物標(biāo)志物[15-16]。動物實驗研究中發(fā)現(xiàn)，miRNA 在血漿中的差異表達與輻射損傷有關(guān)[17]。電離輻射可以影響特定miRNA的表達水平，并具有輻射劑量和時間依賴性[18]。

目前，國內(nèi)外關(guān)于人外周血淋巴細(xì)胞中miRNAs作為輻射生物劑量劑的研究相對較少。因此，本研究應(yīng)用低密度流體芯片技術(shù)，對不同劑量X射線照射后人外周血淋巴細(xì)胞中760 種miRNAs的表達水平進行初步分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在2 Gy 與4 Gy X射線照射后，20 種miRNAs 隨著照射時間的延長而升高，8 種miRNA 隨著照射時間的延長而降低，其中部分miRNAs 照射后表達升高，與SONG 等[19]的研究結(jié)果較為一致，說明X射線照射后淋巴細(xì)胞中miRNAs的表達是個動態(tài)的過程；2 種miRNAs隨照射劑量增加而表達上調(diào)，24 種miRNAs 隨劑量增加而表達下調(diào)，說明隨著X射線照射后時間的延長，miRNAs的表達與劑量相關(guān)。上述研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，有4 種miRNAs 即has-miR-629，hasmiR-138，has-miR-210 和has-miR-331-5p 同時表現(xiàn)出劑量和時間反應(yīng)性，即隨著照射劑量的增加及照射后時間的延長而表達下調(diào)，這與侯殿俊等[20]報道的人外周血miRNA-150 的變化規(guī)律相一致，提示這四種miRNA 作為輻射生物劑量標(biāo)志物可能更具有可行性。從芯片結(jié)果和PCR 單管驗證結(jié)果相比較發(fā)現(xiàn)，4 種miRANs 在時間和劑量的表達趨勢上并不完全一致，這是否和本研究中樣本數(shù)較少有關(guān)，還有待進一步的證實。

綜上可知，本研究通過對外周血淋巴細(xì)胞miRNA表達譜分析發(fā)現(xiàn)，X射線既能夠誘導(dǎo)部分miRNAs的表達，也能夠抑制部分miRNAs的表達，這些差異表達的miRNAs 表現(xiàn)出一定的時間和劑量反應(yīng)性，為進一步尋找評估輻射損傷的生物標(biāo)志物奠定了實驗基礎(chǔ)。在后續(xù)的實驗研究中，我們將探索對表現(xiàn)出時間和劑量反應(yīng)性的miRNAs，增加時間點和射線照射的劑量范圍，制作時間劑量效應(yīng)曲線，進一步驗證其作為輻射損傷標(biāo)志物的可行性。