趙大龍，田金靈（菏澤市中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，山東菏澤 274000）

顱腦損傷是施加于頭部的機(jī)械力引起的腦形態(tài)改變或神經(jīng)功能破壞，是創(chuàng)傷患者中死亡率和致殘率最高的類型[1]。微小核糖核酸（micro nucleic acid，miRNAs）廣泛參與細(xì)胞增殖凋亡、代謝、應(yīng)激、組織修復(fù)等幾乎生命體各種生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)過(guò)程，在顱腦損傷以及神經(jīng)組織修復(fù)中也發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[2]?，F(xiàn)有報(bào)道顯示miR-422a 在急性缺血性腦卒中急性期表達(dá)上調(diào)，亞急性期表達(dá)下調(diào)[3]，在腦組織缺血再灌注過(guò)程中，miR-422a 參與神經(jīng)細(xì)胞存活和凋亡的調(diào)節(jié)過(guò)程[4]。miR-212-5p 在神經(jīng)元細(xì)胞中表達(dá)豐富，參與神經(jīng)元增長(zhǎng)分化、突觸可塑性、記憶形成等過(guò)程，并維持神經(jīng)元形態(tài)和功能[5]，現(xiàn)有研究顯示miR-212-5p表達(dá)異常與阿爾茨海默病發(fā)生有關(guān)[6]。然而miR-422a，miR-212-5p 在顱腦損傷的報(bào)道卻十分少見，為此本研究通過(guò)設(shè)計(jì)臨床對(duì)照試驗(yàn)，檢測(cè)創(chuàng)傷性顱腦損傷患者血清miR-422a，miR-212-5p表達(dá)特點(diǎn)，分析其與該疾病病情和預(yù)后的相關(guān)性，以期為臨床診治提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究已經(jīng)獲得山東省菏澤市中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，自2018年4月～2020年6月連續(xù)性選擇菏澤市中醫(yī)醫(yī)院收治的173 例創(chuàng)傷性顱腦損傷患者（創(chuàng)傷組），均有明確外傷史，受傷至入院時(shí)間均不超過(guò)24h，急診顱腦多層螺旋CT 提示存在顱內(nèi)血腫或出血病灶，其中男性103 例，女性70 例，年齡31～52 歲，平均年齡44.15±6.02 歲，致傷機(jī)制：交通事故傷75 例，高空墜落傷55 例，砸傷43 例；腦損傷類型：硬膜外血腫32 例，硬膜下血腫51 例，腦內(nèi)血腫47 例，蛛網(wǎng)膜下腔出血43例。所有患者入院后均由神經(jīng)外科醫(yī)生進(jìn)行格拉斯哥昏迷量表（Glasgow coma Scale，GCS）評(píng)分，根據(jù)GCS 評(píng)分將患者分為輕度組（GCS 評(píng)分13～15 分，57 例），中度組（GCS 評(píng)分9～12 分，63 例）和重度組（GCS 評(píng)分3～8 分，53 例）[7]。排除標(biāo)準(zhǔn)：①腦卒中、顱內(nèi)腫瘤、顱內(nèi)感染；②癡呆、阿爾茲海默病、帕金森；③內(nèi)分泌疾病、免疫和血液系統(tǒng)疾病。另選擇同時(shí)段于我院門診體檢的125 例志愿者為對(duì)照組，均排除神經(jīng)系統(tǒng)疾病，近期顱腦外傷或手術(shù)史，惡性腫瘤以及心、肺、腎等系統(tǒng)性疾病，男性85 例，女性40 例，年齡38～60 歲，平均年齡44.62±6.51 歲，創(chuàng)傷組和對(duì)照組受試者均知情本研究并簽署同意書，組間年齡和性別比較均衡性良好（P＞0.05）。

1.2 儀器與試劑 TRIzol 試劑（上海朝瑞生物科技有限公司），miRNeasy Kit（德國(guó)Qiagen 公司），TaqMan miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Applied Biosystems 公司），iTaq Universal SYBR Green 超混合液（美國(guó)BIO-RAD 公司），VeritiPro 實(shí)時(shí)定量PCR 儀（美國(guó)Applied Biosystems 公司）。

1.3 方法 血清miR-422a，miR-212-5p 檢測(cè)：創(chuàng)傷組患者入院后立即（對(duì)照組體檢當(dāng)日）采集肘靜脈血3ml 注入干燥試管，取血液凝固后的上層液離心（4℃，3 000r/min，15min，半徑10cm）-80℃保存待檢。RT-PCR 檢測(cè)miR-422a，miR-212-5p表達(dá)：TRIzol法提取總RNA，miRNeasy Kit 純化RNA，TaqMan miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將吸光度值A(chǔ)260nm/A280nm的50 ng RNA 樣品轉(zhuǎn)錄為cDNA，加入iTaq Universal SYBR Green 超混合液，采用實(shí)時(shí)定量PCR 儀通過(guò)2-ΔΔCt方法[2-（Ct靶基因-Ct參考基因）]進(jìn)行qPCR 定量測(cè)量。反應(yīng)體系SYBR? Premix Ex Taq? II（2×）12.5μl，dNTP1.6μl，Taq DNA 聚合酶1μl，上下游引物10μmol/L 各1μl，加反應(yīng)緩沖液至20μl。反應(yīng)條件：95℃變性10s，65℃退火20s;75℃延伸15s，做40 個(gè)循環(huán)。引物序列（由上海基康公司完成）：miR-422a 上游5’-ACTGGACTTAGGGTCAG-3’。下游5’-GAACATGTCTGCGTATCTC-3’； miR-212-5p 上游5’- ACCTTGGCTCTAGACTGCT -3’，下游5’-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3’。β-actin（內(nèi)參）上游：5’-TGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3’，下游：5’-GCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3’。做3 次平行試驗(yàn)，2-ΔΔCt計(jì)算miR-422a 和miR-212-5p 相對(duì)表達(dá)量，取3 次平均值。

臨床結(jié)局追蹤：所有患者入院后立即給予心電監(jiān)護(hù)、顱內(nèi)壓監(jiān)測(cè)、亞低溫治療、脫水降顱壓、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)、預(yù)防腦血管痙攣、維持水電解質(zhì)平衡等常規(guī)治療，通氣障礙者行無(wú)創(chuàng)或有創(chuàng)機(jī)械通氣、意識(shí)障礙加重、瞳孔變化者，立即復(fù)查顱腦CT，提示血腫量進(jìn)行性增加達(dá)手術(shù)指征者立即急診手術(shù)治療。傷后30 天采用格拉斯哥預(yù)后量表（Glasgow outcome scale，GOS）[8]評(píng)估顱腦損傷患者預(yù)后情況，1 分為死亡；2 分為植物生存，僅有最小反應(yīng)；3 分為嚴(yán)重殘疾，無(wú)自我生活能力；4 分為輕度殘疾，可獨(dú)立生活；5 分為基本恢復(fù)良好，遺留輕度缺陷。根據(jù)GOS 評(píng)分將患者分為預(yù)后不良組（GOS 評(píng)分1～3分，62 例），預(yù)后良好組（GOS 評(píng)分4～5 分，111 例）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 25.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析（兩兩對(duì)比采用LSD-t檢驗(yàn)）或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，性別以例(n)表示，χ2檢驗(yàn)差異性。二元Logistic 逐步回歸分析創(chuàng)傷性腦損傷患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素，繪制受試者工作特征曲線（ROC）分析miR-422a，miR-212-5p 診斷創(chuàng)傷性腦損傷患者預(yù)后的價(jià)值，以Z檢驗(yàn)曲線下面積的差異性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)傷組、對(duì)照組血清miR-422a，miR-212-5p表達(dá)比較 見表1。創(chuàng)傷組血清miR-422a 表達(dá)高于對(duì)照組（3.02±1.02 vs 0.95±0.21），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=223.340,P＜0.05），miR-212-5p表達(dá)低于對(duì)照組（1.03±0.28 vs 2.85±0.61），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=35.544,P＜0.05）。

2.2 不同病情患者血清miR-422a，miR-212-5p表達(dá)比較 見表1。重度組血清miR-422a 表達(dá)高于中度組和輕度組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），miR-212-5p表達(dá)低于中度組和輕度組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），中度組血清miR-422a 表達(dá)高于輕度組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），miR-212-5p表達(dá)低于輕度組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 不同病情亞組血清miR-422a，miR-212-5p表達(dá)差異(±s，2-△△Ct）

表1 不同病情亞組血清miR-422a，miR-212-5p表達(dá)差異(±s，2-△△Ct）

項(xiàng)目輕度組（3）（n=57）中度組（2）（n=63）重度組（1）（n=53）F 值P 值(1)vs(2)(1)vs(3)(2)vs(3)t Pt PtP miR-422a2.21±0.12 2.92±0.66 4.01±0.13266.5410.00011.824＜0.0575.516＜0.058.000＜0.05 miR-212-5p1.27±0.04 0.97±0.25 0.84±0.06111.0280.0003.695＜0.0544.512＜0.058.953＜0.05

2.3 不同預(yù)后患者血清miR-422a，miR-212-5p表達(dá)比較 預(yù)后不良組血清miR-422a 表達(dá)高于預(yù)后良好組（4.05±0.11 vs 2.44±0.31），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=39.486，P＜0.05），miR-212-5p表達(dá)低于預(yù)后良好組（0.83±0.06 vs 1.14±0.21），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.354，P＜0.05）。

2.4 miR-422a，miR-212-5p 與創(chuàng)傷性顱腦損傷患者預(yù)后的關(guān)系 見表2。將年齡、性別（賦值：0=女，1=男），致傷機(jī)制（賦值：1=交通事故傷，2=高空墜落傷，3=砸傷），腦損傷類型（賦值：1=硬膜外血腫，2=硬膜下血腫，3=腦內(nèi)血腫，4=蛛網(wǎng)膜下腔出血），GCS 評(píng)分，miR-422a，miR-212-5p 納入Logistic 回歸方程，向后逐步法排除無(wú)關(guān)變量（α進(jìn)=0.05，α出=0.10），結(jié)果顯示低GCS 評(píng)分，高miR-422a 表達(dá)，低miR-212-5p表達(dá)是創(chuàng)傷性顱腦損傷患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。212-5p 預(yù)測(cè)創(chuàng)傷性顱腦損傷患者預(yù)后不良的界值為3.21，0.98，曲線下面積為0.797（95%CI：0.731～0.863），P=0.000，敏感度 70.97%，特異度72.07%；0.775（95%CI：0.700～0.850），P=0.000，敏感度72.58%，特異度76.58%?；诙狶ogistic 計(jì)算聯(lián)合miR-422a，miR-212-5p 的預(yù)測(cè)值，其曲線下面積為0.907（95%CI：0.854～0.960），P=0.000，敏感度90.32%，特異度91.89%，高于單獨(dú)miR-422a，miR-212-5p 預(yù)測(cè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=2.412，2.561，P=0.013，0.010）。

表2 影響創(chuàng)傷性顱腦損傷患者預(yù)后的Logistic 回歸方程

2.5 miR-422a，miR-212-5p 預(yù)測(cè)創(chuàng)傷性顱腦損傷患者預(yù)后不良的價(jià)值分析 見圖1。miR-422a，miR-

圖1 miR-422a，miR-212-5p 預(yù)測(cè)創(chuàng)傷性顱腦損傷患者預(yù)后不良的ROC 圖

3 討論

miRNA 是受廣泛關(guān)注的新型小分子非編碼RNA，可調(diào)節(jié)多達(dá)30%的蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)，并可能在許多復(fù)雜疾病的發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]?，F(xiàn)有研究顯示多種miRNA 可通過(guò)靶向神經(jīng)病理生理途徑參與顱腦外傷過(guò)程[10]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-422a在創(chuàng)傷性腦損傷患者外周血清中表達(dá)上調(diào)，YAN等[11]人檢測(cè)了創(chuàng)傷性腦損傷血清miRNA 譜，發(fā)現(xiàn)miR-422a 在輕度顱腦損傷以及嚴(yán)重顱腦損傷中均表達(dá)上調(diào)，提示miR-422a 可能與創(chuàng)傷性腦損傷病有關(guān)。miR-422a 是作用廣泛的miRNA，定位于15q22.31，在腦組織中也有廣泛表達(dá)，現(xiàn)有研究顯示氧葡萄糖剝奪/再充氧可誘導(dǎo)腦組織中miR-422a 表達(dá)上調(diào)，并誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞毒性，介導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞損傷[12]，miR-422a 在免疫介導(dǎo)的脫髓鞘和神經(jīng)退行性疾病中也出現(xiàn)高表達(dá)[9]，miR-422a可作為缺血性腦卒中的生物學(xué)標(biāo)志物[3]。miR-422a參與腦損傷的機(jī)制尚不清楚，可能為 miR-422a 可靶向抑制有絲分裂原激活的蛋白激酶6[13]和肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2D（myocyte enhancement factor 2D，MEF2D）[14]的表達(dá)，其中MEF2D 是神經(jīng)元存活所需要的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[15]，由此可見miR-422a 過(guò)表達(dá)可能促使神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，引起病情進(jìn)展。

本研究結(jié)果表明miR-212-5p 低表達(dá)與腦損傷所致昏迷程度加重以及傷后30 天神經(jīng)預(yù)后不良均有關(guān)。miR-212-5p 屬于miR-212 家族成員，miR-212 位于染色體17p13.3，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)，參與神經(jīng)元形態(tài)和功能維持，調(diào)控突觸活性和認(rèn)知相關(guān)基因表達(dá)[16]。miR-212 表達(dá)失調(diào)可導(dǎo)致認(rèn)知相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路異常，損害記憶功能[17]，miR-212 還可通過(guò)靶向腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中緊密連接蛋白claudin-1，連接黏附分子3 和緊密連接相關(guān)蛋白1 表達(dá)破壞血腦屏障完整性[18]。推測(cè)miR-212-5p 參與創(chuàng)傷性腦損傷的機(jī)制為：創(chuàng)傷性腦損傷后缺血缺氧可誘導(dǎo)腦組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，活性氧大量產(chǎn)生，抗氧化物活性降低，繼而上調(diào)鐵中毒相關(guān)基因表達(dá)，導(dǎo)致鐵代謝異常，出現(xiàn)鐵累積，最終誘導(dǎo)神經(jīng)元變性壞死[19]。miR-212-5p 可靶向環(huán)加氧酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）（又叫PTGS2），PTGS2 是前列腺素合成的關(guān)鍵酶，可催化脂質(zhì)氧化，誘導(dǎo)大量脂質(zhì)活性氧異常累積，導(dǎo)致鐵死亡（Ferroptosis）[20]，F(xiàn)erroptosis 是一種鐵依賴性脂質(zhì)過(guò)氧化物驅(qū)使下的非細(xì)胞凋亡性死亡方式，顱腦外傷后可誘導(dǎo)Ferroptosis 產(chǎn)生[21]，因此推測(cè)miR-212-5p 可能通過(guò)miR-212-5p/ PTGS2 途徑誘導(dǎo)Ferroptosis，繼而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡，神經(jīng)功能缺損和不良結(jié)局發(fā)生。ROC 分析結(jié)果顯示miR-422a，miR-212-5p 預(yù)測(cè)創(chuàng)傷性腦損傷患者預(yù)后不良的曲線下面積分別為0.797，0.775，而聯(lián)合兩項(xiàng)指標(biāo)時(shí)曲線下面積明顯擴(kuò)大（0.907），提示聯(lián)合檢測(cè)創(chuàng)傷性腦損傷患者傷后24h 內(nèi)血清miR-422a，miR-212-5p表達(dá)水平更有助于判斷患者病情和預(yù)后，為臨床提供更可靠信息。

綜上所述，創(chuàng)傷性腦損傷患者血清miR-422a表達(dá)上調(diào)，miR-212-5p表達(dá)下調(diào)，miR-422a 過(guò)表達(dá)和miR-212-5p表達(dá)缺失與腦損傷嚴(yán)重程度和不良預(yù)后有關(guān)，可作為預(yù)后預(yù)測(cè)的潛在生物學(xué)指標(biāo)。本研究未觀察miR-422a，miR-212-5p 動(dòng)態(tài)變化，兩指標(biāo)是否與病情變化和臨床治療反應(yīng)有關(guān)尚不清楚，還需進(jìn)一步研究證實(shí)。