王 偉，張 靜，浦 春（.阜陽(yáng)市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽阜陽(yáng) 36004；.皖南醫(yī)學(xué)院，安徽蕪湖4000）

妊娠糖尿?。╣estational diabetes mellitus，GDM）是在妊娠過(guò)程中發(fā)生或首次發(fā)現(xiàn)的不同程度的葡萄糖耐量異常，導(dǎo)致妊娠期間高血壓、羊水過(guò)多和自然流產(chǎn)的發(fā)生率增加，異常胎兒發(fā)育、新生兒低血糖和死產(chǎn)的發(fā)生率顯著增加[1]。部分GDM 患者在分娩后5 ～13年內(nèi)患上2型糖尿病[2]。目前，關(guān)于GDM 的發(fā)病機(jī)理的研究相對(duì)較少。近年來(lái)，關(guān)于GDM 發(fā)病機(jī)理的研究取得了重大進(jìn)展。孕婦妊娠期間的胰島素敏感性會(huì)降低，并且人體的胰島β細(xì)胞儲(chǔ)備不足以彌補(bǔ)這一不足，產(chǎn)生的胰島素抵抗（insulin resistance，IR）導(dǎo)致葡萄糖和脂質(zhì)代謝紊亂，誘發(fā)GDM[3]。研究發(fā)現(xiàn)[4]，GDM 的發(fā)生和發(fā)展與某些炎癥因子和脂肪細(xì)胞因子有關(guān)。在人體中，脂肪組織可以分泌內(nèi)臟脂肪素(Visfatin)、瘦素、內(nèi)脂素、脂肪因子趨化素（chemerin）等許多脂肪細(xì)胞因子，其可以通過(guò)自分泌或旁分泌方法參與炎癥、代謝疾病和心血管疾病的發(fā)生[5]。本研究主要探討GDM 患者血清、臍血及胎盤(pán)組織中的Visfatin，Chemerin的表達(dá)變化及與患者發(fā)生胰島素抵抗的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018年12月～2020年4月阜陽(yáng)市人民醫(yī)院妊娠分娩的GDM 孕婦100 例作為GDM 組、糖耐量正常孕婦100 例作為NGT 組。GDM 組的年齡22 ～38 歲，平均年齡27.5±2.8 歲；孕前體質(zhì)量指數(shù)（BMI）21.86±1.90 kg/m2；分娩時(shí)BMI 31.09±2.47 kg/m2；身高162.8±4.0 cm；分娩孕周39.5±1.1 周；收縮壓122.8±6.9 mmHg；舒張壓73.6±5.0 mmHg。NGT 組的年齡22 ～38 歲，平均年齡27.8±3.1 歲；孕前體質(zhì)量指數(shù)（BMI）21.78±2.04 kg/m2；分娩時(shí)BMI 30.55±2.20kg/m2；身高163.2±3.8 cm；分娩孕周39.3±1.4 周；收縮壓123.3±6.1 mmHg；舒張壓75.0±5.7 mmHg。兩組上述基線資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①GDM 的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)推薦標(biāo)準(zhǔn)，以口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT）作為基礎(chǔ)：三項(xiàng)中的任何一項(xiàng)即可診斷GDM：（1）兩次以上空腹血糖≥5.8mmol/L；（2）OGTT 試驗(yàn)中有2 項(xiàng)數(shù)據(jù)≥5.8mmol/L；（3）50g 葡萄糖負(fù)荷試驗(yàn)≥11.1mmol/L 及空腹血糖＞5.18mmol/L 即可診斷。②兩組研究對(duì)象均在我院接受產(chǎn)前檢查及分娩。③本研究涉及的檢查項(xiàng)目及個(gè)人隱私資料均注意保密，均與研究對(duì)象簽署知情同意書(shū)。④研究對(duì)象的年齡范圍22 ～38 歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①生殖系統(tǒng)腫瘤；②生殖系統(tǒng)感染性疾??；③凝血功能疾病；④肝腎臟疾??；⑤妊娠期高血壓；⑥單支預(yù)計(jì)綜合征；⑦自身免疫性疾?。虎喽嗵ト焉?；⑨吸毒、酗酒；⑩甲狀腺功能異常。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要儀器及設(shè)備：內(nèi)切式均漿器（IKA 公司，USA，型號(hào)：T10），臺(tái)式低溫離心機(jī)（Eppendorf公司，USA，型號(hào)：5404R），分光光度計(jì)（BIO-RAD公司，USA，型號(hào)：Smart SpecTM plus spectrophotometer）。

1.2.2 主要試劑：氯仿（分析純，天津市化學(xué)試劑六廠，批號(hào)：20160322）；異丙醇（分析純，天津市化學(xué)試劑六廠，批號(hào)：20170423）；TRIZOL（Invitrogen，15596-026）； 無(wú)水乙醇（ 分析純，天津市化學(xué)試劑六廠，批號(hào)：20180116）；Oligo(dT)18（寶生物生物工程有限公司，貨號(hào)：D511）；RNA 酶抑制劑（invitrogen，貨號(hào)：10777-019）；d NTP 混合物（invitrogen，貨號(hào)：18427-088）；EcoRI-HF（NEB 公司產(chǎn)品。貨號(hào)：R3101）；BamHI-HF（NEB 公司產(chǎn)品，貨號(hào)：R3136）；DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL2000 plus，北京全式金公司產(chǎn)品）；Polybrene（sigma，貨號(hào)：H9268）；實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 ［3T3-L1 脂肪細(xì)胞（上海歌凡生物細(xì)胞庫(kù)）］，高糖 DMEM，新生小牛血清( new calf serum，NCS)，0.25g/ml 胰酶，Penicillin-Streptomycin(雙抗)( 10 000 U/ml)購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；胎牛血清( fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自美國(guó) Hyclone 公司；3 -異丁基-1-甲 基 黃 嘌呤( 3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX )，胰島素，地塞米松購(gòu)自德國(guó)Sigma 公司。

1.3 方法

1.3.1 血糖、血脂指標(biāo)檢測(cè)：兩組研究對(duì)象分娩前清晨抽取患者空腹靜脈血5 ml，3 000 r / min 離心10min，分離血清。葡萄糖氧化酶法檢測(cè)空腹血糖（FPG）（日立7600 全自動(dòng)生化分析儀）；Roche Cobase601 自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)可檢測(cè)空腹胰島素（Fins）；糖化血紅蛋白檢測(cè)系統(tǒng)[愛(ài)科來(lái)醫(yī)療電子（上海）有限公司，型號(hào)HA-8180 /11204033]檢測(cè)HbA1c；日立7600 自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)總膽固醇（total cholesterol,TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol,HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平；抗胰島素性穩(wěn)態(tài)模式評(píng)估法（homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR）= FPG×Fins / 22.5，

1.3.2 血清、臍血、胎盤(pán)組織中的Visfatin，Chemerin 檢測(cè)：臍帶血獲?。盒律鷥簲嗄毢笫占殠а?，離心取上清液，并保存在-80℃。雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測(cè)定血清和臍血Visfatin和Chemerin表達(dá)水平，嚴(yán)格按照操作說(shuō)明進(jìn)行。Western blot 檢測(cè)胎盤(pán)Visfatin，Chemerin 蛋白水平；在胎盤(pán)娩出后5min 內(nèi)，無(wú)菌選擇母體面中央1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm 的新鮮、未鈣化的胎盤(pán)組織，用生理鹽水沖洗，在玻璃勻漿器中壓碎，在冰浴下加入裂解液30min，轉(zhuǎn)移到離心管中，以10 000 r /min 在4℃下離心5min，取上清，BCA 法確定蛋白質(zhì)濃度。蛋白通過(guò)SDS-PAGE 電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，用TBST 沖洗，在室溫下使用5g/dl 脫脂奶粉封閉1 h，添加兔抗人一抗工作液（抗Visfatin，Chemerin），并在4℃條件下孵育過(guò)夜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗工作溶液，并在37℃下孵育1h，TBST 漂洗，顯影。

1.3.3 3T3-L1 脂肪細(xì)胞培養(yǎng)：3T3-L1 前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化。小鼠 3T3-L1 前脂肪細(xì)胞在含有 10%（v/v）NCS 和 100 U/ml 雙抗的 DEME 培養(yǎng)液中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90% 傳代接種到6 孔板，調(diào)整密度5×105，接觸抑制2 天，計(jì)為誘導(dǎo)分化0 天。替換為新鮮培養(yǎng)液 DMEM + 10%FBS（2.5 m l/孔），分組加入誘導(dǎo)劑A（IBMX 0.5 mmol/L，胰島素10 mg /L，地塞米松1.0μmol /L），混勻，3 天后換誘導(dǎo)劑B（胰島素10mg/L），繼續(xù)培養(yǎng)2 天，換基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM+10%FBS，培養(yǎng)至11 天，誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞。

3T3-L1 前脂肪細(xì)胞在37℃，5ml/dl CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況定期更換培養(yǎng)液，將3T3-L1 前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)3 ～4 天，融合率將達(dá)到80%以上，胰蛋白酶消化進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3.4 3T3-L1 脂肪細(xì)胞的生長(zhǎng)觀察：采取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)細(xì)胞系，胰酶消化后，在24 孔培養(yǎng)板中每孔接種5×103個(gè)細(xì)胞，并置于5ml/dl CO2，37℃恒溫培養(yǎng)箱中；每24h 隨機(jī)選擇3 孔細(xì)胞，消化后對(duì)其進(jìn)行計(jì)數(shù)，并連續(xù)計(jì)數(shù)8 天，每天獲取細(xì)胞數(shù)的平均值，以細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，以天數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.3.5 3T3-L1 脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)：將3T3-L1 脂肪細(xì)胞接種到96 孔板中，誘導(dǎo)分化至第8 天后分別添加Visfatin，Chemerin 過(guò)表達(dá)及其空載體對(duì)照慢病毒培養(yǎng)5 天，通過(guò)葡萄糖氧化酶法分別測(cè)定各孔的葡萄糖含量，測(cè)定510nm 處的吸光度值（A值）。①?gòu)目瞻卓祝o(wú)細(xì)胞接種的孔）中的糖含量平均值中減去培養(yǎng)液中葡萄糖含量的平均值以獲得葡萄糖消耗。在一瓶葡萄糖工作劑中加入100ml 去離子水并充分混合； ②用1ml 工作溶液取幾支試管，分別從標(biāo)準(zhǔn)液及 96 孔板的每個(gè)孔取 8μl 培養(yǎng)液加入含有 l ml 工作液的試管中混合均勻，置于37℃恒溫水浴20min；從每個(gè)試管中取100μl 混合溶液加入96 孔板中；③計(jì)算測(cè)試溶液的葡萄糖濃度。葡萄糖濃度（mmol / L)=（待測(cè)液A值/標(biāo)準(zhǔn)液A值)×5.5mmol/L；葡萄糖消耗率（%）=干預(yù)組消耗葡萄糖/對(duì)照組消耗葡萄糖×100%，重復(fù)相同實(shí)驗(yàn)3 次，取平均值。

1.3.6 3T3-L1 脂肪細(xì)胞增殖的MTT 法：3T3-L1前脂肪細(xì)胞接種到96 孔培養(yǎng)板中，接種密度為1×104個(gè)/孔。細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，計(jì)數(shù)每孔的細(xì)胞數(shù)，添加Visfatin，Chemerin 過(guò)表達(dá)及其空載體對(duì)照慢病毒進(jìn)行MTT 實(shí)驗(yàn)。吸棄原培養(yǎng)液，用1×PBS 洗滌，加入5mg / ml MTT 溶液10μl/孔，37℃孵育4h，吸出上清液，并向每個(gè)孔中加入150μl 二甲基亞砜。檢測(cè)490nm 波長(zhǎng)處的A值。

1.3.7 Western-blot 檢測(cè)Akt 及pAkt(Ser 473)蛋白：提取細(xì)胞的總蛋白：吸出培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，在每個(gè)孔中加入在4℃預(yù)冷的Hank’s 溶液0.5ml 洗滌細(xì)胞三次。每10μl 100mmol/L PMSF 加入1ml 裂解緩沖液，并在冰上搖勻。向每個(gè)孔中加入500μl 含PMSF 的裂解緩沖液冰上裂解30min，在4℃的冰箱中以12 000r/min 離心5min，分離上清，并保存在-20℃的冰箱中備用。BCA 法確定蛋白質(zhì)濃度。蛋白通過(guò)SDS-PAGE 電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用TBST 沖洗，在室溫下使用5g/dl 脫脂奶粉封閉1 h，添加兔抗人一抗工作液TBST 稀釋（Akt 1:1 000，pAkt 1:1 000），并在4℃條件下孵育過(guò)夜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗工作液(l:4 000)，并在37℃下孵育1h，TBST 漂洗，顯影。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21.0軟件，兩組的FPG，F(xiàn)ins，HbA1c，HOMA-IR，TC，TG測(cè)定值等數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間對(duì)比采用t檢驗(yàn)；Visfatin，Chemerin水平與HOMA-IR 測(cè)定值的相關(guān)性分析采用Pearson 法；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GDM 組和NGT 組的血糖、血脂代謝指標(biāo)比較 見(jiàn)表1。GDM 組的FPG，F(xiàn)ins，HbA1c，HOMA-IR，TC 和TG 測(cè)定值均高于NGT 組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；GDM 組和NGT組的HDL-C，LDL-C，ALB 測(cè)定值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

表1 GDM 組和NGT 組的血糖、血脂代謝指標(biāo)比較（±s）

表1 GDM 組和NGT 組的血糖、血脂代謝指標(biāo)比較（±s）

指 標(biāo)GDM 組（n=100）NGT 組（n=100）t 值P 值FPG（mmol/L）5.84±0.524.61±0.4018.749＜0.001 Fins（μU/ml）18.96±3.7512.53±2.2014.789＜0.001 HbA1c（%）6.42±0.895.31±0.709.803＜0.001 HOMA-IR2.48±0.661.51±0.4212.399＜0.001 TC（mmol/L）5.22±0.574.86±0.494.789＜0.001 TG（mmol/L）2.41±0.432.18±0.344.196＜0.001 HDL-C（mmol/L）1.64±0.221.70±0.24-1.843 0.067 LDL-C（mmol/L）3.23±0.673.10±0.541.511 0.132 ALB（g/L）37.84±3.0238.44±3.30-1.341 0.181

2.2 GDM 組和NGT 組的血清、臍血、胎盤(pán)組織中的Visfatin，Chemerin 測(cè)定值比較 見(jiàn)表2，圖1。GDM 組的血清、臍血、胎盤(pán)組織中的Visfatin，Chemerin 測(cè)定值均高于NGT 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

圖1 GDM 組和NGT 組的血清、臍血、胎盤(pán)組織中的Visfatin，Chemerin 免疫印跡檢測(cè)結(jié)果

表2 GDM 組和NGT 組的血清、臍血、胎盤(pán)組織中的Visfatin，Chemerin 測(cè)定值比較（±s）

表2 GDM 組和NGT 組的血清、臍血、胎盤(pán)組織中的Visfatin，Chemerin 測(cè)定值比較（±s）

樣本 指標(biāo) GDM 組（n=100）NGT 組（n=100）t 值P 值血清 Visfatin（pg/ml）10.55±2.416.39±1.0515.825＜0.001 Chemerin（ng/ml）233.0±47.6155.7±30.613.660＜0.001臍血 Visfatin（pg/ml）9.87±2.266.11±0.9415.361＜0.001 Chemerin（ng/ml）438.1±95.0218.7±76.817.960＜0.001胎盤(pán)組織 Visfatin（/βactin）0.421±0.0930.235±0.07415.650＜0.001 Chemerin（/βactin）1.338±0.2070.905±0.15216.861＜0.001

2.3 GDM 組血清、臍血、胎盤(pán)組織中的Visfatin，Chemerin 測(cè)定值與HOMA-IR 的相關(guān)性 GDM組的血清、臍血、胎盤(pán)組織中的Visfatin(r=0.401,P＜0.001；r=0.386,P=0.001；r=0.357,P=0.003)，Chemerin(r=0.0.357,P=0.007；r=0.583,P＜0.001；r=0.496,P＜0.001)水平與HOMA-IR 測(cè)定值均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。

2.4 Chemerin，Visfatin 過(guò)表達(dá)與3T3-L1 脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗量、細(xì)胞增殖的關(guān)系 見(jiàn)表3。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，Chemerin 過(guò)表達(dá)組、Visfatin 過(guò)表達(dá)組的3T3-L1 脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗量均低于Chemerin空載組、Visfatin 空載組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Chemerin 過(guò)表達(dá)組、Visfatin 過(guò)表達(dá)組的3T3-L1 脂肪細(xì)胞增值A(chǔ)值高于Chemerin 空載組、Visfatin 空載組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 Chemerin、Visfatin 過(guò)表達(dá)與3T3-L1 脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗量、細(xì)胞增殖的關(guān)系（±s）

表3 Chemerin、Visfatin 過(guò)表達(dá)與3T3-L1 脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗量、細(xì)胞增殖的關(guān)系（±s）

過(guò)表達(dá)指標(biāo)Chemerin 過(guò)表達(dá)組Chemerin 空載組t 值P 值Chemerin 葡萄糖消耗量（mmol/L）3.38±1.045.72±1.57-12.175＜0.001 3T3-L1 脂肪細(xì)胞增殖（A 值）1.104±0.3470.865±0.2715.319＜0.001 Visfatin 葡萄糖消耗量（mmol/L）3.14±0.985.80±1.62-13.765＜0.001 3T3-L1 脂肪細(xì)胞增殖（A 值）1.122±0.3160.875±0.2476.034＜0.001

2.5 Chemerin，Visfatin 過(guò)表達(dá)與3T3-L1 脂肪細(xì)胞中Akt，pAkt 蛋白表達(dá)情況比較 見(jiàn)表4。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，Chemerin 過(guò)表達(dá)組、Visfatin 過(guò)表達(dá)組Akt，pAkt 蛋白相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度低于Chemerin 空載組、Visfatin 空載組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 Chemerin，Visfatin 過(guò)表達(dá)與3T3-L1 脂肪細(xì)胞中Akt，pAkt 蛋白表達(dá)情況比較（±s，/βactin）

表4 Chemerin，Visfatin 過(guò)表達(dá)與3T3-L1 脂肪細(xì)胞中Akt，pAkt 蛋白表達(dá)情況比較（±s，/βactin）

類 別Chemerin 過(guò)表達(dá)組Chemerin 空載組t 值P 值Chemerin Akt 蛋白1.319±0.2081.649±0.233-10.352＜0.001 pAkt 蛋白1.028±0.2111.421±0.265-11.367＜0.001 Visfatin Akt 蛋白1.284±0.1951.628±0.202-12.005＜0.001 pAkt 蛋白1.007±0.1861.443±0.193-15.938＜0.001

3 討論

3.1 GDM 研究現(xiàn)狀 目前GDM 的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，有學(xué)者認(rèn)為，IR 和妊娠期胰島β細(xì)胞功能的不足可能是GDM 發(fā)病機(jī)制中的兩個(gè)關(guān)鍵因素[7-8]。GDM 和肥胖癥具有許多相似的病理生理特征，例如脂肪營(yíng)養(yǎng)不良、葡萄糖耐量降低和高凝性。這種生理變化與脂肪細(xì)胞分泌的某些因素有關(guān)，研究脂肪細(xì)胞因子可對(duì)進(jìn)一步探討GDM 的發(fā)病機(jī)制有所幫助。

3.2 GDM 與血糖、血脂代謝指標(biāo)的關(guān)系 本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)PG，F(xiàn)ins，HbA1c，HOMA-IR，TC，TG 指標(biāo)與GDM 有一定的聯(lián)系，對(duì)GDM 的診斷具有重要的臨床價(jià)值。FINS 與孕婦的血糖水平和胰島功能有直接關(guān)系，也可以反映胰島素抵抗，其水平越高，胰島素抵抗越強(qiáng)，不利于人體對(duì)高血糖水平的有效調(diào)節(jié)，引起血脂和血糖代謝紊亂，這很容易發(fā)生GDM。HbA1c 是糖尿病監(jiān)測(cè)最佳指標(biāo)之一，是葡萄糖和血紅蛋白在體內(nèi)通過(guò)不可逆和非酶促反應(yīng)結(jié)合而成的糖蛋白，與人體血糖水平呈正相關(guān)，可以有效反映血糖水平，靈敏度高[9]。HOMA-IR是評(píng)估胰島素敏感性的指標(biāo)。

3.3 Chemerin，Visfatin 過(guò)表達(dá)與3T3-L1 脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗量、細(xì)胞增殖的關(guān)系 本研究中，GDM 組的血清、臍血和胎盤(pán)組織中的Visfatin，Chemerin 測(cè)定值均明顯高于NGT 組。推測(cè)Visfatin和Chemerin 可能參與胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)節(jié)，并且Visfatin和Chemerin 可能作為保護(hù)因子，是機(jī)體對(duì)高血糖應(yīng)激狀態(tài)的代償反應(yīng)，在胰島素缺乏的情況下，Visfatin和Chemerin水平增加可能對(duì)GDM 患者具有保護(hù)作用。Chemerin 是一種以非活性的pro-chemerin 前體形式分泌的蛋白質(zhì)，pro-chemerin 的生物學(xué)活性非常低，需要被細(xì)胞外凝血酶、纖溶酶和炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)裂解，以形成具有生物活性的16kDa Chemerin 發(fā)揮生物學(xué)功能[10]。研究表明[11]，Chemerin 與受體結(jié)合后它可以在調(diào)節(jié)脂肪分化、產(chǎn)生和代謝、參與炎癥、先天免疫和調(diào)節(jié)糖代謝方面發(fā)揮生物學(xué)作用。研究表明[12]，Visfatin 可以由孕婦、胎兒組織和胎兒附屬物產(chǎn)生和分泌，這是婦女在懷孕期間適應(yīng)性變化和胎兒生長(zhǎng)發(fā)育的重要調(diào)節(jié)劑。關(guān)于Visfatin 在胎盤(pán)組織中表達(dá)的研究相對(duì)較少。在正常妊娠中，Visfatin 在羊膜上皮細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞和胎膜頂蛻膜中表達(dá)，并隨著胎齡的增加其表達(dá)也增加[13]，Visfatin和Chemerin 參與胰島素抵抗的過(guò)程，胰島素抵抗與肥胖密切相關(guān)。Visfatin和Chemerin 的增加可能是機(jī)體的代償性增加以適應(yīng)全身性代謝紊亂，而其水平的增加可以幫助改善胰島素抵抗。妊娠糖尿病的發(fā)病機(jī)理尚未完全了解，目前認(rèn)為胰島素抵抗和慢性低水平炎癥在妊娠糖尿病的發(fā)病機(jī)理中起著非常重要的作用[14]。脂肪組織是人體的主要能量?jī)?chǔ)備器官和體內(nèi)最大的內(nèi)分泌器官，參與肥胖、糖和脂類代謝，是發(fā)生胰島素抵抗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[15]。脂肪細(xì)胞功能缺陷導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生，3T3-L1 前脂肪細(xì)胞是具有單個(gè)分化潛能的細(xì)胞系，可以在體外誘導(dǎo)分化為成熟的脂肪細(xì)胞，可以更好地模擬脂肪細(xì)胞的分化[16-17]。因此，3T3-L1 前脂肪細(xì)胞株廣泛用于與糖和脂質(zhì)代謝有關(guān)的研究。在該實(shí)驗(yàn)中，成功培養(yǎng)了3T3-L1 前脂肪細(xì)胞，為下一步Visfatin，Chemerin 對(duì)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞的干預(yù)及進(jìn)一步的機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)。葡萄糖消耗是指整個(gè)細(xì)胞在正常生理活動(dòng)的一定時(shí)期內(nèi)將葡萄糖轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)的能力，可以用于評(píng)價(jià)所有與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝有關(guān)的蛋白質(zhì)功能[18]。本研究顯示，Visfatin，Chemerin 可能導(dǎo)致脂肪細(xì)胞葡萄糖利用減少，發(fā)生胰島素抵抗，但與脂肪細(xì)胞葡萄糖的利用、干擾胰島素信號(hào)通路的關(guān)系需要進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，觀察3T3-L1 脂肪細(xì)胞增殖生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)Chemerin，Visfatin 可能具有促進(jìn)前脂肪細(xì)胞增殖的作用，驗(yàn)證本研究的猜想。

3.4 Chemerin，Visfatin 過(guò)表達(dá)與3T3-L1 脂肪細(xì)胞中Akt，pAkt 蛋白表達(dá)情況的分析 胰島素與相應(yīng)的受體結(jié)合后，可以激活下游信號(hào)[19]，參與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、糖異生抑制、糖原合成、糖酵解、蛋白質(zhì)合成等過(guò)程[20]。AKT 通過(guò)調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收，通過(guò)調(diào)節(jié)糖原合酶激酶3 來(lái)促進(jìn)糖原合成[21]。因此，AKT 活性的調(diào)節(jié)將對(duì)細(xì)胞葡萄糖代謝產(chǎn)生重要影響。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，Chemerin 過(guò)表達(dá)組、Visfatin 過(guò)表達(dá)組Akt，pAkt 蛋白相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度明顯低于Chemerin 空載組和Visfatin 空載組。提示Visfatin和Chemerin 可能通過(guò)調(diào)控胰島素信號(hào)通路中Akt的表達(dá)水平導(dǎo)致胰島素抵抗。相應(yīng)機(jī)制可能是pAkt 的降低導(dǎo)致其下游葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT4 向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)減少，糖原合成酶激酶3（GSK3）絲氨酸位點(diǎn)磷酸化降低，活性增強(qiáng)，肝糖原合成抑制，轉(zhuǎn)錄因子PGC-1α 的磷酸化降低，增加糖原輸出。

本研究首次聯(lián)合Visfatin，Chemerin水平變化與胰島素抵抗、肥胖的關(guān)系進(jìn)行研究，探討二者在妊娠糖尿病發(fā)病中的作用及機(jī)制，并且本研究證實(shí)Visfatin，Chemerin 可能通過(guò)調(diào)節(jié)Akt，pAkt 蛋白表達(dá)影響 3T3-L1 脂肪細(xì)胞的增殖及糖脂代謝，這為后期GDM 患者胰島素抵抗的發(fā)生及早期預(yù)測(cè)提供了參考，有利于診斷和治療，具有較好的研究?jī)r(jià)值。但本研究存在一定的不足，樣本量較少可能影響研究結(jié)果，可以進(jìn)一步加大樣本進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，GDM 患者血清、臍血、胎盤(pán)組織中Visfatin，Chemerin表達(dá)水平顯著升高，并且與胰島素抵抗有正相關(guān)性，其作用機(jī)制可能與下調(diào)Akt，pAkt 蛋白表達(dá)有關(guān)。