楊飏 廖瑩瑩 陳福濤

連云港市第二人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，連云港 222000

肺癌仍然是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因［1-2］。肺鱗狀細(xì)胞癌和肺腺癌是非小細(xì)胞肺癌的兩個(gè)主要亞型，肺腺癌約占肺癌的40%［3-5］。在過(guò)去的幾十年里，盡管肺鱗狀細(xì)胞癌的治療已經(jīng)取得了較大進(jìn)展，但肺腺癌患者的生存率無(wú)顯著提高。

非SMC 凝聚素I 復(fù)合亞基G（NCAPG），也稱為CAPG、YCG1 或NY-MEL-3，位于4 號(hào)染色體4p15.31。NCAPG 蛋白由1 015 個(gè)氨基酸組成，含有非SMC 縮合復(fù)合物的亞基，并在細(xì)胞有絲分裂和減數(shù)分裂過(guò)程中穩(wěn)定染色體結(jié)構(gòu)［6］。NCAPG 是縮合復(fù)合物的關(guān)鍵亞基，它在I 型拓?fù)洚悩?gòu)酶存在下將正超螺旋DNA 轉(zhuǎn)化為解螺旋態(tài)［7］。最近的研究表明，NCAPG 在多種類型的腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移。

細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）是絲氨酸/蘇氨酸激酶，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的能力。CDK1 是CDK 家族中最重要的蛋白質(zhì)，可以促進(jìn)多種類型癌細(xì)胞的細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換。并且，多項(xiàng)研究證實(shí)CDKs在肺腺癌組織中過(guò)度表達(dá)［8-11］。

資料與方法

1、TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析

使用R 語(yǔ)言分析繪制TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中肺腺癌患者的NCAPG mRNA 基因表達(dá)箱式圖。mRNA包用于獲取每個(gè)樣本中NCAPG mRNA 的表達(dá)數(shù)據(jù)，dplyr 包用于數(shù)據(jù)整理，ggplot2 和ggsignif 包分別用于基因表達(dá)箱線圖的繪制和統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。

2、預(yù)后分析

通過(guò)GEPIA工具（http：//gepia.cancer-pku.cn/）在線繪制總生存期（OS）和無(wú)病生存期（DFS）。根據(jù)基因表達(dá)中位數(shù)、95%置信區(qū)間將肺腺癌患者分為NCAPG 高表達(dá)組和NCAPG 低表達(dá)組。使用Kaplan-Meier 繪制生存曲線，并通過(guò)Log-rank 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3、免疫組織化學(xué)染色（IHC）

將石蠟包埋的組織切成4 μm 貼附于防脫載玻片。切片烘烤后，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水合。將載玻片浸入檸檬酸鹽緩沖液（pH=6.0）中并置于微波爐中加熱煮沸10 min進(jìn)行抗原修復(fù)。滴加內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫孵育10 min。加入山羊血清并在室溫下孵育15 min以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。棄去血清后，直接將NCAPG 或CDK1 抗體（NCAPG，1：100 稀 釋，ab251864，Abcam，Cambridge，UK；CDK1，1：100 稀釋，ab18，Abcam）滴加到切片中，置于濕盒，并在4 ℃孵育過(guò)夜。PBST洗滌后，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育15 min。PBS 洗滌后，加入DAB 顯色液進(jìn)行顯色。蘇木素復(fù)染后封片。

4、患者和組織標(biāo)本

收集2017 年1 月至2019 年12 月在連云港市第二人民醫(yī)院確診并接受手術(shù)治療的肺腺癌患者的腫瘤組織及鄰近正常組織110 份。所有標(biāo)本均經(jīng)過(guò)病理醫(yī)師確認(rèn)。收集的病例術(shù)前均未接受化療和放療。所有患者術(shù)前均簽署知情同意書，本研究經(jīng)連云港市第二人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

5、細(xì)胞培養(yǎng)和獲得穩(wěn)定敲低細(xì)胞系

人肺腺癌細(xì)胞系來(lái)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。所有細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清（FBS，04-007-1A，Biological Industries，Beit HaEmek，Israel）和1% 青 霉 素-鏈 霉 素（P1400，Solarbio，北京）的PRMI-1640（21870084，Thermo）中。慢病毒介導(dǎo)的敲低NCAPG 的慢病毒由Sangon（中國(guó)上海 ） 合 成 。 NCAPG 的 shRNA 序 列 為 ：5′-CCAGAACCAGGCGAAGCTGGTGG -3′，CDK1 的shRNA為：5′-ATCTACCATACCCATTGACTAAC-3′，陰 性 對(duì) 照 的shRNA 序 列 為：5′-CCGACAGCAACGTATCAGCTCGG-3′。將細(xì)胞以2×105的密度接種于6孔板中，12 h后，使用慢病毒感染細(xì)胞。24 h 后，在完全培養(yǎng)基中加入嘌呤霉素篩選陽(yáng)性細(xì)胞。

6、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）

使用Trizol 試劑（15596026，Invitrogen，Waltham，USA）提取細(xì)胞總RNA。隨后，使用First Strand cDNA SynthesisKit（K1621，Thermo，USA）將200 ng 總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。引 物 如 下 ： NCAPG 正 向 引 物 ：5′-GAGGCTGCTGTCGATTAAGGA-3′；NCAPG 反 向 引 物：5′-AACTGTCTTATCATCCATCGTGC-3′。β-actin 正 向 引物：5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，β-actin 反 向 引物：5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′。以β-actin 作為內(nèi)參基因進(jìn)行歸一化，使用2-ΔΔCt計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)。

7、蛋白質(zhì)印跡

收集細(xì)胞并使用RIPA 緩沖液提取總蛋白，使用Bradford 方法進(jìn)行蛋白定量。30 μg 總蛋白于10%SDS-PAGE 凝膠中電泳后，轉(zhuǎn)膜到PVDF 膜上。5%脫脂牛奶封閉1 h 后，加入一抗（NCAPG，1：1 000，ab251864，Abcam；β-actin，1：1 000，ab179467，Abcam），4 ℃孵育過(guò)夜。用TBST 緩沖液洗滌后，加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔的二抗（ab6721，Abcam，1：5 000 稀釋），室溫孵育1 h。然后使用ECL試劑顯色（32132，Thermo，USA）。

8、細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)

將1×103細(xì)胞接種于含有2 ml 完全培養(yǎng)基的6 孔板中。37 ℃，5% CO2培養(yǎng)14 d。使用1 ml 4%多聚甲醛固定細(xì)胞集落20 min后，結(jié)晶紫染色30 min。

9、CCK-8實(shí)驗(yàn)

將2×103細(xì)胞接種于含有200 μl 完全培養(yǎng)基的96 孔板中。37 ℃，5% CO2培 養(yǎng)3 d。然 后，每 孔 加 入20 μl CCK-8 試劑（ab228554，Abcam）孵育2 h。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度。每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔。

10、腫瘤異種移植瘤模型

18～22 g BALB/c 裸鼠購(gòu)自北京華阜康生物。5×106A549 細(xì)胞與150 μl PBS 緩沖液混合，注射于小鼠腹股溝皮下。3 d 測(cè)量1 次腫瘤的長(zhǎng)寬徑，體積計(jì)算公式為：腫瘤體積=長(zhǎng)×寬2/2［12］。

11、基因相關(guān)分析和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）

基于TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)采用Pearson 法計(jì)算基因相關(guān)系數(shù)。NCAPG 相關(guān)的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)使用STRING（https：//string-db.org/）進(jìn)行可視化。

12、免疫共沉淀（CO-IP）

將5 μg 特異性抗體和30 μl蛋白G-瓊脂糖珠進(jìn)行孵育形成復(fù)合體。收集107細(xì)胞進(jìn)行裂解，將細(xì)胞裂解物與抗體復(fù)合體在4 ℃下旋轉(zhuǎn)孵育2 h。然后，將珠子用1.5 ml 冰冷的PBS 洗滌3 次，95 ℃下加熱5 min 洗脫與珠子結(jié)合的蛋白質(zhì)。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分離和分析共沉淀的蛋白。

13、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 軟件（SPSS Inc，Chicago，IL，USA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用Log-rank 方法判定OS 和DFS 的統(tǒng)計(jì)差異。根據(jù)NCAPG 表達(dá)中位數(shù)將肺腺癌患者分為NCAPG 低表達(dá)和高表達(dá)組。采用卡方檢驗(yàn)評(píng)估110 例患者的臨床病理特征和NCAPG 的表達(dá)之間的相關(guān)性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1、肺腺癌組織中NCAPG mRNA 和蛋白質(zhì)的高表達(dá)與患者的不良預(yù)后相關(guān)

本研究下載分析了TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中肺腺癌和癌旁正常組織（包括483 個(gè)肺腺癌組織和347 個(gè)對(duì)照組織）的數(shù)據(jù)?；虮磉_(dá)箱線圖顯示，NCAPG 的mRNA 在肺腺癌中過(guò)表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1A）。根據(jù)肺腺癌中NCAPG 的表達(dá)中位數(shù)將腫瘤患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，分析患者的OS 和DFS，結(jié)果顯示，NCAPG 高表達(dá)的肺腺癌患者預(yù)后較差（圖1B，分別為P=0.000 16、0.009 50）。

然后，我們通過(guò)The Human Protein Atlas（https：//www.proteinatlas.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)分析了人類多種腫瘤組織中NCAPG蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NCAPG 在多種類型的腫瘤中高表達(dá)，如結(jié)直腸癌和肺癌（圖1C）。

圖1 NCAPG mRNA 和蛋白質(zhì)水平在肺腺癌中高表達(dá)，并與患者的不良預(yù)后相關(guān)。A：TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中肺腺癌患者的NCAPG mRNA表達(dá)水平。B：Kaplan-Meier 生存曲線顯示NCAPG 高表達(dá)組和低表達(dá)組之間的OS（P=0.000 16）和DFS（P=0.009 50）存在差異。C：The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫(kù)中NCAPG在多種類型人類腫瘤中的表達(dá)

2、NCAPG在肺腺癌組織中高表達(dá)并與臨床病理特征相關(guān)

為了進(jìn)一步檢測(cè)NCAPG 在肺腺癌組織中的表達(dá)，本研究通過(guò)IHC 評(píng)估了2016 至2018 年連云港市第二人民醫(yī)院110 例肺腺癌患者的NCAPG 表達(dá)（表1）。如圖2A 和圖2B所示，與正常肺組織相比，肺腺癌中NCAPG 的表達(dá)明顯上調(diào)，并且主要位于細(xì)胞質(zhì)中。同時(shí)我們獲取了患者的診治信息，包括年齡、性別、吸煙史、腫瘤大小、腫瘤分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。根據(jù)IHC 的結(jié)果，病理醫(yī)師將110例患者分為NCAPG 高表達(dá)組和低表達(dá)組?？ǚ綑z驗(yàn)顯示NCAPG 的表達(dá)與腫瘤大小和臨床分期相關(guān)（P=0.048、0.021）。

圖2 NCAPG 蛋白在110 例肺腺癌患者中過(guò)表達(dá)。A：IHC 檢測(cè)110例肺腺癌組織和鄰近正常組織；B：NCAPG蛋白表達(dá)，數(shù)據(jù)顯示NCAPG蛋白在肺腺癌組織中過(guò)表達(dá)

表1 110例肺腺癌患者不同NCAPG表達(dá)量與臨床病理特征之間的關(guān)系（例）

3、敲低NCAPG抑制A549和H1975細(xì)胞的增殖

為了研究NCAPG 在肺腺癌進(jìn)展中的具體機(jī)制，本研究在常見(jiàn)肺腺癌細(xì)胞中（NCI-H125、Calu-3、A549、H1975）檢測(cè)了其mRNA 和蛋白表達(dá)。如圖3A 和3B 所示，NCAPG 在A549 和H1975 細(xì)胞系中具有較高的表達(dá)。因此，選擇A549 和H1975 細(xì)胞系進(jìn)行機(jī)制研究。使用慢病毒介導(dǎo)的shRNA 敲低兩種細(xì)胞系中NCAPG 的表達(dá)，嘌呤霉素篩選以獲得穩(wěn)定敲低細(xì)胞，用于后續(xù)的體內(nèi)外驗(yàn)證。如圖3C和3D所示，在NCAPG-shRNA 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中，NCAPG mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)顯著降低。為了驗(yàn)證NCAPG 的表達(dá)是否與細(xì)胞增殖相關(guān)，進(jìn)行了細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)和增值實(shí)驗(yàn)。CCK-8 實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)敲低NCAPG 降低了肺腺癌細(xì)胞的增殖能力（圖3E）。另外，敲低NCAPG 顯著抑制了A549 和H1975的集落數(shù)量（圖3F）。

圖3 肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 和H1975 中敲低NCAPG 抑制細(xì)胞增殖。A：NCAPG 在多種肺腺癌細(xì)胞系中的mRNA 表達(dá)水平；B：NCAPG 在肺腺癌細(xì)胞系中的蛋白質(zhì)表達(dá)水平；C：使用qRT-PCR 檢測(cè)A549和H1975細(xì)胞系中敲低NCAPG 后其mRNA 表達(dá)量；D：使用免疫蛋白印跡檢測(cè)A549和H1975細(xì)胞系中敲低NCAPG后其蛋白質(zhì)表達(dá)量；E：CCK-8檢測(cè)敲低NCAPG后對(duì)A549和H1975細(xì)胞增殖能力的影響；F：集落形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證敲低NCAPG后對(duì)細(xì)胞集落形成的影響

4、NCAPG與CDK1相互作用促進(jìn)肺腺癌進(jìn)展

NCAPG 在肺腺癌中的分子功能尚不清楚。為了進(jìn)一步研究NCAPG 在肺腺癌進(jìn)展中的分子機(jī)制，我們通過(guò)STRING（https：//string-db.org/）使 用PPI 的 方 法 分 析 了NCAPG 的相關(guān)基因。PPI 網(wǎng)絡(luò)中共鑒定了27 種相關(guān)蛋白質(zhì)，例如細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1（CDK1），染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白家族（SMC，圖4A）?；诠脖磉_(dá)分析和先前的研究，我們發(fā)現(xiàn)CDK1 和NCAPG 表達(dá)顯著相關(guān)（預(yù)測(cè)分?jǐn)?shù)=0.999）。TCGA 肺腺癌數(shù)據(jù)庫(kù)的共表達(dá)分析結(jié)果表明，NCAPG 和CDK1 在肺腺癌組織中密切相關(guān)（P＜0.01，R=0.73，圖4B）。另外，通過(guò)我們收集的110例標(biāo)本的IHC染色分析進(jìn)一步證明了兩基因表達(dá)的相關(guān)性（表2）。另外，我們通過(guò)免疫共沉淀（CO-IP）實(shí)驗(yàn)確認(rèn)它們的結(jié)合（圖4C）。此外，蛋白質(zhì)印跡顯示A549 和H1975 細(xì)胞系中敲低CDK1 抑制了NCAPG 的表達(dá)（圖4D），表明CDK1 可能在肺腺癌進(jìn)展過(guò)程中調(diào)節(jié)NCAPG 的表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證表達(dá)相關(guān)性，我們對(duì)肺腺癌和正常組織的連續(xù)切片進(jìn)行了IHC 染色。與之前的結(jié)果一致，NCAPG 和CDK1在肺腺癌中高表達(dá)，在正常組織中低表達(dá)（圖4E）。

圖4 肺腺癌中NCAPG與CDK1相互作用促進(jìn)肺腺癌進(jìn)展。A：NCAPG在肺腺癌組織中的PPI分析；B：在TCGA肺腺癌數(shù)據(jù)庫(kù)中分析NCAPG 和CDK1 的共表達(dá)情況；C：通過(guò)CO-IP 測(cè)定在A549 細(xì)胞中NCAPG 和CDK1 之間的相互結(jié)合；D：A549 和H1975 細(xì)胞系中CDK1敲低抑制了NCAPG的蛋白質(zhì)表達(dá)；E：通過(guò)IHC分析NCAPG和CDK1在人肺腺癌連續(xù)組織切片中的共表達(dá)

表2 110例肺腺癌患者中NCAPG和CDK1表達(dá)相關(guān)性分析

5、NCAPG/CDK1促進(jìn)腫瘤進(jìn)展并與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)

我們進(jìn)一步檢索了TCGA 肺腺癌數(shù)據(jù)庫(kù)中CDK1 的mRNA 表達(dá)，結(jié)果顯示與正常組織相比，CDK1 在肺腺癌中顯著過(guò)表達(dá)，Kaplan-Meier 生存分析顯示CDK1 的表達(dá)水平與肺腺癌患者的OS 和DFS（圖5A、圖5B）均呈負(fù)相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)CDK1在多種惡性腫瘤中都有很高的表達(dá)，例如甲狀腺癌、結(jié)直腸癌和胃癌。數(shù)據(jù)顯示大約40%的肺腺癌患者表現(xiàn)為CDK1的高表達(dá)（圖5C）。另外，我們分析了腎癌、肝癌、胰腺癌和肺癌患者血清中CDK1 的表達(dá)情況，結(jié)果顯示血清中CDK1高表達(dá)的患者總生存率較差（圖5D）。這些數(shù)據(jù)可能表明NCAPG/CDK1促進(jìn)了肺腺癌的進(jìn)展。

圖5 CDK1 在多種腫瘤中高表達(dá)并與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。A：TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中肺腺癌組織中CDK1 的mRNA 表達(dá)箱線圖；B：肺腺癌患者CDK1 的Kaplan-Meier 生存分析；C：CDK1 在不同類型癌癥中的表達(dá)；D：腫瘤患者血清中CDK1 的表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)。數(shù)據(jù)來(lái)自Proteinatlas（https://www.proteinatlas.org）

討 論

惡性腫瘤的特征是不受控制的細(xì)胞增殖［13］。凋亡或增殖基因的突變或拷貝數(shù)變化影響細(xì)胞分裂和分化。雖然多種治療方法不斷取得進(jìn)展，提高了肺腺癌患者的生存率，但晚期患者的預(yù)后仍然較差。研究與肺腺癌細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白質(zhì)有利于開發(fā)新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

NCAPG 作為凝集素Ⅰ的亞基，對(duì)維持染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性至關(guān)重要［14］。凝集素家族有兩個(gè)成員：凝集素Ⅰ和凝集素Ⅱ。凝集素Ⅰ和凝集素Ⅱ在有絲分裂中發(fā)揮不同的作用。凝集素Ⅰ在有絲分裂間期存在于細(xì)胞質(zhì)中，并在核膜破裂（NEBD）后進(jìn)入染色體［15-19］。凝集素Ⅱ在有絲分裂間期存在于染色體中并介導(dǎo)染色體的早期壓縮［20-24］。NEBD后，凝聚素Ⅰ參與進(jìn)一步的染色體收縮以促進(jìn)有絲分裂。

研究表明，NCAPG 參與了多種腫瘤的發(fā)病機(jī)制，包括前列腺癌［25-27］、肝細(xì)胞癌［28-30］、結(jié)直腸癌［31-32］、子宮內(nèi)膜癌［33-34］、腎透明細(xì)胞癌［35-37］。通過(guò)生物信息學(xué)方法，我們發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織中NCAPG 的mRNA 和蛋白質(zhì)過(guò)表達(dá)。通過(guò)Kaplan-Meier 分析，我們發(fā)現(xiàn)腫瘤標(biāo)本中NCAPG 高表達(dá)的患 者OS 和DFS 較 差。Li 等［38］通 過(guò) 對(duì) 來(lái) 自GSE19188 和GSE33532的76個(gè)肺腺癌組織和配對(duì)正常組織的分析，鑒定了8 個(gè)與預(yù)后高度相關(guān)的基因，其中包括NCAPG。線性預(yù)后模型和多變量Cox 回歸分析表明，NCAPG 高表達(dá)的患者OS較差。該結(jié)論在連云港市第二人民醫(yī)院110例肺腺癌患者中得到進(jìn)一步驗(yàn)證。

為了進(jìn)一步研究NCAPG 促進(jìn)肺腺癌進(jìn)展的機(jī)制，我們建立了穩(wěn)定敲低NCAPG 的肺腺癌細(xì)胞系。我們首先進(jìn)行了集落形成和CCK-8實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)顯示NCAPG 促進(jìn)了肺腺癌細(xì)胞增殖。與我們的結(jié)果相似，NCAPG 在體外和體內(nèi)促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖［28，39-40］。

CDK1 是種間高度保守的蛋白質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂。CDK1促進(jìn)了腫瘤進(jìn)展并與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。通過(guò)PPI和共表達(dá)分析，我們發(fā)現(xiàn)CDK1 和NCAPG 在肺腺癌組織中可能存在相互作用。腫瘤組織和對(duì)照組織連續(xù)切片IHC 實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明CDK1和NCAPG具有表達(dá)相關(guān)性。

NCAPG 已在多種類型的癌癥中被確認(rèn)為致癌基因。此前，研究人員使用生物信息學(xué)方法證明NCAPG 是影響LUAD 預(yù) 后 的 因素［38］。我們首次驗(yàn)證了NCAPG 通過(guò)與CDK1 的相互作用促進(jìn)細(xì)胞增殖。因此，NCAPG 可作為肺腺癌預(yù)后不良的標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突