李立巍

桂林市疾病預防控制中心，桂林 541001

革蘭氏陰菌中之一的沙門菌，屬于腸道細菌科沙門氏菌類別，對不同血清感染的各種動物造成的各種病癥被稱為沙門菌病，常見的是誤食各種發(fā)霉變質的食物造成的中毒，造成中毒的病菌，其中就包括沙門菌。接近90%是肉類、蛋類、奶類等畜牧產品［1］。此類畜牧產品具有較為豐富的營養(yǎng)元素，大大有利于沙門菌在此類產品中的生長繁殖。不僅如此，沙門菌的適應能力與生命力都較為頑強，可以在一定處于外部環(huán)境的食品中生存幾個月之久。其不僅可以感染動物，還可以導致食用了大量沙門菌食物的人類受到侵害而引發(fā)食物中毒，是導致人類與牲畜之間共同患病的原因其一，在醫(yī)學上有著極強的代表性。同時對食物的安全性具有嚴重的威脅性［2-3］。

目前沙門菌的檢測方式更多是采用傳統(tǒng)的檢測方式，不僅周期性長，而且相對復雜繁瑣。因此，針對沙門菌的檢測如何實現(xiàn)快速且有效的檢測技術研究具有重要的實用意義。隨著生物科學技術的發(fā)展，依靠免疫學與生物學為標準的技術應用將進一步細菌細分檢測范疇［4-5］。聚合酶鏈式反應（PCR）技術的廣范應用，不僅進一步提高了對細菌的檢測速度，而且還具有較為準確的檢測結果依據(jù)。PRC技術不但可以從定性與定量兩個維度進行檢測，還有利于快速檢測體系的建立與進一步提高檢測反應靈敏度，其核心在于選擇被檢測目標的基因［6-7］。

沙門菌等致病菌概述

此類病菌是依附在人類與動物消化系統(tǒng)中的生化反應，與革蘭陰性桿菌的抗原構成較為相似，是導致消化系統(tǒng)腸道患病的病菌之一，造成的疾病大致由兩類組成：第一種是傷寒與副傷寒，第二種是較為常見的急性腸胃炎。據(jù)統(tǒng)計，全國范圍內由沙門菌造成的食物中毒數(shù)量位列第1 位，其中細菌導致的食物中毒，大部分是沙門菌造成的；食品類別中進一步細分，肉類等占據(jù)絕對核心原因，因其富含更多種類的人體所需的營養(yǎng)元素，更有利于沙門氏菌的繁衍。如果食用帶有大于一定數(shù)量的沙門菌的肉類食品，將造成人體被感染。沙門菌是公共衛(wèi)生學上具有重要意義的人畜共患病之一［8-9］。沙門菌污染的食物被人類與動物食用，是該疾病重要的感染方式之一。

沙門菌檢驗技術

血液與排泄物是用于臨床提取檢測樣本的基礎，常用于已被感染的對象進行沙門菌的檢測，食品安全檢測原理與臨床病料中實質性是相同的。但在食品檢測分析應用中是受到因素制約的，首先是兩者的沙門菌的含量是不同的，食品中的含量遠遠低于臨床病料；其次食品本身易受到其他病原的干擾；最后經過人工處理的食品，經過外部因素干擾的作用，會導致沙門菌受到損傷或者細菌死亡［10-11］。傳統(tǒng)檢測方式具有檢測時間長、反應過程繁瑣、反應試劑較多以及靈敏度低等不足，而且檢測方式是通過表面抗原，研究判斷生化反應和血清學實驗進行檢測［12］。隨著生物科學技術的快速發(fā)展，在實踐中不斷優(yōu)化與提升檢測手段，可以在更短時間內檢測出目標檢測物的結果，這類方式被稱為快速檢測。該檢測技術對沙門菌以及其他樣品病原PCR方法的專業(yè)體系已得到廣泛的應用。

PCR技術

1、PCR概述

PCR 技術又稱聚合酶鏈式反應，其原理是將指定的DNA 片段通過PCR 技術將其放大增多的技術方式，可理解為將提取的DNA 樣本重新進行循環(huán)復制，將少量的DNA 進行更進一步的增多，這是PCR 的核心技術特征。PCR 是1985 被發(fā)明出來，其發(fā)明者是美國的專家Mullis，標志著此項技術的問世。PCR 儀是由聚合酶衍生而出的控制溫度的技術設備，可以精準控制溫度的變化過程，從而達到檢測樣本目的。

特異性強、靈敏度高、迅速精準、自動化程度高等是PCR 的特點，以驚人的速度被廣泛應用，目前已經廣泛應用于多個專業(yè)領域，同時又結合其他相關技術衍生出更多的PCR 技術［13-14］。PCR 技術原理是依托以單鏈DNA 為檢測樣品，基于檢測需要的環(huán)境條件下，采用人工合成品為引物，基于PCR 技術手段進行增加檢測樣品DNA 的方式。這個過程主要分為3 個步驟：第一是高溫變性，第二是低溫復性，第三是適溫延伸。3個環(huán)節(jié)流程為一個單位，循環(huán)往復，從而實現(xiàn)增多DNA 的目的。在整個PCR 實驗過程中，需要重點關注的是因為溫度變化會導致實驗目標樣本DNA 聚合酶喪失活性，需要在每次循環(huán)過程中進行補充增活操作，確保實驗結果的精準有效性。此類實驗檢測方法存在一定不足，因此對PCR 的廣泛普及與未來空間形成一定制約［15-16］。

2、PCR技術在沙門菌檢測中的應用

⑴沙門菌檢測技術一般可分為常規(guī)PCR、多重PCR、套式PCR。以上方法可單獨運用，也可多種檢測手段相結合，從而提高受檢目標結果的精準度。

⑵常規(guī)PCR是根據(jù)特定提取物目標樣品的特異保守序列設計引物，對待檢樣本DNA 進行擴增，通過對擴增終產物進行定量及定性分析，此方式具備靈敏度高、特異度好、檢測周期短、簡單便捷等特點［17-18］。但此技術同時也存在一定不足之處，例如出現(xiàn)假陽性的結果以及由于存在使用不同引物的情況，可能對檢測實驗結果造成一定的影響，造成結果的偏差性。因此，在利用PCR技術進行實驗時，需要更為謹慎與專業(yè)的操作，嚴格按照要求進行實驗，確保最終實驗結果的精準性。詹銘等［19］通過檢測目標樣本中沙門菌的hilA 基因用作引物，擴增片段在497 by，進一步縮短檢測結果的同時又提升精準度和靈敏度。汪琦等［20］通過invA的目的基因利用PCR 技術手段，在48 h 即可得出明確結果。把生肉、加工雞肉、全脂乳粉列為研究樣品，通過沙門菌的人工操作干預，檢測結果與傳統(tǒng)方式和BAx（r）系統(tǒng)檢測結果相同，最終結果檢出限是100 cfu/25 g，準確率達到100%。雖然通過PCR 技術手段進行檢測，具有迅速、精準、周期短等優(yōu)勢，不過不足之處也較為明顯，就是對于細菌是無法區(qū)別是否擁有活性?；钚约毦菍κ澄镏卸镜戎虏【鷣碚f檢測的意義。常規(guī)PCR 在檢測中容易受到污染，影響檢測結果的精準性，不過目前伴隨著PCR技術的迅速提升，影響檢測結果精準性易受污染的因素已經消除。

⑶多重PCR 與常規(guī)PCR 只能針對1 對引物的優(yōu)勢在于可以增加2對以上引物，可實現(xiàn)增強DNA 的反應，此類方式與其他檢測方式（常規(guī)PCR）在多個方面具有高度一致性，而且擁有更高效、更便利、成本低等優(yōu)勢。沙門菌等致病菌的檢測手段上多重PCR 已被廣泛運用，大大提高了檢測速度；但多重PCR 檢測手段也存在一定劣勢，靈敏度、效率等低于常規(guī)PCR 檢測手段［21］。因此，突破現(xiàn)有檢測條件是大家所面對的問題，也是一起尋找研究解決的難點，把多種影響因素優(yōu)化排查，最終建立適宜的多種PCR反應體系。

⑷實時熒光定量PCR：1996 年美國Applied Biosystems公司率先使用，在PCR反應體系中添加熒光基團，借助熒光信號積累實時觀察PCR 反應過程，把標準曲線與被檢測目標物通過定量分析方式的檢測手段被稱為實時熒光定量PCR 技術。此項技術的問世，完成了PCR 由定性到定量質的跨越。比常規(guī)PCR 具有更多優(yōu)勢，不僅解決了PCR 易受到污染的問題，而且具備更強的特異性與更高的自動化程度等特點，現(xiàn)在已經大規(guī)模用于沙門菌檢測領域。岳昌武等［22］通過此技術，已經實現(xiàn)迅速、有效、精準地檢測出目標物中沙門菌，而且靈敏度已經達到10 cfu/g，所需的檢測時間僅4～10 h，即可對目標樣本得出精準的檢測結果。鄭友限等［23］以食物和實驗細菌為實驗目標樣本，實驗采用實時熒光定量方式獲得實驗結果，與其他檢測技術手段進行對比，此檢測技術靈敏度可達102 cfu/ml，而且可在24 h 內獲得精準結果，因此針對沙門菌的檢測技術手段又取得更進一步的發(fā)展。鐘偉軍等結合熒光定量PCR實驗所需的條件與自身特征的進一步研究，利用進行編碼的實驗目標，結合實驗引物等相關需求，重新建立了新的實驗檢測方法。方平等［24］利用其他物質的特定性質，可精準進行沙門菌特征的結果反應，利用溫度調節(jié)方式，從而實現(xiàn)細菌的識別分類，達到畜牧產品中沙門菌的檢測識別技術，通過兩種肉類目標樣品實驗得出結論，其靈敏度分別是13、12 cfu/25 g，而整個檢測時間周期可在10 h內完成，此檢測方式擁有方便、快捷、特異性強、靈敏度高等優(yōu)勢，但此檢測方式也有檢測成本高、檢測設備要求高等不足。

結語

綜上所述，針對沙門菌等致病菌檢測技術中，具備簡便快捷、準確、高效等特征的PCR手段是主要應用之一，目前已經被廣泛應用，其具備的與傳統(tǒng)檢測手段不可相比的優(yōu)勢，尤其是近幾年發(fā)展中迅速崛起的熒光定量PCR技術，不僅能大大縮短檢測時間，而且還能進一步提高檢測結果的精準度。隨著科技水平的迅猛發(fā)展，以后將會有更多的新科技、新技術、新手段來助力沙門菌檢測技術的迭代更新，并得到廣泛普及與運用。雖然PCR傳統(tǒng)檢測方式與新技術相比存在很多不足，但依然在疾病的診斷與衛(wèi)生學評價中占有不可或缺的一席之地。不論是哪種技術手段在實際運用中都會受到各種條件的約束，因此未來還需廣大科研人員共同在PCR技術檢測沙門菌等致病菌的方面進行更進一步的探討。