彭淑瑩 王澤騎 陳立強(qiáng)

肇慶醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，肇慶 526060

2 型糖尿病患者由于血糖利用障礙導(dǎo)致高糖高胰島素血癥的發(fā)生。前期研究證明胰島素與胰島素樣生長因子-1 等激素對胰腺β 細(xì)胞有反饋抑制功能，因此胰腺分泌胰島素的能力進(jìn)一步下降。至今胰島素分泌的囊泡運輸分子機(jī)制還未完全闡明，因此深入研究胰島素分泌的囊泡運輸有利于闡明胰島素的分泌，而且在激活胰島素分泌過程有著重要意義［1］。研究證明：囊泡膜核苷酸轉(zhuǎn)運體（vesicular nucleotide transporter，VNUT）將 三 磷 酸 腺 苷（ATP）與需轉(zhuǎn)運的分泌蛋白轉(zhuǎn)運到分泌囊泡中，ATP在囊泡中提供能量和驅(qū)動勢能，在胞吐過程中ATP 與胰島素同時分泌至細(xì)胞外。目前，對ATP轉(zhuǎn)運至囊泡內(nèi)機(jī)制還不明確，而ATP 的供能機(jī)制在胰島素存儲與釋放中發(fā)揮關(guān)鍵作用［2］。因此，對該機(jī)制的研究有利于闡述胰島素分泌的精確機(jī)制。2021 年1 月至6 月，本項目旨在利用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）干擾VNUT基因，探索該基因?qū)σ葝u素分泌的影響。

材料與方法

1、主要試劑

RNA 提取試劑盒、實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）購于大連寶生物公司；胎牛血清、細(xì)胞培養(yǎng)液購于北京索萊寶科技有限公司；一抗二抗購于上海生物工程公司；大鼠胰腺β細(xì)胞（INS-1）是本課題組保存細(xì)胞株；大鼠胰島素檢測試劑盒購于美國ALPCO Diagnostics 公司；siRNA 購于ThermoFisher公司。

2、細(xì)胞培養(yǎng)和分組

INS-1 按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行復(fù)蘇，細(xì)胞在含有10%的胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，等細(xì)胞生長至大于90%融合時，0.25%的胰酶消化和傳代，對細(xì)胞進(jìn)行分瓶傳代培養(yǎng)。細(xì)胞處于對數(shù)生長期時用PBS 洗3 遍，分為對照組和干擾組，將siRNA 轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，干擾24 h 后檢測VNUT 基因RNA 水平變化；干擾48 h 后檢測VNUT 基因蛋白表達(dá)水平和胰島素分泌情況。

3、方法

3.1、INS-1 RNA 提取 根據(jù)試劑盒操作流程提取INS-1 總RNA，對總RNA 純度進(jìn)行檢測后，將RNA 置于低溫冰箱中保存。

3.2、引物的設(shè)計和合成 引物由上海生物工程公司合成并于實驗室保存，詳細(xì)情況見參考文獻(xiàn)［3］（表1）。

表1 聚合酶鏈反應(yīng)引物表

3.3、VNUT 蛋白水平檢測 利用蛋白電泳分子生物學(xué)技術(shù)對VNUT 蛋白進(jìn)行檢測，通過蛋白識別成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光，系統(tǒng)掃描蛋白條帶灰度值，觀察對照組和干擾組蛋白水平的差異。

4、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

VNUT 基因被干擾后，基因RNA 和蛋白水平均明顯降低，并抑制胰島素分泌（P＜0.05），見表2。

表2 對照組與干擾組INS-1 VNUT基因表達(dá)與胰島素分泌水平比較（± s）

表2 對照組與干擾組INS-1 VNUT基因表達(dá)與胰島素分泌水平比較（± s）

注：INS-1 按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行復(fù)蘇，細(xì)胞在含有10%的胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，等細(xì)胞生長至大于90%融合時，0.25%的胰酶消化和傳代，對細(xì)胞進(jìn)行分瓶傳代培養(yǎng)；細(xì)胞處于對數(shù)生長期時用PBS 洗3 遍，分為對照組和干擾組，將小干擾RNA 轉(zhuǎn)染至細(xì)胞。INS-1為大鼠胰腺β細(xì)胞

組別對照組干擾組t值P值RNA檢測0.452±0.218 0.319±0.116 3.74 0.026蛋白印跡檢測0.514±0.297 0.369±0.203 4.82 0.019胰島素分泌（ng/L）281.45±24.92 176.54±15.70 5.31 0.011

討 論

siRNA 亦稱為短干擾RNA（short interfering RNA）或沉默RNA（silencing RNA），是一個長20～25 個核苷酸的雙股RNA 片段，在生物學(xué)上有許多不同的用途［4-5］。目前已知siRNA 主要參與RNA 干擾（RNAi）現(xiàn)象，以帶有專一性的方式調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。siRNA 的分子結(jié)構(gòu)現(xiàn)已明確：如具有磷酸化5’末端的短（通常20～24 bp）雙鏈RNA（dsRNA）和具有2 個突出核苷酸的羥基化3’末端。siRNA 經(jīng)設(shè)計合成后可以通過轉(zhuǎn)染引入細(xì)胞，在細(xì)胞質(zhì)中經(jīng)過酶切形成單鏈RNA，單鏈RNA 與堿基配對的mRNA 結(jié)合并誘導(dǎo)其被切割和失活［6-7］；由于原則上任何基因都可以被具有互補(bǔ)序列的合成siRNA 敲低，siRNA 誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默始于RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC）的組裝，該復(fù)合物通過切割編碼靶基因的mRNA分子來沉默某些基因表達(dá)［8］，因此siRNA是在后基因組時代驗證基因功能和藥物靶向的重要工具。

本課題通過設(shè)計和合成siRNA 干擾VNUT 基因?qū)NS-1 細(xì)胞胰島素分泌的影響，發(fā)現(xiàn)siRNA 干擾VNUT 基因后，VNUT 基因的表達(dá)明顯降低，而且胰島素的分泌功能也明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），該結(jié)果提示VNUT 基因表達(dá)與胰島素分泌息息相關(guān)，探討VNUT 基因在ATP 轉(zhuǎn)運和胰島素分泌中的作用機(jī)制，為胰島素分泌的精確機(jī)制闡述提供證據(jù)支持，2型糖尿病治療過程中提高胰島素分泌功能提供參考資料。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突