劉巧麗，吳照祥*，李彥強(qiáng)，李輝虎，劉 杰，周利斌，余發(fā)新

(1.江西省科學(xué)院生物資源研究所，330096，南昌；2.江西省科學(xué)院，330096，南昌；3.中國科學(xué)院近代物理研究所，730000，蘭州)

0 引言

構(gòu)樹(Broussonetiapapyrifera)是一種蕁麻目桑科的多年生落葉闊葉喬木，對環(huán)境條件具有十分良好的適應(yīng)性，自然分布于我國大部分地區(qū)和東南亞各國，是一種典型的鄉(xiāng)土樹種和先鋒植物[1]。人類對構(gòu)樹的開發(fā)利用具有悠久的歷史，根據(jù)利用部位的不同逐漸發(fā)展出了包括綠化、飼用、造紙和入藥等一系列的利用方式，可以說構(gòu)樹渾身是寶[2]。構(gòu)樹具有速生、適應(yīng)性強(qiáng)、分布廣、易繁殖、熱量高、輪伐期短等優(yōu)良特性，在生態(tài)、社會和經(jīng)濟(jì)等方面發(fā)揮重要的價值[1]。雜交構(gòu)樹是中國科學(xué)院植物研究所沈世華研究員在廣泛收集野生構(gòu)樹種質(zhì)資源的基礎(chǔ)上結(jié)合了常規(guī)育種和現(xiàn)代育種方式獲得的具有較高飼用價值的創(chuàng)新優(yōu)質(zhì)樹種。通過進(jìn)一步觀察和研究發(fā)現(xiàn)，雜交構(gòu)樹不僅繼承了野生構(gòu)樹的諸多優(yōu)良特性，還表現(xiàn)出了超出野生構(gòu)樹的一些性狀特征，如葉片粗蛋白、粗脂肪以及鈣等含量顯著提高[3]?！吨袊暳铣煞旨盃I養(yǎng)價值表》顯示雜交構(gòu)樹葉片多項(xiàng)飼用指標(biāo)都顯著超過1級苜蓿，營養(yǎng)價值更高，是一種優(yōu)良的飼料資源[4]。作為一種廣譜性飼料原料資源，雜交構(gòu)樹可以應(yīng)用于如豬、牛、羊等大型牲畜[5]，也可以應(yīng)用于雞、鴨、兔等小型畜禽，甚至可以應(yīng)用于龜、鱉、魚等水產(chǎn)養(yǎng)殖[6]。另外，雜交構(gòu)樹具有對多種生物脅迫和非生物學(xué)脅迫的耐受性，還常被應(yīng)用于廢棄地的生態(tài)治理或生態(tài)修復(fù)，包括廢棄礦山、尾礦以及石漠化山地等[7]。

隨著養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展，雜交構(gòu)樹產(chǎn)業(yè)也呈現(xiàn)出井噴的態(tài)勢，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)全國80%以上的省份不同程度地參與到雜交構(gòu)樹種植和養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)鏈當(dāng)中。雜交構(gòu)樹的種植已從原來的四旁種植、散生種植發(fā)展到現(xiàn)在的規(guī)?；?、集約化基地種植[8]。然而，全國各地的雜交構(gòu)樹種質(zhì)退化嚴(yán)重，產(chǎn)量和質(zhì)量都很難維持，加上國外多種飼料原料的滲透帶來的市場競爭加劇，都使得國內(nèi)的雜交構(gòu)樹產(chǎn)業(yè)發(fā)展難以為繼。雖然現(xiàn)有雜交構(gòu)樹具有適應(yīng)性強(qiáng)、生長快速等優(yōu)良特點(diǎn)，但是其蛋白含量下降難以適應(yīng)當(dāng)前雜交構(gòu)樹產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基地化、集約化和規(guī)?；拇筅厔?，因此，亟待通過新興、高效的科學(xué)技術(shù)選育適應(yīng)性更強(qiáng)、生長更快和蛋白含量更高的優(yōu)良栽培品種，而作為飼料原料的重要用途其蛋白含量的提升是首選。

當(dāng)前林木新品種選育主要包括3種方式，一是廣泛收集野生資源并從中選育，二是通過人工雜交從雜交后代中選育，三是針對木本植物通過芽變等方式選育[9]。雜交構(gòu)樹是一種特殊的種質(zhì)材料，因其本身就是一個雜交種，不適合常規(guī)的育種方法進(jìn)行品種改良。重離子束作為一種先進(jìn)的輻射誘變源，在農(nóng)作物、林木及微生物育種的研究中得到了廣泛的應(yīng)用，開辟了新的交叉學(xué)科領(lǐng)域[10]。重離子束輻射誘變因具有變異率高、變異譜寬、穩(wěn)定周期相對較短、簡便易行且不受物種限制等優(yōu)點(diǎn)而倍受青睞，重離子束誘變育種涉及的植物種類逐年遞增[11-12]。近年來，林木輻照誘變育種成果顯著[13-14]，表明了利用輻照誘變技術(shù)進(jìn)行構(gòu)樹選育是實(shí)際可行的。因此，本研究借助加速重離子對雜交構(gòu)樹組培瓶苗進(jìn)行輻照誘變處理，并篩選出高蛋白雜交構(gòu)樹良種候選材料。通過平行栽培試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證高蛋白雜交構(gòu)樹對貧瘠的適應(yīng)性和粗蛋白積累能力，為該良種的推廣應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

雜交構(gòu)樹組培瓶苗原種由中國科學(xué)院華南植物園吳國江研究員課題組提供。2017年6—12月期間，利用增殖培養(yǎng)基對雜交構(gòu)樹組培瓶苗進(jìn)行擴(kuò)繁。

1.2 方法

1.2.1 組培瓶苗輻照處理 輻照誘變處理是在中國科學(xué)院近代物理研究所重離子研究裝置(Heavy Ion Research Facility in Lanzhou, HIRFL)生物輻照終端平臺上進(jìn)行。2018年3月上旬將經(jīng)擴(kuò)繁的組培瓶苗連帶組培瓶一起裝入樣品臺，并用80 MeV/u的高能碳離子束對其進(jìn)行輻照誘變處理，參照前人有關(guān)經(jīng)濟(jì)林木輻照誘變的研究，設(shè)定中等濃度的輻照為40 Gy[15]，共輻照處理20瓶組培瓶苗，每瓶5株。

1.2.2 組培苗生根、煉苗及移栽 將重離子輻照處理的雜交構(gòu)樹組培瓶苗和對照轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基，待生根后轉(zhuǎn)移至煉苗基質(zhì)(蛭石:珍珠巖:草炭=1:1:1)，溫室中煉苗30 d后移出，讓幼苗在自然條件下生長，30 d后摘取葉片，經(jīng)烘干、粉碎和消解等步驟測定其粗蛋白濃度。

1.2.3 高蛋白含量雜交構(gòu)樹擴(kuò)繁與栽培 為了快速獲得雜交構(gòu)樹種苗材料，采用根繁的方式進(jìn)行種苗培育。根據(jù)粗蛋白濃度測定結(jié)果，選擇粗蛋白濃度最高的組培誘變植株(Irradiation mutagenesis，IM)以及未輻照處理組培苗(CK)為母株，2018年12月將其側(cè)根(半徑>1 cm)剪為3～5 cm的根段，直立插入塑料拱棚內(nèi)的沙床中，澆足水分并保溫，進(jìn)行根繁育苗獲得無性系幼苗。2019年4月，選擇長勢一致的突變株無性系幼苗及對照，進(jìn)行模擬盆栽試驗(yàn)，栽培基質(zhì)基本理化性狀見表1。模擬盆栽試驗(yàn)在江西省科學(xué)院人工氣候室內(nèi)進(jìn)行，光照強(qiáng)度700 μmol photons·m-2·s-1，設(shè)置16 h光照(25 ℃)和8 h黑暗(20 ℃)，相對濕度控制在70%，植物生長45 d后收獲。收獲前1 d通過稱重法測定植物單日耗水量。收獲時，先測定株高和葉片數(shù)，然后將植株分解為葉片、莖干和根系3個部分，取同位葉進(jìn)行葉綠素濃度測定，將根系最大長度計(jì)為根長，洗凈、干燥后測定其生物量。然后將葉片和莖干混合為地上部，再對植株地上部和根系粗蛋白濃度進(jìn)行測定。

表1 雜交構(gòu)樹栽培基質(zhì)理化特性

1.2.4 葉綠素及粗蛋白含量的測定 葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量采用二甲基亞砜提取法測定，并以每克鮮重含有葉綠素的毫克數(shù)(mg·g-1)表示。植株地上部和根系洗凈、烘干后粉碎備用，采用凱氏定氮法測定粗蛋白濃度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2010軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和圖表繪制。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS18.0軟件進(jìn)行，顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析方法(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 輻照誘變對雜交構(gòu)樹粗蛋白濃度的影響

輻照處理的雜交構(gòu)樹瓶苗經(jīng)過生根、煉苗和移栽，最終獲得了60株組培苗。對這60株組培苗及對照樣品葉片粗蛋白濃度進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其粗蛋白濃度為11.88%～37.94%(干重計(jì))，平均為24.08%，高于未輻照的對照處理。分析還發(fā)現(xiàn)，輻照處理多數(shù)是促進(jìn)雜交構(gòu)樹葉片粗蛋白的積累，粗蛋白濃度在對照線以上的組培苗數(shù)量(51)遠(yuǎn)多于對照線下的(9)。

2.2 高蛋白含量雜交構(gòu)樹生長情況

2.2.1 形態(tài)特征和日耗水量 高蛋白含量雜交構(gòu)樹的葉片數(shù)、株高及根長均顯著高于對照組(P<0.05)，且株高差異程度較大，提升幅度達(dá)50%。另外，通過稱重法測定發(fā)現(xiàn)，高蛋白含量雜交構(gòu)樹突變株日耗水量達(dá)到36.37 g，顯著高于對照處理的34.37 g。

2.2.2 生物量積累 不論是高蛋白含量雜交構(gòu)樹突變株還是對照材料，雜交構(gòu)樹生物量(以干重計(jì))分布都表現(xiàn)出葉片>根系>莖干，葉片干重約為莖干的2.49倍，占到莖葉總干重的70%以上。與對照處理相比較，高蛋白含量雜交構(gòu)樹突變株的葉片、莖干和根系生物量都顯著增加，并且根系生物量差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。

2.2.3 粗蛋白含量 測定結(jié)果表明，F(xiàn)T和CK均呈現(xiàn)出地上部分粗蛋白濃度(以干重計(jì))顯著高于根系(P<0.05)。高蛋白含量雜交構(gòu)樹突變株地上部和根系粗蛋白濃度都顯著高于對照(P<0.05)，分別提高25.54%和12.67%(圖3)。相對于植物地上部而言，高蛋白含量雜交構(gòu)樹突變株根系粗蛋白增加的幅度更明顯。

圖3 高蛋白含量雜交構(gòu)樹粗蛋白濃度

2.2.4 葉綠素含量 進(jìn)一步對植物葉片葉綠素含量進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高蛋白含量雜交構(gòu)樹突變株葉片葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量都顯著高于對照材料，其中葉綠素b含量差異達(dá)到極極顯著水平(P<0.001)，而總?cè)~綠素含量差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)(圖4)。

圖4 高蛋白含量雜交構(gòu)樹葉綠素含量

3 討論

以雜交構(gòu)樹組培瓶苗為試驗(yàn)材料，本研究采用40 Gy的高能碳離子束進(jìn)行誘變處理，通過篩選得到一批高蛋白雜交構(gòu)樹候選材料，其中葉片粗蛋白濃度最大提升幅度達(dá)到77.24%。選擇葉片粗蛋白濃度最高的候選植株進(jìn)行擴(kuò)繁和平行栽培試驗(yàn)驗(yàn)證了其貧瘠適應(yīng)性和粗蛋白積累能力。

輻射生物學(xué)發(fā)展至今已有近百年的歷史，與常規(guī)的x、γ和中子等中性粒子相比，重離子束屬于高傳能線密度(Linear energy transfer，LET)輻射，可在單位路徑上沉積更高的能量，從而引發(fā)復(fù)雜的且難以修復(fù)的遺傳損傷，因此其相對生物學(xué)效應(yīng)較高。因其獨(dú)特的物理學(xué)和生物學(xué)特性，重離子束在生物誘變育種實(shí)踐中表現(xiàn)出變異率高、變異譜寬、變異快、穩(wěn)定周期短等優(yōu)點(diǎn)[16]。因此近年來，重離子束誘變育種在國內(nèi)蓬勃發(fā)展，多家科研機(jī)構(gòu)育種成果顯著[17-18]。前人關(guān)于重離子誘變育種方面的研究主要集中于輻照當(dāng)代生物學(xué)效應(yīng)，包括存活率、幼苗長勢、植株高度、結(jié)實(shí)率等，也有引發(fā)種子育性方面的研究[19]。隨著育種進(jìn)程的推進(jìn)，重離子誘導(dǎo)經(jīng)濟(jì)作物質(zhì)量方面的研究必將得到極大程度的關(guān)注，頡紅梅[20]等對豆科和禾本科的牧草種子進(jìn)行了20Ne10+離子束貫穿處理，篩選出了葉片變厚、葉色深綠、生長勢增強(qiáng)的禾本科牧草新株系。以雜交構(gòu)樹組培瓶苗為試驗(yàn)材料，本研究初步探討了中低劑量加速重離子對作物質(zhì)量的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證了利用重離子誘變提升經(jīng)濟(jì)作物質(zhì)量的可能，并且重離子誘導(dǎo)的質(zhì)量改善誘變顯著高于惡化誘變(圖1)。

圖1 輻照處理雜交構(gòu)樹組培苗粗蛋白濃度

通過高蛋白含量雜交構(gòu)樹候選材料的平行栽培試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該材料不僅地上部粗蛋白含量顯著高于對照材料，其生長指標(biāo)(圖2)和形態(tài)學(xué)指標(biāo)(表2)均顯著高于對照，表明重離子誘變導(dǎo)致了雜交構(gòu)樹的生物學(xué)產(chǎn)量和綜合產(chǎn)量的雙提高。前人研究發(fā)現(xiàn)重離子誘變引發(fā)的作物產(chǎn)量和質(zhì)量的提升與光合作用的增加關(guān)系密切[20-21]，本研究也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果，高蛋白含量雜交構(gòu)樹葉片葉綠素濃度顯著高于對照材料(圖4)。本研究還發(fā)現(xiàn)高蛋白含量雜交構(gòu)樹的根系更加發(fā)達(dá)(表2)，猜測根系吸收更多的營養(yǎng)物質(zhì)供給植物生長以及代謝作用，因?yàn)楦凳侵参镂震B(yǎng)分的主要結(jié)構(gòu)[22]。從汲取營養(yǎng)來說，根越深越龐大，獲取的營養(yǎng)物質(zhì)和水分越多，這樣需要更多葉光合作用合成有機(jī)物。相反，葉多需要更多的營養(yǎng)物質(zhì)和水。因此，植物地上部分和地下部分的生長與發(fā)育存在著相互依賴，相互促進(jìn)和相互制約的關(guān)系，這也很好地印證了生態(tài)學(xué)上的庫源學(xué)說理論。高蛋白含量雜交構(gòu)樹平行栽培試驗(yàn)中粗蛋白濃度顯著低于初篩(圖1和圖3)，可能是以下3個方面的原因造成，一是2次測定所采用的部位不完全一致，一般來說植物莖干中粗蛋白濃度顯著低于葉片，雜交構(gòu)樹也是如此[23]；二是植物生長時間的不一致，植物粗蛋白的合成與積累是一個不連續(xù)的過程[24]；三是2次試驗(yàn)所采用的栽培基質(zhì)養(yǎng)分含量差異明顯，非豆科植物氮素主要是通過根系從基質(zhì)中獲取?；谝陨先c(diǎn)，土壤養(yǎng)分的供給以及收獲頻次都顯著影響該高蛋白含量雜交構(gòu)樹材料的品質(zhì)，所以需要加強(qiáng)這個方面的研究工作。

表2 高蛋白含量雜交構(gòu)樹形態(tài)特征及日耗水量

圖2 高蛋白含量雜交構(gòu)樹生物量積累

誘變育種的根本是提高自然變異頻率，積累遺傳變異，從而創(chuàng)造新種質(zhì)，它是解決常規(guī)育種中某些特殊問題和培育新品種的重要方法之一。本研究僅對高蛋白含量雜交構(gòu)樹突變株的生長和部分生理進(jìn)行了初探，尚未將研究內(nèi)容深入到DNA水平，有待進(jìn)一步開展研究。在植物育種領(lǐng)域，重離子束可以誘發(fā)不同類型的DNA突變類型，但是中低濃度輻照劑量主要引發(fā)點(diǎn)突變和小片段的插入缺失[25-26]，本研究中高蛋白雜交構(gòu)樹突變株突變類型的確定有助于更加精確地解讀蛋白質(zhì)合成與積累分子機(jī)理，也將助推重離子輻照誘變育種的快速發(fā)展，這是下一步工作的重點(diǎn)。