王忠慶，蔡帆，諸波，陳功，魏剛

心肌缺血再灌注損傷（MIRI）是心肌組織缺血后恢復(fù)血液灌注造成的不可逆損傷，往往會(huì)造成心功能降低，心肌梗死面積擴(kuò)大，最終導(dǎo)致心力衰竭[1-2]。MIRI 的發(fā)生機(jī)制與氧自由基產(chǎn)生、鈣超載、炎癥反應(yīng)異常、細(xì)胞凋亡及自噬有關(guān)[3]。自噬作為內(nèi)源性調(diào)節(jié)機(jī)制參與MIRI，當(dāng)MIRI 發(fā)生后，心肌細(xì)胞自噬水平便會(huì)增加[4]。黃芪多糖（APS）是豆科植物莢膜黃芪或蒙古黃芪干燥根的主要活性成分之一，由葡萄糖、已糖醛酸、果糖、半乳糖、阿拉伯糖等混合而成[5]。APS 具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡等作用，可作為免疫促進(jìn)劑或調(diào)節(jié)劑[6-7]。甘草酸苷是高遷移率族蛋白1（HMGB1）的抑制劑，其直接結(jié)合HMGB1 并抑制其細(xì)胞因子活性。研究顯示APS 通過抑制心肌細(xì)胞的凋亡和自噬水平，減輕心肌細(xì)胞H/R 造成的損傷和緩解鏈脲佐菌素誘導(dǎo)大鼠的MIRI[8-11]。另外有研究表明高遷移率族蛋白1/Toll樣受體4/核轉(zhuǎn)錄因子-κB（HMGB1/TLR4/NF-κB）信號(hào)通路通過激活炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡引發(fā)MIRI[12]。但目前關(guān)于APS 是否通過調(diào)控自噬抵抗細(xì)胞缺氧/復(fù)氧（H/R）以及是否能通過下調(diào)HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路來抑制MIRI 鮮有報(bào)道。本研究對(duì)原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞進(jìn)行H/R 處理，模擬MIRI 模型，觀察APS 通過調(diào)控HMGB1/TLR4/NF-κB 信號(hào)通路對(duì)心肌細(xì)胞H/R 過程中自噬及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

H9C2 細(xì)胞（美國菌種保藏中心）；APS（粉末，純度90%）（中國上海源葉生物科技公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；胰蛋白酶（美國GIBCO 公司）；DMEM 培養(yǎng)基（美國Sigma 公司）；BCA 蛋白定量試劑盒（南京凱基生物技術(shù)有限公司）；兔抗HMGB1、TLR4、NF-κB p65、B 細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（caspase-3）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）、P62、微管相關(guān)蛋白 1A/1B-輕鏈 3（MAP1LC3，縮寫為 LC3）-Ⅱ單克隆抗體（美國Abcam 公司）；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）雙染色法凋亡檢測試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（武漢博士德生物有限公司）；Trizol 試劑盒（日本TaKaRa 公司）；SYBRTMGreen 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 預(yù)混液（日本Toyobo 公司）；HMGB1、TLR4、NF-κB p65 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Thermo Scientifc 公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱、Multiskan FC 酶標(biāo)儀（美國Thermo 公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；低溫高速離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；透射電鏡（日本JEOL 公司）；CFX96型熒光定量PCR 儀（美國Bio-RAD 公司）；DanoDrop 1000 超微量蛋白核酸分析儀（美國Thermo 公司）。

1.2 方法

1.2.1 H/R 細(xì)胞模型制作及分組

H/R 細(xì)胞模型制作[13]：將對(duì)數(shù)生長期的H9C2細(xì)胞接種于24 孔板，待細(xì)胞融合達(dá)到85%時(shí)，更換培養(yǎng)基為單純無糖培養(yǎng)基。通入95% N2和5%CO2的混合氣體，37℃培養(yǎng)4 h，再更換培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，通入95%空氣和5%CO2的混合氣體，37℃培養(yǎng)12 h。

細(xì)胞分組：將心肌細(xì)胞隨機(jī)分為4組：對(duì)照組（正常培養(yǎng)的細(xì)胞）；缺氧復(fù)氧模型組（H/R組）；黃芪多糖組（APS組），H/R組細(xì)胞造模前30 min加入APS（終濃度為1 mg/L[8]）；HMGB1 信號(hào)通路抑制劑組（HMGB1抑制劑組），H/R 細(xì)胞造模前30 min 加入HMGB1 抑制劑Glycyrrhizin（終濃度為100 μg/ml[12]）。

1.2.2 CCK8 法及EdU 染色法檢測細(xì)胞增殖能力

將上述分組的細(xì)胞，分別于12 h、24 h、48 h、72 h 取出細(xì)胞，每孔加入10 μl CCK8 溶液，每孔設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，使用酶標(biāo)儀于450 nm 處檢測吸光度。調(diào)整細(xì)胞密度為3×105個(gè)/孔并接種于24 孔板上，培養(yǎng)24 h 后，按照EdU 染色試劑盒說明進(jìn)行染色、固定、封片，用LAS AF Lite 圖像處理軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3 ELISA 法檢測炎癥因子含量

造模結(jié)束后收集24 孔板內(nèi)的培養(yǎng)液，按照ELISA 檢測試劑盒說明進(jìn)行檢測，使用酶標(biāo)儀于450 nm 處檢測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，代入曲線算得腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6 含量。

1.2.4 透射電鏡觀察細(xì)胞自噬小體的形成

造模結(jié)束后收集細(xì)胞，胰蛋白酶消化，以1×106個(gè)/孔的密度接種在6 孔板培養(yǎng)，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h 后收集細(xì)胞，用2.5%戊二醛于4℃固定過夜，然后進(jìn)行電鏡的固定、脫水、包埋，制成50～70 nm 的超薄切片，于透射電鏡（25 000×）下觀察各組細(xì)胞自噬小體的形成情況。

1.2.5 AnnexinV-FITC/PI 雙染法檢測細(xì)胞凋亡

細(xì)胞造模24 h 后，取5×105個(gè)細(xì)胞離心，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細(xì)胞，加入500 μl Binding Buffer 懸浮細(xì)胞。再各加入10 μl AnnexinV-FITC 和PI，避光孵育30 min，最后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。以NovoExpressTM軟件進(jìn)行分析。

1.2.6 實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）檢測細(xì)胞HMGB1、TLR4、NF-κB p65 mRNA 表達(dá)水平

造模結(jié)束后，收集各組H9C2 細(xì)胞，采用Trizol法提取總RNA。將RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，擴(kuò)增體系為SYBR Green Mix 10 μl，ddH2O 8 μl，上/下游引物各0.5 μl，cDNA 模板1 μl，共20 μl。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃ 30 s，60℃ 10 s，72℃ 25 s，共40 個(gè)循環(huán)。使用2-ΔΔCT公式計(jì)算各mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平。

引物序列如下：HMGB1 上游引物，5’-ATCCATTGGTGATGTTGC-3’，下游引物，5’-TCTTTTCATAGGGCTGCT-3’。TLR4 上游引物，5’-ATCCCTTATTCAACCA-3’，下游引物5’-TGTCTCCACAGCCACC-3’。NF-κB p65 上游引物，5’-TGTTTCCCCTCATCTTTCC-3’，下游引物5’-GTGGTATCTGTGCTTCTCTCC-3’。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）上游引物，5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3’，下游引物，5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC。miR-1-3p 上游引物，5’-ACACTCCAGGTGGGTGGAATGT-3’，下游引物，5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAG-3’。

1.2.7 Western blot 檢測細(xì)胞HMGB1、TLR4、NFκB p65、Bcl-2、Bax、caspase-3、P62、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平

細(xì)胞裂解法提取各組細(xì)胞總蛋白，用BCA 蛋白檢測試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測定及定量。沸水變性蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗（HMGB1、TLR4、NF-κB p65、Bcl-2、caspase-3、Bax、P62、LC3-Ⅱ、GAPDH，稀釋比例為1：2 000）4℃過夜孵育，TBST 漂洗，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（1：10 000）室溫孵育2 h，DAB 顯色。全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀中曝光，進(jìn)行灰度分析，以GAPDH為內(nèi)參校正。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，作圖工具采用Graphpad 5.0。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 APS 對(duì)H/R 損傷細(xì)胞增殖能力的影響

CCK 8 結(jié)果（圖1）顯示，與對(duì)照組相比，H/R組細(xì)胞存活能力顯著降低（P<0.05）；與H/R組相比，APS組、HMGB1 抑制劑組細(xì)胞存活能力明顯升高（P<0.05）。EdU 染色結(jié)果（圖2）顯示，與對(duì)照組相比，H/R組EdU 陽性細(xì)胞比例明顯減少（P<0.05）；與H/R組相比，APS組、HMGB1 抑制劑組EdU 陽性細(xì)胞比例明顯升高（P<0.05）。

圖1 CCK8 法檢測細(xì)胞存活能力

圖2 EdU 染色檢測細(xì)胞增殖能力（×400）

2.2 APS 對(duì)H/R 損傷細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6含量的影響（圖3）

圖3 ELISA 法檢測細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6 含量

與對(duì)照組相比，H/R組細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6 含量均明顯升高（P均<0.05）；與H/R組相比，APS組、HMGB1 抑制劑組細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6 含量均明顯降低（P均<0.05）。

2.3 APS 對(duì)H/R 損傷細(xì)胞自噬小體形成的影響

透射電鏡結(jié)果（圖4）顯示，對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)可見線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)，幾乎未見自噬小體。與對(duì)照組相比，H/R組細(xì)胞內(nèi)見雙層膜的自噬小體及自噬泡。與H/R組比較，APS組、HMGB1 抑制劑組細(xì)胞內(nèi)可見少量自噬小體及其吞噬物。

圖4 透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬小體（箭頭所示）（×25 000）

2.4 APS 對(duì)H/R 損傷細(xì)胞凋亡的影響（圖5）

圖5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況

流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，H/R組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.05）；與H/R組相比，APS組、HMGB1 抑制劑組細(xì)胞凋亡率均明顯降低（P均<0.05）。

2.5 APS 對(duì)H/R 損傷細(xì)胞HMGB1、TLR4、NF-κB p65 mRNA 表達(dá)的影響（圖6）

圖6 APS 對(duì)H/R 損傷細(xì)胞HMGB1、TLR4、NF-κB p65 mRNA 表達(dá)水平的影響

qRT-PCR 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，H/R組細(xì)胞HMGB1、TLR4、NF-κB p65 mRNA 表達(dá)水平均明顯升高（P均<0.05）；與H/R組相比，APS組、HMGB1 抑制劑組細(xì)胞HMGB1、TLR4、NF-κB p65 mRNA 表達(dá)水平均明顯降低（P均<0.05）。

2.6 APS 對(duì)H/R 損傷細(xì)胞HMGB1、TLR4NF-κB p65、LC3-Ⅱ蛋 白、P62、Bcl-2、Bax、caspase-3、表達(dá)水平的影響（圖7）

圖7 蛋白免疫印跡法檢測細(xì)胞HMGB1、TLR4、NF-κB p65、LC3-Ⅱ、P62、Bcl-2、Bax、caspase-3 蛋白表達(dá)水平

與對(duì)照組相比，H/R組細(xì)胞Bcl-2、P62 蛋白表達(dá)水平均明顯降低，HMGB1、TLR4、NF-κB p65、Bax、caspase-3、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平均明顯升高（P均<0.05）；與H/R組相比，APS組、HMGB1 抑制劑組細(xì)胞HMGB1、TLR4、NF-κB p65、Bax、caspase-3、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平均明顯降低，Bcl-2、P62 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（P均<0.05）。

3 討論

MIRI 是臨床缺血性心臟病防治的一大難題，其中涉及的機(jī)制較多，炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡及自噬都參與其中。體內(nèi)炎癥反應(yīng)的激活使得心肌細(xì)胞進(jìn)一步損傷，加劇細(xì)胞凋亡和心肌梗死面積[14]。APS 具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用，不僅能夠增強(qiáng)T 細(xì)胞、B 細(xì)胞的免疫功能，還能增強(qiáng)化療敏感性和殺滅腫瘤細(xì)胞[15-16]。近年來研究發(fā)現(xiàn)APS 通過抑制促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶3（MAP4K3）的表達(dá)和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)通路，抑制細(xì)胞凋亡，改善心肌細(xì)胞功能[17]。本研究中H/R 損傷細(xì)胞增殖能力減弱，凋亡及自噬活性升高，經(jīng)過APS 或者HMGB1 抑制劑提前處理后，細(xì)胞增殖、凋亡及自噬都有一定程度的恢復(fù)，表明APS 與HMGB1 抑制劑對(duì)H/R 損傷細(xì)胞具有相似的修復(fù)作用，能夠抑制細(xì)胞凋亡及自噬活性。

HMGB1 能夠結(jié)合DNA，缺血壞死的心肌細(xì)胞會(huì)釋放HMGB1，從而觸發(fā)炎癥反應(yīng)，是MIRI 炎癥反應(yīng)的早期介質(zhì)[18]。MIRI 發(fā)生后，TLR4 受體被激活，進(jìn)而引起下游NF-κB 蛋白的活化，然后NF-κB 進(jìn)入細(xì)胞核，激活TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的轉(zhuǎn)錄活性，加重機(jī)體炎癥反應(yīng)[19]。蔡智慧等[20]發(fā)現(xiàn)梔子苷通過TLR4/NF-κB 信號(hào)通路抑制H/R 損傷心肌細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 的釋放。俞超楠等[12]發(fā)現(xiàn)表兒茶素通過抑制HMGB1 信號(hào)通路修復(fù)心肌細(xì)胞H/R 損傷。張業(yè)昊等[21]研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷通過抑制TLR4/NF-κB 信號(hào)通路及IL-1β、IL-1α、IL-6 的表達(dá)修復(fù)H/R 損傷人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。本研究中H/R 損傷心肌細(xì)胞HMGB1、TLR4、NF-κB p65 mRNA 和蛋白表達(dá)水平、炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6 釋放水平均明顯高于對(duì)照組正常細(xì)胞，而APS 和HMGB1 抑制劑可抑制H/R 損傷心肌細(xì)胞HMGB1/TLR4/NF-κB 信號(hào)通路和炎癥因子的表達(dá)。這表明APS 和HMGB1 抑制劑對(duì)H/R 損傷心肌細(xì)胞的修復(fù)作用相似，其機(jī)制可能與抑制HMGB1/TLR4/NF-κB 信號(hào)通路有關(guān)。

細(xì)胞自噬是生物體內(nèi)高度保守的代謝途徑，可選擇性的降解胞內(nèi)有害成分，在調(diào)控炎癥反應(yīng)及免疫方面具有重要作用[22]。自噬過程需要多個(gè)自噬調(diào)節(jié)蛋白參與。LC3 是自噬體膜蛋白，參與自噬形成的各個(gè)階段，可作為檢測自噬活動(dòng)的標(biāo)志物，沒有自噬發(fā)生時(shí)，以LC3-Ⅰ形式存在，當(dāng)發(fā)生自噬后，LC3-Ⅰ經(jīng)泛素化修飾形成LC3-Ⅱ，從而啟動(dòng)自噬[23]。P62 作為自噬受體，被運(yùn)送自噬體內(nèi)降解，當(dāng)自噬被誘導(dǎo)時(shí)，P62 蛋白水平下降，自噬抑制后，P62 蛋白則開始積累[24]。因此可采用LC3-Ⅱ、P62 蛋白水平及透射電鏡觀察自噬小體反映自噬活性。王雪林等[25]發(fā)現(xiàn)APS 能夠降低LC3 的表達(dá)，增加P62 的表達(dá)，從而抑制黃嘌呤氧化酶誘導(dǎo)的肺癌A549 細(xì)胞自噬。王飄等[26]發(fā)現(xiàn)三七總苷通過增加P62 的表達(dá)，降低LC3-Ⅱ、Beclin-1 的表達(dá)有效改善MIRI。本研究中H/R 損傷心肌細(xì)胞較對(duì)照組P62 表達(dá)水平明顯下降，LC3-Ⅱ水平明顯升高，透射電鏡觀察胞內(nèi)可見大量自噬體或自噬泡形成。而APS 和HMGB1 抑制劑可抑制H/R 損傷心肌細(xì)胞LC3-Ⅱ水平，提高P62 表達(dá)水平，透射電鏡可觀察胞內(nèi)少量自噬小體。這表明APS 和HMGB1 抑制劑調(diào)節(jié)H/R 損傷心肌細(xì)胞的自噬活性相似，可能與LC3-Ⅱ、P62 表達(dá)水平有關(guān)。

H/R 過程會(huì)影響心肌細(xì)胞線粒體能量代謝，啟動(dòng)線粒體途徑介導(dǎo)的凋亡。Bcl-2 家族是調(diào)節(jié)凋亡程度的重要分子，包括抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白，同時(shí)促凋亡蛋白Bax 可以調(diào)控抗凋亡蛋白Bcl-2，Bax 能夠通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活caspase-3，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[27]。鄧秋菊等[28]發(fā)現(xiàn)H/R 心肌細(xì)胞中HMGB1表達(dá)量升高，敲低HMGB1 可緩解H/R 心肌細(xì)胞的凋亡。趙麗華等[29]發(fā)現(xiàn)下調(diào)HMGB1 表達(dá)，可降低caspase-3 的表達(dá)水平，進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞凋亡。周慧良等[30]發(fā)現(xiàn)MiR-499 靶向調(diào)控HMGB1 表達(dá)，顯著下調(diào)Bax、caspase-3 的表達(dá)，上調(diào)Bcl-2 的表達(dá)，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)H9C2 心肌細(xì)胞的凋亡。本研究中H/R 損傷心肌細(xì)胞較對(duì)照組Bax、caspase-3 表達(dá)水平明顯升高，Bcl-2 水平明顯下降。而APS 和HMGB1 抑制劑可降低H/R 損傷心肌細(xì)胞Bax、caspase-3 表達(dá)水平，提高Bcl-2 水平。表明APS 和HMGB1 抑制劑調(diào)節(jié)H/R 損傷心肌細(xì)胞的凋亡可能與Bcl-2、Bax、caspase-3 表達(dá)水平有關(guān)。

綜上所述，APS 能夠修復(fù)H9C2 心肌細(xì)胞的H/R損傷，可能通過抑制HMGB1/TLR4/NF-κB 信號(hào)通路，抑制細(xì)胞凋亡和自噬活性，以期為心肌缺血再灌注的治療提供新方向。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突