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        甜菜堿提高LO2細胞中抗氧化酶的表達水平

        2022-03-07 07:00:34張猛猛辛璇賴富饒吳暉
        現(xiàn)代食品科技 2022年2期
        關(guān)鍵詞:E通甜菜堿細胞核

        張猛猛,辛璇,賴富饒,吳暉

        (華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 廣州 510640)

        甜菜堿(BET)是一種廣泛存在于動植物和微生物中的季胺堿類物質(zhì),其可作為甲基供體參與蛋氨酸循環(huán),也可作為滲透調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)細胞滲透壓,目前被廣泛應(yīng)用于食品添加劑、制藥、飼料、日化等領(lǐng)域。由于合成甜菜堿的能力有限,人類需要通過食用富含甜菜堿的食物(如谷物、菠菜等)獲取甜菜堿[1]。一般來說日常飲食攝入的甜菜堿即可滿足身體所需,但有研究發(fā)現(xiàn)額外補充甜菜堿能夠預(yù)防和輔助治療多種疾病,尤其是對由疾病、藥物、酒精等多種因素引起的肝損傷有一定的保護作用[2]。其中的機制主要和甜菜堿的抗氧化能力密切相關(guān)[3,4]。與常見天然抗氧化劑不同的是,甜菜堿并無直接的自由基清除能力,其主要通過增強機體自身的抗氧化能力來發(fā)揮抗氧化功能[5]。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、過氧化氫酶(CAT)等組成的抗氧化酶系統(tǒng)是機體抗氧化防御體系的重要組成部分。已有很多文獻報道甜菜堿能夠提高機體內(nèi)SOD、GPx、CAT等抗氧化酶的酶活和表達水平[6,7],但其中的機制尚不清楚。事實上,甜菜堿因卓越的抗氧化能力,在水果保鮮、畜牧養(yǎng)殖等領(lǐng)域也展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用價值。隨著甜菜堿的應(yīng)用潛力和研究價值越來越被人們所關(guān)注,解析甜菜堿增強抗氧化酶表達的機制,不僅能夠深化對甜菜堿保護肝臟等功能的認識,還能為甜菜堿進一步的研究與應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

        細胞抵御氧化應(yīng)激的主要通路是轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子 2(Nrf2)-Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Keap1)-抗氧化反應(yīng)元件(ARE)通路。該通路能夠調(diào)控抗氧化酶系及Ⅱ相解毒酶的表達,以清除過多的活性氧(ROS)造成的氧化應(yīng)激。近些年來,該通路還被發(fā)現(xiàn)可作為藥物靶點,應(yīng)用于由氧化應(yīng)激誘導(dǎo)產(chǎn)生的疾病的預(yù)防和治療中[8]。筆者在前期的研究中發(fā)現(xiàn),甜菜堿能夠提高處于正常狀態(tài)下的人體肝細胞LO2細胞中SOD、CAT等抗氧化酶的酶活[7],但還不清楚Nrf2-Keap1-ARE通路在其中的作用。本研究擬通過探究甜菜堿對 LO2細胞抗氧化酶表達水平的影響,及該影響與 Nrf2-Keap1-ARE通路的關(guān)系,來揭示甜菜堿提高抗氧化酶表達水平的機制。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        甜菜堿(98%純度)購自阿拉丁試劑(上海)有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒、CCK-8試劑購自南京建成生物工程研究所;細胞核蛋白質(zhì)提取試劑盒、UNIQ-10柱式總 RNA抽提試劑盒、AMV第一鏈cDNA合成試劑盒、2×SG Fast qPCR Master Mix試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司;人轉(zhuǎn)錄因子 NF-E2相關(guān)因子 2(Nrf2) ELISA試劑盒購自Thermo Fisher公司;Nrf2、pNrf2、Keap1以及β-actin等蛋白的抗體購自Abcam公司;PD98059、LY294002、SP600125、SB203580、GF109203X、Compound C購自MCE (MedChemExpress)公司;LO2細胞系,本實驗室保存;DMEM培養(yǎng)基、胰酶購自GIBCO公司;胎牛血清購自Hyclone公司。

        1.2 主要儀器設(shè)備

        ABI 7500實時熒光定量PCR儀,美國Applied Biosystems公司;Infinite M1000 Pro酶標儀,瑞士Tecan公司。

        1.3 試驗方法

        1.3.1 細胞毒性

        取對數(shù)生長期的LO2細胞,以1×104cells/孔的數(shù)量接種于96孔板,用DMEM培養(yǎng)液(1%雙抗、10%胎牛血清)在5% CO2,37 ℃條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。去除上清液,加入100 μL含不同濃度甜菜堿的新鮮培養(yǎng)液(62.5、125、250、500、1000 μmol/L),以正常培養(yǎng)液作為陰性對照。12 h后棄去含藥培養(yǎng)液,加入100 μL含10% CCK8試劑的培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)1 h后于450 nm處測每孔的吸光值。細胞存活率按以下公式計算:

        細胞存活率/%=As/Ac×100%

        式中:

        As——樣品的吸光值;

        Ac——陰性對照的吸光值。

        1.3.2 實時熒光定量PCR(QPCR)

        將LO2細胞配成濃度為1×105cells/mL的細胞懸液后接種于6孔板,每孔3 mL。培養(yǎng)24 h后吸去培養(yǎng)基,分別加入不同濃度的甜菜堿(62.5、125、250、500、1000 μmol/L)。12 h后,收集并裂解細胞,使用UNIQ-10柱式總 RNA抽提試劑盒提取 LO2細胞總RNA,使用AMV第一鏈cDNA合成試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,使用2×SG Fast qPCR Master Mix試劑盒進行PCR擴增。以β-actin為內(nèi)參,結(jié)果用2-ΔΔCt表示。SOD、CAT、GPx、Nrf2、Keap1、β-actin等的引物序列見表1。

        表1 所用引物序列Table 1 The primer sequence

        1.3.3 甜菜堿對 Nrf2-Keap1-ARE通路中相關(guān)蛋白水平的影響

        將LO2細胞配成濃度為1×105cells/mL的細胞懸液后接種于10 cm培養(yǎng)皿,每皿10 mL。培養(yǎng)24 h后吸去培養(yǎng)基,加入250 μmol/L甜菜堿處理12 h。然后收集細胞,每20 μL細胞沉淀加入200 μL漿蛋白抽提試劑,冰浴孵育10 min,然后4 ℃條件下12000 r/min離心10 min,上清液為細胞漿蛋白,沉淀為細胞核。收集細胞核沉淀,加入50 μL核蛋白抽提試劑,冰浴10 min,然后于4 ℃條件下12000 r/min離心10 min,所得上清液即為細胞核蛋白。用 BCA蛋白濃度測定試劑盒測定細胞核蛋白中蛋白質(zhì)含量,然后利用Nrf2 ELISA試劑盒檢測細胞核提取物中可與ARE位點結(jié)合的Nrf2蛋白的含量。

        細胞核內(nèi)Nrf2的相對水平=C樣品/C對照

        式中:

        C樣品——甜菜堿處理組細胞核內(nèi)的Nrf2蛋白含量,pg/mg蛋白;

        C對照——對照組細胞核內(nèi)的Nrf2蛋白含量,pg/ mg蛋白。

        按上述條件處理細胞,使用 NP40裂解細胞,然后4 ℃條件下12000 r/min離心10 min,收集上清液。用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定細胞裂解液中蛋白質(zhì)含量。利用SDS-PAGE分離細胞裂解液中的蛋白,再將蛋白轉(zhuǎn)移到 PVDF膜上。將膜與 Nrf2、pNrf2、Keap1以及β-actin抗體4 ℃孵育過夜,再與二抗室溫孵育1 h。最后利用特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑檢測蛋白條帶,利用Image J軟件檢測蛋白條帶灰度值。

        蛋白質(zhì)相對水平=G樣品/G對照

        式中:

        G樣品——甜菜堿處理組細胞內(nèi)的Nrf2與β-actin蛋白條帶灰度值之比;

        C對照——對照組細胞內(nèi)的Nrf2與β-actin蛋白條帶灰度值之比。

        1.3.4 激酶抑制劑對甜菜堿提高抗氧化酶mRNA水平的影響

        分別往鋪有細胞的6 cm培養(yǎng)皿加入250 μmol/L的甜菜堿和不同激酶抑制劑(1 μmol/L PD98059、1 μmol/L LY294002、1 μmol/L SP600125、1 μmol/L SB203580、 2.5 μmol/L GF109203X 、 1 μmol/L Compound C),以不加抑制劑的甜菜堿處理組為對照,處理12 h后收集細胞,提取RNA,檢測Nrf2、Keap1和三種抗氧化酶的mRNA水平。

        1.4 數(shù)據(jù)處理

        結(jié)果采用平均值±標準偏差(SD)表示,使用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(ANOVA)并進行多組之間均數(shù)的差異性檢驗,p<0.05時認為有顯著性差異。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 甜菜堿對LO2細胞中抗氧化酶表達的影響

        如圖1所示,在250~1000 μmol/L甜菜堿處理12 h后,細胞內(nèi)的SOD、GPx和CAT等抗氧化酶的mRNA水平顯著高于對照組(p<0.05),最高分別提高了1.08、0.51、0.88倍。這與Yu等人[9]在羊羔體內(nèi)、Elsheikh等人[10]在小鼠體內(nèi)的研究結(jié)果接近,但顯著低于 Cai等人[6]在湖羊體內(nèi)的檢測結(jié)果。這一結(jié)果的差異可能在于不同的研究所使用的模型、檢測的組織部位、甜菜堿所用劑量和處理時間不同。此外,在 250~1000 μmol/L的劑量內(nèi),SOD、GPx和CAT的mRNA水平并沒有隨著濃度的增加而提高,這表明甜菜堿對LO2細胞內(nèi)抗氧化酶表達的提高作用是有限的。

        需要指出的是,當細胞或組織處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時,甜菜堿能否通過提高抗氧化酶的表達來發(fā)揮抗氧化功能還存在著一定的爭議。其原因是有的研究發(fā)現(xiàn)甜菜堿能夠提高抗氧化酶的表達,但也有研究表明甜菜堿對抗氧化酶的表達無顯著影響,甚至有抑制作用[5]。有研究認為這一現(xiàn)象是甜菜堿通過非酶抗氧化物質(zhì)調(diào)節(jié)細胞氧化應(yīng)激狀態(tài)的結(jié)果:當細胞處于輕度氧化應(yīng)激狀態(tài)時,細胞會通過提高抗氧化酶的表達來抵抗氧化應(yīng)激,而甜菜堿可以通過非酶抗氧化物質(zhì)抑制氧化應(yīng)激,從而降低細胞對氧化應(yīng)激的應(yīng)答,也就是抗氧化酶表達的提高,這時甜菜堿對抗氧化酶的表達表現(xiàn)出抑制作用;當細胞處于過度氧化應(yīng)激狀態(tài)時,細胞會啟動凋亡程序,關(guān)閉抗氧化酶基因的表達,而甜菜堿通過非酶抗氧化物質(zhì)緩和氧化應(yīng)激,阻止過度氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡程序,從而解除凋亡程序?qū)寡趸副磉_的抑制,這時甜菜堿對抗氧化酶的表達表現(xiàn)出提高作用[5]。也就是說這些研究認為甜菜堿主要是通過非酶抗氧化系統(tǒng)發(fā)揮抗氧化功能,其可能對抗氧化酶的表達并無直接的促進作用[5,11]。這些之前的研究在探究甜菜堿的抗氧化作用時,一般會使用H2O2、對乙酰氨基酚等物質(zhì)誘導(dǎo)細胞或組織進入氧化應(yīng)激狀態(tài)。此時抗氧化酶水平的變化是甜菜堿和這些物質(zhì)綜合作用的結(jié)果,并不僅僅是甜菜堿本身對抗氧化酶表達的作用。本研究是以處于正常生理狀態(tài)的LO2細胞為模型,本研究的結(jié)果表明甜菜堿是能夠直接刺激細胞提高抗氧化酶的表達水平的。因此,本研究認為,對于處于氧化應(yīng)激狀態(tài)的細胞或組織,甜菜堿也可能通過提高抗氧化酶的表達來發(fā)揮抗氧化作用,只是最終的抗氧化酶水平是多種因素綜合作用的結(jié)果。

        2.2 甜菜堿對LO2細胞中Nrf2-Keap1-ARE通路的影響

        細胞調(diào)控抗氧化酶表達的主要通路是 Nrf2-Keap1-ARE通路。在正常生理情況下,Nrf2與胞質(zhì)內(nèi) Keap1蛋白耦聯(lián),并錨定于胞質(zhì),使其活性處于相對抑制狀態(tài),并且Keap1與Nrf2的耦聯(lián)能促進Nrf2的泛素化降解,從而使細胞內(nèi)的Nrf2維持在較低水平;當Nrf2從Nrf2-Keap1復(fù)合物中脫離,即Nrf2-Keap1-ARE通路被激活時,Nrf2蛋白的泛素化降解被抑制,Nrf2蛋白水平會升高,并由細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細胞核,再與ARE結(jié)合,從而啟動解毒酶和抗氧化酶等基因的表達[12]。因此細胞核內(nèi)能與ARE結(jié)合的Nrf2蛋白水平可以用來表征Nrf2-Keap1-ARE通路是否被激活。為了探究甜菜堿對Nrf2-Keap1-ARE通路的影響,本研究提取了經(jīng)甜菜堿處理的LO2細胞的細胞核,利用包被有ARE結(jié)合位點的ELISA試劑盒檢測細胞核內(nèi)Nrf2蛋白的水平。結(jié)果如圖2a所示,甜菜堿處理組內(nèi)能與ARE區(qū)域結(jié)合的Nrf2的蛋白質(zhì)水平相比于對照組提高了1.21倍(p<0.05),這表明甜菜堿能激活Nrf2-Keap1-ARE通路。為進一步驗證甜菜堿對Nrf2-Keap1-ARE通路的激活,本研究還探究了細胞內(nèi)總Nrf2蛋白的水平。結(jié)果如圖2b所示。經(jīng)甜菜堿處理的LO2細胞內(nèi),Nrf2蛋白質(zhì)水平顯著相對于對照組提高了0.80倍(p<0.05),這進一步表明了甜菜堿對Nrf2-Keap1-ARE通路的激活作用。鴉膽子苦醇是一種源于苦木科植物鴉膽子種子喹諾酮。由于鴉膽子苦醇能夠抑制Nrf2蛋白的表達,并促進Nrf2蛋白的降解,因此常作為Nrf2蛋白的抑制劑被用于研究 Nrf2-Keap1-ARE通路[13]。為了探究Nrf2-Keap1-ARE通路在甜菜堿提高抗氧化酶表達中的作用,本研究探究了鴉膽子苦醇對甜菜堿提高抗氧化酶表達這一作用的影響。結(jié)果如圖3所示,1 μmol/L的鴉膽子苦醇能完全抑制250 μmol/L甜菜堿對三種抗氧化酶表達的提高作用(p<0.05)。以上結(jié)果表明甜菜堿是通過激活Nrf2-Keap1-ARE通路提高抗氧酶表達的。

        一般來說,天然產(chǎn)物激活Nrf2-Keap1-ARE通路主要有以下兩種方式,一是提高Nrf2蛋白的表達水平或降低Keap1蛋白的表達水平,Nrf2/Keap1蛋白質(zhì)水平的比值越高,意味著與Keap1耦聯(lián)的Nrf2越少,處于活性狀態(tài)下的Nrf2蛋白越多。二是通過提高Nrf2蛋白的磷酸化水平,或促進Keap1半胱氨酸巰基的化學(xué)修飾,促進 Nrf2與 Keap1解離[8,14]??膳c Keap1半胱氨酸上的巰基通過氧化或烷基化形成共價加合物的天然產(chǎn)物大多具有親電性,這類化合物主要包括具有氧化性的酚和醌類、邁克爾反應(yīng)受體分子、異硫氰酸酯類、二硫醚和二烯丙基硫化物、含硒化合物等[15]。而甜菜堿并不具屬于這幾類物質(zhì),也不具有親電性。Nrf2蛋白的磷酸化可由促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)、蛋白激酶C(PKC)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)和腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)等激酶催化,而且這些激酶所涉及的MAPK/ERK、PI3K/Akt等信號通路還能影響Nrf2和Keap1蛋白的表達[16]。有文獻報道甜菜堿也可以調(diào)節(jié)PI3K、MAPK等信號通路[17,18]。因此,甜菜堿提高Nrf2蛋白水平的機制可能有以下幾種方式,一是提高Nrf2蛋白的表達水平、二是降低Keap1蛋白的表達水平,三是促進Nrf2蛋白的磷酸化。需要指出的是,由于降低 Keap1蛋白的表達水平和促進Nrf2蛋白的磷酸化可以通過抑制Nrf2蛋白的降解來提高細胞內(nèi)Nrf2蛋白的水平[12]。因此圖2所展示的Nrf2蛋白水平的提高并不意味這Nrf2蛋白表達水平的提高。

        2.3 甜菜堿對激活Nrf2-Keap1-ARE通路的機制

        為了探究甜菜堿激活 Nrf2-Keap1-ARE通路的機制,本研究探究了甜菜堿對LO2細胞內(nèi)Nrf2和Keap1的mRNA水平的影響,以及Keap1蛋白質(zhì)水平和Nrf2蛋白磷酸化水平的影響。結(jié)果如圖4。從圖4可知,甜菜堿并未顯著影響Nrf2的mRNA水平(p>0.05),也就是說甜菜堿可能并不是通過提高Nrf2蛋白的表達水平激活Nrf2-Keap1-ARE通路的。之前也有研究表明甜菜堿不能影響小鼠肝臟中Nrf2蛋白的表達水平[19]。還有,經(jīng)甜菜堿處理后,Nrf2蛋白的磷酸化水平并未有明顯增加,這意味著甜菜堿可能也不是通過提高 Nrf2蛋白的磷酸化水平激活Nrf2-Keap1- ARE通路。由圖4可知,經(jīng)甜菜堿處理后,LO2細胞內(nèi)Keap1的mRNA和蛋白質(zhì)水平分別下降了38.21%和49.15%(p<0.05),這表明甜菜堿可能是通過抑制Keap1的表達水平激活Nrf2-Keap1-ARE通路的。為探究甜菜堿提高Keap1表達水平的機制與PI3K、MAPK等激酶的關(guān)系,本研究利用ERK抑制劑PD98059、PI3K/AKT抑制劑LY294002、JNK抑制劑SP600125、p38 MAPK抑制劑SB203580、PKC抑制劑GF109203X、AMPK抑制劑Compound C等抑制劑抑制激酶活性,探究了在這些激酶活性被抑制的調(diào)節(jié)下,甜菜堿對抗氧化酶和Keap1 mRNA水平的影響。結(jié)果如圖5,這些抑制劑并未影響甜菜堿對Keap1和抗氧化酶mRNA水平的作用(p>0.05)。這意味著甜菜堿并不是通過PI3K、MAPK等信號通路影響Keap1的水平的。此外,這些激酶是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化的關(guān)鍵酶,這一結(jié)果也從側(cè)面證實甜菜堿對Nrf2-Keap1-ARE通路的激活與Nrf2蛋白的磷酸化無關(guān)。

        以上結(jié)果雖然表明甜菜堿能夠降低 Keap1的表達水平,但其中的機制仍不清楚。甜菜堿是機體內(nèi)一種重要的甲基供體,可顯著影響DNA、RNA和蛋白質(zhì)的甲基化修飾。甜菜堿的很多生理活性,如降脂、抗乙肝病毒等活性都與其甲基供體的角色密切相關(guān)[20,21]。甜菜堿對機體非酶抗氧化系統(tǒng)的增強作用也與其作為甲基供體參與蛋氨酸循環(huán)有關(guān)[5]。常見的甲基供體除甜菜堿外,還有膽堿、蛋氨酸、s-腺苷甲硫氨酸、葉酸等。而這些甲基供體也被報道過能夠激活 Nrf2通路,其中葉酸就是通過降低Keap1 mRNA水平激活Nrf2通路的[22-25]。因此,甜菜堿激活Nrf2-Keap1-ARE通路的機制可能與其作為甲基供體的角色有關(guān)。DNA啟動子的甲基化修飾會顯著抑制基因的轉(zhuǎn)錄和表達。已有研究報道,提高 Keap1啟動子甲基化水平,可以降低 Keap1 mRNA的水平[12]。而甜菜堿可顯著影響DNA的甲基化修飾。已有研究報道甜菜堿能顯著提高機體某些蛋白DNA啟動子的甲基化水平[26]。還有,Keap1 m6A RNA甲基化水平也會影響其Keap1的蛋白質(zhì)水平[27]。而甜菜堿也報道過能夠影響細胞內(nèi)RNA m6A的甲基化水平[28]。因此,甜菜堿抑制Keap1蛋白水平的機制,一方面可能涉及Keap1基因啟動子的甲基化修飾,另一方面也可能與Keap1 mRNA的m6A甲基化有關(guān)。此外,有文獻報道 Nrf2蛋白第437位精氨酸的甲基化修飾能夠增強其與ARE區(qū)域的結(jié)合能力[29]。已有研究表明甜菜堿能夠促進某些蛋白質(zhì)(如信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白1)中精氨酸的甲基化修飾[30]。這暗示著甜菜堿還可能通過Nrf2蛋白的甲基化來影響Nrf2與ARE的結(jié)合,進而影響Nrf2-Keap1-ARE通路。也就是說圖2a中的結(jié)果除了與進入細胞核內(nèi)的 Nrf2蛋白水平有關(guān),還可能與Nrf2蛋白的甲基化有關(guān)。事實上,機體調(diào)節(jié)Nrf2-Keap1-ARE通路的機制多種多樣,如Nrf2蛋白的乙?;揎棥⒁种芀eap1 mRNA的翻譯等[12,31]。因此,甜菜堿激活Nrf2-Keap1-ARE通路的機制還有待進一步探究。

        3 結(jié)論

        本研究發(fā)現(xiàn)甜菜堿是通過激活 Nrf2-Keap1-ARE通路提高LO2細胞內(nèi)SOD、GPx和CAT等抗氧化酶的mRNA水平的,而甜菜堿激活Nrf2-Keap1-ARE通路的機制與其降低Keap1的表達水平有關(guān)。本研究的結(jié)果將為解析甜菜堿的抗氧化機制提供一個新的視角。

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