范秀英，黃俊蘭

（四川省攀枝花生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心站，四川 攀枝花 617000）

糞大腸菌群[1]是總大腸菌群中的一部分，是一群能在一定溫度（44.5±0.5 ℃）下生長并發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣且能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶的大腸菌群，又稱耐熱大腸菌群。水中糞大腸菌群的檢測方法主要有傳統(tǒng)的多管發(fā)酵法[2]和濾膜法，以及近幾年列入環(huán)保行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法的酶底物法[3-5]。多管發(fā)酵法需要的試劑和器材比較多，分析步驟多，檢測周期長，培養(yǎng)基保存時間短，陽性結(jié)果還需復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，需檢測人員花費(fèi)大量的時間，不能快速判斷樣品的污染狀況，不適用于應(yīng)急和樣品量較大時檢測使用。

酶底物法彌補(bǔ)了多管發(fā)酵法的不足，是現(xiàn)代微生物快速檢測的發(fā)展方向[6]。因此，本文采用酶底物法與多管發(fā)酵法分別測定大量不同水樣中糞大腸菌群，通過多方面比較兩種方法的優(yōu)缺點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 設(shè)備和材料

酶底物法：培養(yǎng)基（科立得TM（Colilert）試劑），恒溫培養(yǎng)箱（44.5±0.5 ℃），100 mL無菌瓶（含有1.5%的硫代硫酸鈉），程控封口機(jī)，高溫滅菌器，97孔定量盤，購置的或經(jīng)過121 ℃、30 min高溫滅菌后的無菌水，97孔標(biāo)準(zhǔn)陽性比色盤等。

多管發(fā)酵法：高溫滅菌器，單倍和三倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)基，EC肉湯培養(yǎng)基，3 mm接種環(huán)，酒精燈，移液槍，恒溫培養(yǎng)箱（控溫精確±0.5 ℃）、恒溫振蕩水浴鍋等。

2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.1 多管發(fā)酵法

2.1.1 初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

將水樣充分搖勻，根據(jù)水樣受污染的程度來確定水樣的接種量。

將水樣進(jìn)行1：10的稀釋。相對干凈的水樣，在5個裝有5 mL三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的試管中（內(nèi)有小倒管）各加入10 mL水樣；在5個裝有10 mL乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的試管中（內(nèi)有小倒管）各加入1 mL水樣；在5個裝有10 mL乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的試管中（內(nèi)有小倒管）各加入1 mL 1：10稀釋的水樣；將各管充分混勻，置于37±0.5 ℃恒溫培養(yǎng)24±2 h。

受污染的水樣接種量可以接種1 mL、0.1 mL、0.01 mL。通過產(chǎn)酸和產(chǎn)氣來判斷發(fā)酵管試驗(yàn)的陽性結(jié)果。如在倒管內(nèi)產(chǎn)氣現(xiàn)象不夠明顯，可以輕拍試管，根據(jù)試管內(nèi)是否有小氣泡升起來判斷是否為陽性，有則判斷為陽性。

2.1.2 復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

初發(fā)酵試驗(yàn)確認(rèn)是陽性或者疑似陽性的樣品管還需通過復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。將轉(zhuǎn)接后的試驗(yàn)管在30分鐘內(nèi)放入水浴中，并在44.5±0.5 ℃下培養(yǎng)24±2 h，再觀察發(fā)酵管的產(chǎn)氣情況，如產(chǎn)氣則證明該管試驗(yàn)為陽性。

2.2 酶底物法

酶底物法：將水樣充分搖勻，根據(jù)樣品受污染的程度來確定水樣的接種量。盡量避免接種樣品培養(yǎng)后97孔定量盤全部為陽性或全部為陰性的情況。

將科立得TM（Colilert R）試劑加入100 mL裝有相對干凈的水樣的取樣瓶中，待試劑完全溶解后，倒入無菌97孔定量盤中，用封口機(jī)封口后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。到達(dá)培養(yǎng)時間后取出，并與標(biāo)準(zhǔn)比色盤進(jìn)行比較，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)比色盤進(jìn)行判讀，記錄陽性的大小孔數(shù)。如果結(jié)果無法判斷，可延長培養(yǎng)時間到28 h后再進(jìn)行判讀。將記錄的陽性大小孔數(shù)查對應(yīng)的MPN值，乘以相關(guān)稀釋倍數(shù)從而得出樣品的MPN值。

若樣品量小于100 mL或者是受污染的水樣，需要將水樣稀釋。取10 mL的水樣加入已滅菌的90 mL無菌水中，制成1：10稀釋水樣，未知樣品可以多選用幾個接種量進(jìn)行檢測。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與比較

3.1 兩種測定方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可行性比較

采用糞大腸菌群質(zhì)控樣品MIC-DWCOL，210527，用無菌水活化，分別用兩種方法對質(zhì)控樣進(jìn)行分析，最終得出表1所示結(jié)果。結(jié)果表示，兩種方法的檢測結(jié)果均在質(zhì)控要求范圍內(nèi)。

表1 質(zhì)控樣品的分析結(jié)果

3.2 兩種測定方法的比對分析

為了比較兩種方法在實(shí)際工作中的適用性，選取了攀枝花金沙江和雅礱江斷面地表水、地下水共40個樣品進(jìn)行試驗(yàn)，將水樣稀釋使其MPN值控制在20～2 400 MPN/100 mL之間，為了使兩組數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，先將數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)處理，再運(yùn)用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件，對兩種方法的結(jié)果進(jìn)行配對t 檢驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 若干斷面兩方法比對結(jié)果

共采集40個水樣，分別用酶底物法和多管發(fā)酵法測定糞大腸桿菌，結(jié)果見圖1。

圖1 兩種方法的糞大腸桿菌測定結(jié)果

運(yùn)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，對酶底物法和多管發(fā)酵法做配對t檢驗(yàn)分析，結(jié)果見表3。

表3 兩種結(jié)果的t檢驗(yàn)結(jié)果

由表3可見，兩種方法的t=0.720，顯著性=0.474，表明二者相關(guān)性良好，兩種方法無顯著性差異。

在用兩種方法檢測糞大腸菌群時發(fā)現(xiàn)，酶底物法和多管發(fā)酵法檢測結(jié)果的相關(guān)性強(qiáng)，樣品濃度在低濃度范圍比高濃度范圍更好，但統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上有點(diǎn)差異。在置信度95%的情況下差異是可被接受的，且滿足環(huán)境監(jiān)測要求。

3.3 試驗(yàn)環(huán)境對兩種方法分析結(jié)果的影響

多管發(fā)酵法對實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境要求很高，操作過程必須要求無菌環(huán)境，實(shí)驗(yàn)室環(huán)境對結(jié)果影響很大。圖2是在6個不同點(diǎn)位采集的水樣，用酶底物分別在無菌實(shí)驗(yàn)室、非無菌實(shí)驗(yàn)室、室外環(huán)境中進(jìn)行檢測的分析結(jié)果。由此可以得出，酶底物法與實(shí)驗(yàn)環(huán)境是否無菌關(guān)系不大。

圖2 實(shí)驗(yàn)環(huán)境對酶底物法的結(jié)果影響

3.4 培養(yǎng)溫度對兩種方法分析結(jié)果的影響

在6個不同的點(diǎn)位采集水樣，多管發(fā)酵在35～39 ℃進(jìn)行培養(yǎng)，酶底物法在42～46 ℃進(jìn)行培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)溫度對兩種方法分析結(jié)果的影響。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出：多管發(fā)酵最佳培養(yǎng)溫度為37±0.5 ℃，但是在36～38之間培養(yǎng)結(jié)果的差異不是特別大；酶底物法檢測糞大腸菌群最佳培養(yǎng)溫度為44.5±0.5 ℃，如果溫度過高或過低都會對監(jiān)測結(jié)果影響較大。因此，兩種分析方法中酶底物法更需嚴(yán)格控制培養(yǎng)溫度，使用的培養(yǎng)箱應(yīng)有較低溫度波動和較好溫度均勻度。

表4 酶底物法在不同培養(yǎng)溫度下的分析結(jié)果

3.5 培養(yǎng)時間對酶底物法分析結(jié)果的影響

在不同的點(diǎn)位采集6個水樣，按酶底物方法將樣品在44.5±0.5 ℃的溫度下培養(yǎng)，不同時間后觀察培養(yǎng)結(jié)果?？梢钥闯?，在12 h以內(nèi)樣品的顯色都不明顯，無法得出檢測結(jié)果，當(dāng)時間達(dá)到20 h左右時，定量盤的顏色和陽性孔數(shù)會達(dá)到穩(wěn)定。當(dāng)繼續(xù)培養(yǎng)至28 h時，陽性孔數(shù)也基本不會再變化。所以酶底物法測定水中糞大腸菌群，20 h左右即可得檢測結(jié)果。結(jié)果見圖3。

圖3 酶底物法在不同培養(yǎng)時間下的分析結(jié)果

4 結(jié)論

應(yīng)用酶底物法和傳統(tǒng)的多管發(fā)酵法檢測水中糞大腸菌群時，檢測結(jié)果在準(zhǔn)確性方面無太大差異，而酶底物法檢測的靈敏度要高于多管發(fā)酵法。傳統(tǒng)的多管發(fā)酵法在操作方面比酶底物法更加繁瑣，且工作量大，對水樣保存時間和對實(shí)驗(yàn)室環(huán)境要求更加嚴(yán)格，不適用于突發(fā)性環(huán)境污染事件監(jiān)測對速度的要求；酶底物法采用的購買成品培養(yǎng)基及試劑，操作流程簡便，減少了部分實(shí)驗(yàn)過程中可能受污染的環(huán)節(jié)，最快20 h左右即可判斷水樣中糞大腸菌群的MPN值，酶底物法較好地彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法的不足，之前進(jìn)口試劑價(jià)格昂貴，會大幅增加檢測成本，但近年來國產(chǎn)酶底物試劑的質(zhì)量已優(yōu)化，做了多次比對后發(fā)現(xiàn)與進(jìn)口試劑基本等效，所以購買國產(chǎn)試劑用于檢測，會解決成本高的問題。因此，綜合比較，酶底物法不僅適合常規(guī)實(shí)驗(yàn)室分析，更適合應(yīng)急突發(fā)環(huán)境事件中的現(xiàn)場檢測以及樣品量較大時水樣品中的微生物檢測。