劉子璇 劉文麗 郝 浩 孔 立 傅一鑫 田新誠 李 肖 劉慧宇

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250355）

目前，膿毒癥發(fā)病率、病死率居高不下，臨床救治十分困難，是當(dāng)今重癥醫(yī)學(xué)所面臨的難題［1］。膿毒癥最新定義為宿主對感染引起失控反應(yīng)導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙綜合征，具有30%～70%的病死率，嚴(yán)重威脅人類生命健康［2］。膿毒癥休克因細(xì)菌細(xì)胞壁上的脂多糖（LPS）導(dǎo)致，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，肺為膿毒癥最早累及的器官，約半數(shù)膿毒癥休克患者伴隨急性肺損傷（ALI）或者急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）［3］，其特征是肺部炎癥、肺水腫、低順應(yīng)性和由于肺血管通透性增加引起的毛細(xì)血管滲漏。通常有呼吸窘迫、呼吸衰竭、低氧血癥的表現(xiàn)，臨床上通過機(jī)械通氣糾正低氧血癥、液體管理控制炎癥以治療ALI，但部分患者病情仍有進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，參附注射液治療膿毒癥有較好療效［4］。如何應(yīng)用中西醫(yī)結(jié)合方法治療膿毒癥相關(guān)肺損傷是目前我國醫(yī)學(xué)研究重要課題之一。有學(xué)者稱參附注射液可通過減少肺氧自由基產(chǎn)生，減輕膿毒癥ALI［5］。我們先前的研究表明參附注射液可降低肺血管通透性，這可能與抑制細(xì)胞內(nèi)皮的多糖包被降解有關(guān)，但分子機(jī)制還有待探究［6］。

經(jīng)過先前預(yù)實(shí)驗(yàn)和參附注射液的動物研究表明10 mg/kg的參附注射液可抑制LPS誘導(dǎo)的肺部炎癥及損傷［7］。本研究通過建立膿毒癥大鼠模型，通過參附注射液對膿毒癥大鼠的干預(yù)，研究對膿毒癥大鼠肺損傷的保護(hù)作用，探索其對內(nèi)毒素所致ALI的保護(hù)機(jī)制，為參附注射液治療膿毒癥的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，并嘗試尋找中西醫(yī)結(jié)合治療膿毒癥的新途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 無特定病原體（SPF）級SD大鼠30只，6～7周齡，體質(zhì)量200～250 g，雄性，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司提供，動物許可證號：SCXK（魯）20170007。經(jīng)檢驗(yàn)檢疫合格。動物房光照時間12 h，溫度20～24℃，濕度60%。飼養(yǎng)地點(diǎn)為山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，自由取食。實(shí)驗(yàn)動物的飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)操作和取材均遵循《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》和《實(shí)驗(yàn)動物許可管理辦法》規(guī)定進(jìn)行。

1.2 試藥與儀器 參附注射液，華潤三九（雅安）藥業(yè)有限公司，批號：國藥準(zhǔn)字Z5120664。脂多糖，美國Sigma公司，批號065M8209V。10%水合氯醛溶液，山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供；大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA kit、大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）ELISA kit、大鼠 syndecan-1 ELISA kit，USCN life公司；大鼠硫酸類肝素ELISA kit，武漢科晶科技有限公司；硫酸軟骨素ELISA kit，武漢云克隆科技股份有限公司。BP310S電子天平，德國Sartorius公司；Cascadal超純水系統(tǒng)，美國PALL公司；ST8型低速自動平衡離心機(jī)，美國Thermo Scientific公司；5424R型高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；XW-80A旋渦混合儀，海門其林貝爾儀器有限公司；KG19V21電冰箱，德國西門子公司；微量移液器，德國Thermo Scientific公司；-80℃超低溫冰箱，日本SANYO公司；全波長酶標(biāo)儀，德國Thermo Scientific公司；DK-8D型電熱恒溫水浴鍋，上海比郎儀器有限公司；TP1020自動脫水機(jī)，德國LEICA公司；EG1150H石蠟包埋機(jī)，德國LEICA公司；RM2016輪旋式切片機(jī)，德國LEICA公司；PHY-Ⅲ全自動病理組織烘片儀，常州中威電子儀器有限公司；400-S-Ⅱ電熱恒溫干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療儀器廠；全自動血?dú)夥治鰴C(jī)，美國NOVA-K型。

1.3 造模與分組 30只健康SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組、模型組、參附組3組，每組10只。采用單次小劑量輸注脂多糖的方法建立膿毒癥模型［8］。模型組、參附組分別尾靜脈注射0.1% LPS溶液10 mL/kg（即10 mg/kg），空白對照組注射等體積0.9%氯化鈉注射液。模型組和參附組注射LPS后逐漸出現(xiàn)行動遲緩、嗜睡、呼吸急促和顫抖?？瞻讓φ战M與實(shí)驗(yàn)前無明顯差別。建模后參附組立即尾靜脈注射參附注射液10 mL/kg（根據(jù)臨床用藥劑量的5倍換算而得），空白對照組、模型組分別尾靜脈注射0.9%氯化鈉注射液10 mL/kg。造模后觀察6 h，如有大鼠死亡則記錄死亡時間，存活大鼠取標(biāo)本進(jìn)行檢測。

1.4 標(biāo)本采集與檢測 各組大鼠均于造模6 h后腹腔注射10%水合氯醛溶液3 mL/kg，充分麻醉后固定大鼠，腹面向上，常規(guī)消毒胸、腹部皮膚，自陰囊上1cm至膈肌頂部，應(yīng)用組織剪逐層剪開皮膚、腹壁肌肉層，應(yīng)用無菌棉棒小心游離內(nèi)臟組織，充分暴露腹主動脈，鉗夾雙側(cè)髂總動脈分叉處，于該處近心端應(yīng)用5號針頭抽血至無法抽出并應(yīng)用生化管暫存。1）經(jīng)腹主動脈采血處死后，立即剪開大鼠膈肌、胸骨，充分暴露心肺，取左肺下葉、右肺下葉各1塊，左下肺行肺組織病理檢測，右下肺記錄肺濕/干重比（W/D）。2）血?dú)夥治觯焊怪鲃用}取血0.5 mL，用于測定血?dú)夥治?。記錄pH、PaO2和乳酸（Lac）。3）肺組織病理檢測：取左下肺用10%甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、制成4 μm厚的切片、HE染色，光鏡下觀察肺組織結(jié)構(gòu)，每組隨機(jī)觀察3只大鼠的切片，每張切片隨機(jī)選出5個高倍視野，采取雙盲法進(jìn)行肺損傷的輕重程度評分［9］。正?；驑O輕度損傷：0分；輕度損傷（＜25%）：1分；中度損傷（25%～50%）：2分；重度損傷（50%～75%）：3分；嚴(yán)重?fù)p傷（＞75%）：4分；將4項(xiàng)指標(biāo)評分相加作為總分，分值越高，說明肺組織損傷越嚴(yán)重，見表1。4）血清TNF-α、MMP-1、Syndecan-1、硫酸乙酰肝素（HS）、硫酸軟骨素（CS）檢測：取各組大鼠腹主動脈血4 mL靜置1 h待自然凝固后，3 000 r/min離心15 min，取上層血清，采用ELISA 法檢測血清TNF-α、MMP-1、Syndecan-1、HS、CS水平。

表1 肺組織損傷評分表（分）

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，符合方差齊性的計(jì)量資料，組間比較采用單因素方差分析；不符合方差齊性的計(jì)量資料，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，等級資料組間比較用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠pH、PaO2和Lac水平比較 見表2。模型組、參附組大鼠較空白對照組pH、PaO2顯著降低、Lac顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），而參附組大鼠較模型組pH、PaO2有明顯上升、Lac明顯下降（P＜0.05或P＜0.01）。各組大鼠pH、PaO2水平為：空白對照組＞參附組＞模型組。Lac水平為：模型組＞參附組＞空白對照組。

表2 各組大鼠pH、PaO2和Lac水平比較（±s）

表2 各組大鼠pH、PaO2和Lac水平比較（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。1 mmHg≈0.133 kPa。

組別空白對照組模型組參附組n 10 10 10 pH 7.38±0.03△△7.25±0.06**7.36±0.05△△PaO2（mmHg）94.69±5.57△△70.65±7.84**82.79±6.75*△Lac（mmol/L）2.05±0.36△△4.34±0.65**3.33±0.54**△△

2.2 各組大鼠肺組織濕干重比的比較 見表3。結(jié)果顯示，模型組、參附組大鼠較空白對照組W/D顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），而參附組顯著低于模型組（P＜0.01）。各組大鼠肺組織濕干重比水平為：模型組＞參附組＞空白對照組。

2.3 各組大鼠肺組織病理學(xué)改變 空白對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔清晰，支氣管纖毛柱狀上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)有少量白細(xì)胞浸潤，未見水腫、滲出，血管周圍無水腫；模型組大鼠肺泡間隔增厚，肺泡破壞，肺泡壁水腫，肺泡內(nèi)見滲出、充血，肺間質(zhì)大量中性粒細(xì)胞浸潤，氣管纖毛柱狀上皮倒伏、脫落，氣管內(nèi)炎性滲出，血管周圍水腫、白細(xì)胞浸潤，病理學(xué)評分顯著升高（P＜0.01）；參附組大鼠肺組織病變性質(zhì)與模型組相同，肺組織損傷程度較模型組減輕，肺泡結(jié)構(gòu)相對完整，肺間質(zhì)有輕度或中度水腫，炎性細(xì)胞浸潤程度也較模型組明顯改善，肺損傷程度評分顯著降低（P＜0.05），3組肺損傷程度評分結(jié)果比較見表3，差異有顯著性（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各組大鼠肺組織濕干重比及肺操作損傷程度評分比較（±s）

表3 各組大鼠肺組織濕干重比及肺操作損傷程度評分比較（±s）

組 別n 肺W/D 肺損傷程度評分（分）空白對照組模型組參附組10 10 10 4.07±0.20△△5.15±0.19**4.55±0.13**△△0.90±0.74△△10.60±2.01**6.30±1.34*△

2.4 各組大鼠血清TNF-α、MMP-1、Syndecan-1、HS、CS水平比較 見表4。結(jié)果顯示，與空白對照組相比，模型組、參附組大鼠TNF-α、MMP-1、Syndecan-1、HS、CS顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），而參附組顯著低于模型組（P＜0.05或P＜0.01）。各組大鼠血清TNF-α、MMP-1、Syndecan-1、HS、CS 水平為：模型組＞參附組＞空白對照組。

表4 各組大鼠血清TNF-α、MMP-1、Syndecan-1、HS、CS水平比較（ng/mL，±s）

表4 各組大鼠血清TNF-α、MMP-1、Syndecan-1、HS、CS水平比較（ng/mL，±s）

組別空白對照組模型組參附組n 10 10 10 TNF-α 3.06±0.25△△4.44±0.27**3.50±0.27*△△MMP-1 166.98±15.25△△266.31±29.76**229.05±22.69**△Syndecan-1 14.45±1.77△△59.03±7.07**42.40±5.36**△△HS 73.76±5.03△△112.37±8.31**93.02±5.56**△△CS 1 412.07±215.95△△2 454.75±257.32**1 829.37±256.49*△△

3 討論

膿毒癥的發(fā)病機(jī)制很復(fù)雜［10］，內(nèi)皮細(xì)胞的活化和功能異常在膿毒癥的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，炎癥反應(yīng)和抗炎反應(yīng)失控是其突出表現(xiàn)，高發(fā)病率、高死亡率及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜是其主要特點(diǎn)，器官損傷可見于肺、肝、腎、心臟和腸中，治療不及時可發(fā)展為ALI、ARDS和多器官功能障礙綜合征（MODS）［11］。

膿毒癥可歸屬于中醫(yī)學(xué)傷寒、溫病的范疇，《黃帝內(nèi)經(jīng)·素問》云“正氣存內(nèi)，邪不可干”“邪之所湊，其氣必虛”，其病機(jī)為正虛毒損、絡(luò)脈瘀滯［12］?！皽匦吧鲜?，首先犯肺”，肺為嬌臟，其位最高，正氣虛弱，毒邪驅(qū)散無力，毒邪內(nèi)侵使臟真受損；肺朝百脈，在膿毒癥傳變過程中，肺臟是易受毒邪侵襲之地，亦為毒邪積聚蘊(yùn)生之所，內(nèi)外毒邪互結(jié)，灼傷肺臟脈絡(luò)及氣陰，肺宣降功能受損，發(fā)而致喘。故膿毒癥ALI為本虛標(biāo)實(shí)證，其中陽氣虧虛是其本，痰濁、水飲、瘀血為其標(biāo)，核心治法為益氣溫陽［13］。參附注射液來自傳統(tǒng)中醫(yī)方劑參附湯，由紅參、附子組成，主治元?dú)獯筇?。紅參為君藥，可大補(bǔ)元?dú)?，益氣回陽，補(bǔ)陽固脫，附子大辛大熱，益火補(bǔ)陽，溫通經(jīng)脈，是為臣藥。二藥合用可增效減毒，有回陽救逆、益氣固脫的作用。既往研究發(fā)現(xiàn)其具有抗缺血［14］、抗缺氧［14］、抗休克［15］、清除氧自由基、抗脂質(zhì)過氧化［16］、減輕肺缺血/再灌注［17］、增強(qiáng)機(jī)體非特異性抵抗力、雙向調(diào)節(jié)血壓［18］、降低血清炎癥因子水平、改善過度炎癥反應(yīng)［19］、減輕血管內(nèi)皮損傷［20］等作用。一系列臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明參附注射液治療膿毒癥可提高臨床治愈率和效率，改善預(yù)后和器官功能［21］。參附注射液干預(yù)ALI大鼠能夠提高細(xì)胞免疫功能，改善機(jī)體防御機(jī)制，減少氧自由基，改善肺組織炎性浸潤，減輕肺部出血、水腫及肺不張，并促進(jìn)肺組織的修復(fù)［22］。

LPS可引起大鼠肺臟腫脹、出血、結(jié)構(gòu)破壞、炎性細(xì)胞浸潤，因此常用于建立膿毒癥ALI模型。內(nèi)皮細(xì)胞過度活化可導(dǎo)致血管通透性增加、內(nèi)皮損傷、白細(xì)胞黏附增加、凝血功能障礙，并最終導(dǎo)致微循環(huán)功能障礙并促進(jìn)膿毒癥的進(jìn)展。因此，一些研究人員認(rèn)為膿毒癥主要是微循環(huán)疾?。?3］。在生理?xiàng)l件下，內(nèi)皮細(xì)胞表面覆蓋有多糖包被，可以維持正常的血管通透性。它可以防止白細(xì)胞黏附于內(nèi)皮細(xì)胞，防止凝血機(jī)制過度活化，減少微血栓形成，并保持內(nèi)腔暢通。多糖包被主要由糖胺聚糖側(cè)鏈和核心蛋白組成，最重要的核心糖蛋白是syndecan-1，它對于維持多糖包被的正常結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要。MMP-1是基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族的重要成員，能特異性剪切syndecan-1，從而導(dǎo)致多糖包被降解，進(jìn)而引發(fā)微循環(huán)障礙。多項(xiàng)動物研究證明：膿毒癥時循環(huán)中MMP-1水平顯著升高［24-25］。syndecan-1、HS、CS在維持多糖包被結(jié)構(gòu)、血管通透性、信號傳導(dǎo)、炎癥反應(yīng)、微生物侵襲和凝血功能方面均發(fā)揮重要作用。TNF-α由活化的單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生，常用于評估炎癥反應(yīng)程度。

目前認(rèn)為：多糖包被的破壞是導(dǎo)致膿毒癥中毛細(xì)血管通透性增加的主要機(jī)制［26］，而膿毒癥局部或全身的炎癥反應(yīng)可以加速破壞多糖包被的結(jié)構(gòu)與功能［27］。在膿毒癥中，促炎細(xì)胞因子激活導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶過量表達(dá)，使多糖包被被降解并且無法執(zhí)行其正常功能，使血管通透性下降并加重水、蛋白及各種溶質(zhì)的丟失，造成組織間隙水腫。Schmidt EP等［28］發(fā)現(xiàn)膿毒癥小鼠通過TNF-α快速誘導(dǎo)肺微血管多糖包被降解，降解將多糖包被成分，例如syndecan-1、HS、CS、硫酸軟骨素（HA）釋放到血漿中，從而導(dǎo)致血管通透性增強(qiáng)，組織間隙水腫，彌散距離增大，影響肺內(nèi)氣體交換和組織供氧，并可導(dǎo)致肺水腫。

在本研究中，與空白對照組相比，LPS靜脈注射可引起大鼠肺泡間隔水腫、肺泡結(jié)構(gòu)破壞、肺出血、炎性細(xì)胞浸潤、W/D比值增高，血清TNF-α、MMP-1、Syndecan-1、HS、CS水平下降等病理表現(xiàn)；臨床表現(xiàn)也出現(xiàn)Lac上升、PaO2進(jìn)行性下降。與模型組相比，參附組血清TNF-α、MMP-1、Syndecan-1、HS、CS水平下降，反映了參附注射液可減輕膿毒癥誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及內(nèi)皮多糖包被降解，維持多糖包被的完整性。參附組PaO2升高，表明參附組換氣功能得到改善，間接證明了參附組的肺血管通透性降低、肺內(nèi)滲出減少。參附組的W/D比明顯降低，表明參附注射液可改善肺水腫并降低肺毛細(xì)血管通透性。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠ALI病理學(xué)形態(tài)主要表現(xiàn)為肺泡間隔水腫、肺泡隔毛細(xì)血管明顯淤血、大量中性粒細(xì)胞浸潤；模型組大鼠給予參附注射液后，肺泡及肺部充血、水腫及炎癥情況相對于模型組明顯改善，ALI的病理改變顯著減輕，說明參附注射液對膿毒癥大鼠肺組織有保護(hù)作用，為參附注射液改善膿毒癥所致肺損傷提供了依據(jù)。

綜上所述，參附注射液對改善膿毒性肺損傷有一定作用。其機(jī)制可能是：1）通過降低炎癥水平，抑制MMP-1的過量表達(dá)，減少內(nèi)皮多糖包被的降解，從而降低肺毛細(xì)血管的通透性，改善氧合，保護(hù)肺組織并減輕肺部及全身的炎癥反應(yīng)；2）參附注射液通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)機(jī)體免疫細(xì)胞的功能，抑制炎癥反應(yīng)，減輕器官損傷；3）參附注射液通過加強(qiáng)肝臟解毒代謝功能，而減輕LPS對肺組織的損傷；4）改善微循環(huán)，增強(qiáng)對組織對缺氧的耐受，促進(jìn)氧的與應(yīng)用。但是，該實(shí)驗(yàn)仍然存在幾個問題：首先，大鼠膿毒癥模型不能完全反映人類膿毒癥；其次，本研究評估了參附注射液對膿毒癥大鼠的短期效果，但未評估其長期效果。因此還需要進(jìn)一步長期研究參附注射液對膿毒癥肺損傷的保護(hù)作用；另外，參附注射液存在個體差異的過敏現(xiàn)象，臨床使用應(yīng)詳細(xì)詢問有無過敏史，并對高敏者做過敏試驗(yàn)。