暢引東，賈仡偉，何瑞，張萌，2，孟廣軍，李新鳳，張作剛*，王建明*

（1.山西農業(yè)大學 植物保護學院 農業(yè)有害生物綜合治理山西省重點實驗室，山西 太原 030031；2.山西省植物保護植物檢疫中心，山西 太原 030001）

MicroRNA（miRNA）是廣泛存在于真核生物細胞中的一類重要內源性非編碼小分子，大約由19~30個核苷酸組成。它通常靶向一個或多個mRNAs，通過抑制翻譯或者降解靶標mRNAs來調節(jié)基因表達［1-2］。真菌中miRNA相關研究起步較晚。溫劍等基于成熟miRNA序列在不同物種內具有保守性及其前體結構具有發(fā)夾二級結構的特性［3-5］，運用RNA組學方法、生物信息學技術和熒光定量PCR方法率先在真菌釀酒酵母基因組中鑒 定 出32個microRNA-like RNAs（milRNAs）［6］。此后，研究人員基于高通量測序結果運用生物信息學技術參考miRNA數(shù)據(jù)庫（miRBase）中其它物種miRNA數(shù)據(jù)，對一些真菌菌種進行milRNA的預測，并進一步采用半定量反轉錄PCR、實時熒光定量PCR、Northern雜交等方法對預測的milR?NAs進行驗證和功能研究［7］。Fulci等［8］發(fā)現(xiàn)Neu?rospora crassa中siRNA和milRNA在基因表達調控方面都具有重要作用。Zhou Jiahong等［9］首次報道在植物病原真菌中核盤菌的milRNA與核盤菌的菌核形成和致病過程相關。Zhou Quan等［10］研究發(fā)現(xiàn)綠僵菌中milRNA參與調控菌絲生長和產孢的過程。Guo Maowei等［11］研究發(fā)現(xiàn)禾谷鐮孢菌中Fgmil-2通過反向調控其靶基因FgbioH1調控生物素的合成，從而影響病原菌營養(yǎng)生長、致病性及毒素生成等。馮浩等［7］研究發(fā)現(xiàn)蘋果黑腐皮殼菌中Vm-milR37通過調控谷胱甘肽過氧化物酶基因VmGP從而增強蘋果樹腐爛病菌的致病力。植物miRNA不僅在植物細胞中起重要作用，在遭受病原菌侵染時還會被轉運進入真菌細胞介導跨界抗病性［12］。植物miRNA跨界出擊抗病，病原菌miRNA也會跨界反擊植物的免疫響應。馮浩團隊發(fā)現(xiàn)蘋果黑腐皮殼菌Vm-milR1可通過抑制寄主免疫相關受體蛋白激酶基因表達，進而抑制寄主免疫反應促進病菌侵染［13］。這一系列研究成果證實了真菌milRNA不僅對其自身靶標基因的調控機制，有些還可跨界發(fā)揮調控功能。真菌milRNA研究將會為闡明真菌生物學過程的分子機理提供新的方向。

尖孢鐮孢菌是一種重要的植物病原真菌，具有豐富的遺傳多樣性和復雜的致病性差異［14-16］。近年來有關該菌種的milRNA研究也逐步展開，但迄今為止，milRNA在鐮孢菌與寄主互作中的功能和調控機制報道較少。Chen Rui等［17］對尖孢鐮孢菌番茄專化型菌株milRNAs和靶標基因進行了預測，但未對其調控功能進行研究。Jiang Xuefei等［18］通過比較尖孢鐮孢菌西瓜?；途z和小分生孢子的深度測序sRNA文庫篩選出差異表達milRNAs，發(fā)現(xiàn)有2個milRNAs精確調控毒素基因表達。Ji Huimin等［19］發(fā)現(xiàn)尖孢鐮孢菌番茄?；途暝谇秩炯闹鞣堰^程中Fol-milR1跨界進入寄主細胞干擾番茄免疫防御體系，從而利于順利侵入寄主。Li Minhui等［20］首次在尖孢鐮孢菌古巴?；途曛邪l(fā)現(xiàn)1個包括FoQDE2、milRNA-87及其靶基因FOIG_15013的關鍵致病軸心，施用外源siRNA可抑制milRNA表達，從而減輕病害癥狀。上述研究表明尖孢鐮孢菌中存在豐富的mil?RNA值得進一步研究。

隨著基因組學和蛋白組學研究的發(fā)展，現(xiàn)已建成龐大的基因和蛋白數(shù)據(jù)庫，通過生物信息學分析可以進一步揭示基因間調控關系［21-22］。借助于STRING蛋白互作網(wǎng)絡分析工具［23］、DAVID在線分析工具［24-25］和Cytoscape軟件［26］等生物信息學工具可以對蛋白互作信息、基因功能、基因參與的代謝路徑等多方面的信息進行預測分析，還可以結合多種屬性的互作信息構建出復雜的蛋白調控網(wǎng)絡，再結合目標基因的表達水平分析結果，將會更進一步的闡釋miRNA和靶基因間的調控機制［27-28］。

本研究擬結合前人的研究結果，采用實時熒光定量PCR技術和STRING蛋白互作網(wǎng)絡分析、DAVID在線分析等生物信息學手段對尖孢鐮孢菌番茄?；途阭ilRNAs及其靶基因在侵染寄主條件下的基因表達情況和蛋白互作關系進行研究，以揭示milRNAs對靶基因的調控機制，進一步明確尖孢鐮孢菌侵染寄主分子機理。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：尖孢鐮孢菌番茄?；椭虏【?/p>

供試植株：番茄品種中蔬四號幼苗

1.2 試驗方法

1.2.1 pri?milRNA和milRNA靶基因引物設計與篩選

引物設計：參照Chen Rui等［17］預測的尖孢鐮孢菌番茄專化型菌株milRNAs信息，使用NCBI基因組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)頁工具在尖孢鐮孢菌番茄專化型全基因組數(shù)據(jù)中確定primary-milRNAs（pri-milR?NAs）的位置。依據(jù)pri-milRNA的序列特征，找出pri-milRNA的序列范圍。隨后選取pri-milRNA序列和milRNA靶基因序列依據(jù)實時熒光定量PCR引物設計原則進行引物設計，引物由上海生工生物有限公司合成。隨后將引物分別以尖孢鐮孢菌番茄?；途旰头延酌绲腞NA反轉錄后的cDNA為模板進行實時熒光定量PCR擴增，通過4%瓊脂糖凝膠電泳和觀察熔解曲線對引物進行特異性檢測。

1.2.2 pri?milRNAs及milRNAs靶基因的基因表達分析

參照杜賓等［29］所描述的方法，將供試菌株接種于番茄幼苗；分別對接種后0.5、6、12、48 h的番茄植株根部進行取樣。依照RNasio Plus（9108，Takara）的步驟提取總RNA并用qRT-PCR試劑SYBR? Premix Ex Taq II kit（RR470， Takara）反轉錄合成單鏈cDNA。以合成單鏈cDNA為模板，以尖孢鐮孢菌tef基因作為內參，選用SYBR Pre?mix Ex Taq II試劑盒（RR820，Takara）分別對供試的pri-milRNAs和milRNAs靶基因進行實時熒光定量PCR，測定病原與寄主互作條件下目的基因的表達情況。PCR反應采用兩步法，其條件為：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性5 s，62 ℃退火15 s，運行40個循環(huán)，每次循環(huán)的62 ℃退火延伸時收集熒光；在循環(huán)結束時從65 ℃開始繪制溶解曲線直到95 ℃，每次增加0.5 ℃，保持5 s，同時收集熒光。每個反應體系設置3個重復，共設2次生物學重復?；虮磉_數(shù)據(jù)分析根據(jù)目的基因和各個內參基因的閾值循環(huán)（Ct），用2-ΔΔCT計算相對表達量，利用Excel 2010和SPSS11.0軟件進行處理及單因素方差分析，采用Duncan氏新復極差法進行差異顯著性檢驗。

1.2.3 milRNAs與其靶基因的蛋白互作網(wǎng)絡分析基于Chen Rui等［17］預測的milRNAs靶基因信息，在STRING蛋白互作網(wǎng)絡分析網(wǎng)站對靶基因的互作信息進行挖掘，獲得一定范圍內靶基因的蛋白互作信息和相關的基因信息。將獲取的蛋白互作信息導入Cytoscape軟件構建蛋白互作網(wǎng)絡，并結合milRNAs及其靶基因的調控關系，構建milRNAs與靶基因的蛋白互作網(wǎng)絡，再利用Cyto?scape軟件中的分子復合物檢測算法（MCODE）進行互作基因的功能模塊分析［30］。通過DAVID在線分析軟件對蛋白互作網(wǎng)絡中的基因信息進行功能富集分析［24-25］，結合上述研究進一步分析菌株milRNA及其靶基因所涉及的生物學過程及基因功能。

2 結果與分析

2.1 pri?milRNA和milRNA靶基因引物設計與篩選

pri-milRNAs的位置及設計的引物信息如表1所示。

表1 pri?milRNA位置和引物Table 1 pri?milRNA position and its primers

11個milRNA靶基因信息和設計的milRNA靶基因引物信息見表2。

表2 milRNA靶基因引物Table 2 Primers of milRNA target gene

供試引物經(jīng)實時熒光定量PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳和引物的熔解曲線結果詳見圖1和圖2，在番茄幼苗cDNA模板中因無擴增產物生成未列出。從圖1的電泳結果中可以看出，fox_milR?NA_1a，e，g的pri-milRNA引物M1、M2和M3的擴增結果有雜帶，fox_milRNA_3a和fox_milRNA_5的pri-milRNA引物M6和M9沒有擴增產物；靶基因FOXG_04240和FOXG_16460的引物T1和T8的擴增結果有雜帶，靶基因FOXG_08797、FOXG_15485和FOXG_15486引 物T6、T10和T11沒有擴增產物；其它pri-milRNAs引物和靶基因引物的擴增條帶與目的條帶大小一致。

圖1 pri-milRNAs和靶基因引物擴增結果Fig.1 Amplified results of primers for pri-miRNAs and their target genes

從圖2中可看出，fox_milRNA_1a，e，g的primilRNA引物M1、M2和M3的熔解曲線雜亂，特異性不好；fox_milRNA_3a和fox_milRNA_5的pri-milRNA引物M6和M9沒有熔解曲線，表明無擴增產物生成；靶基因FOXG_04240和FOXG_16460的引物T1和T8的熔解未形成單峰，特異性不 好；靶 基 因FOXG_08797、FOXG_15485和FOXG_15486引物T6、T10和T11沒有熔解曲線，表明無擴增產物生成；其它pri-milRNAs引物和靶基因引物的熔解曲線明顯為單峰，特異性較好。

圖2 pri-milRNA和靶基因引物的熔解曲線Fig.2 Melting curves of primers for pri-miRNAs and their target genes

綜上所述，部分milRNAs的pri-milRNAs的基因序列相似性極高（fox_milRNA_1a，e，g），所設計的引物特異性較差。還有一些基因，設計的引物未能擴增出目的條帶。因此，只選擇部分primilRNAs及其靶基因引物M4、M5、M7、M8、M10、T2、T3、T5和T7進行下一步基因表達實驗，初步確定milRNAs基因與其靶基因的調控關系。

2.2 pri?milRNAs及milRNA靶基因的基因表達分析

采用實時定量PCR檢測尖孢鐮孢菌番茄?；途昵秩炯闹髟缙诔跫塵ilRNA及其靶基因的表達情況（圖3）。

pri-milRNAs與靶基因的相對表達量結果中反映出供試的尖孢鐮孢菌番茄?；途阭ilR?NAs及其靶基因的調控關系（圖3）。在病原菌侵染番茄后，pri-milRNA_2a的相對表達量呈下降趨勢；pri-milRNA_2b的相對表達量隨著侵染時間而逐漸上升，在12 hpi時達到高峰，隨后顯著下降；milRNA_2a和milRNA_2b靶基因FOXG_03470的相對表達量隨著侵染時間推移而逐漸下降，在48 hpi時其表達量上升。pri-milRNA_3b在病原寄主互作后的相對表達量呈上升狀態(tài)，而milRNA_3b靶基因FOXG_04910的相對表達量呈下降趨勢。pri-milRNA_4在病原菌與寄主互作6 hpi的相對表達量逐漸上升，在12 hpi相對表達量達到最高，milRNA_4靶基因FOXG_08812在病原和寄主互作后基本未表達。pri-milRNA_6在病原菌與寄主互作6 hpi時相對表達量最高，隨后顯著下降，而milRNA_6靶基因FOXG_00067的相對表達量值在12 hpi時最高。由此可推斷，試驗選取的milR?NAs與靶基因間基本呈負調控關系。

圖3 尖孢鐮孢菌番茄?；途昵秩痉褧r相關基因的定量表達Fig.3 The quantitative expression of related genes of FOL during infection

2.3 milRNA與其靶基因的生物信息學分析

選取的milRNA靶基因經(jīng)STRING蛋白互作網(wǎng)絡同源比對分析，獲得靶基因及其蛋白互作相關基因蛋白注釋信息和蛋白互作信息（表3）。

由表3中可知，已有的11個靶基因中包括1個奎尼酸透性酶編碼基因FOXG_09739、1個甘氨酸脫羧酶復合體H蛋白編碼基因FOXG_03470，其余為2個預測蛋白和7個為保守假定蛋白編碼基因。其中，這些蛋白中僅有甘氨酸脫羧酶復合體H蛋白（FOXG_03470）和3個保守假定蛋白（FOXG_04240、FOXG_15485、FOXG_15486）能夠同其它類型蛋白緊密地參與到蛋白互作網(wǎng)絡。

將預測的蛋白互作信息導入Cytoscape軟件構建蛋白互作網(wǎng)絡，再利用MCODE算法對構建的蛋白互作網(wǎng)絡進行功能模塊分析，結果如圖4所示。從圖4中可以看出milRNA_1、milRNA_2、milRNA_3和milRNA_8的靶基因之間的互作聯(lián)系較為緊密。其中，milRNA_1的靶基因FOXG_04240和milRNA_2的靶基因FOXG_03470能夠與諸多的基因進行互作，可假定為該蛋白互作網(wǎng)絡中的樞紐基因。該預測的蛋白互作網(wǎng)絡中共有3個核心模塊，其中模塊1包含31個基因，涉及325個互作關系（MCODE score 21.67），模塊2包含10個基因，涉及25個互作關系（MCODE score 5.78），模塊3包含4個基因，涉及6個互作關系（MCODE score 4）（表3）。模塊1與模塊3間的互作較為緊密。milRNA_4、milRNA_6和milRNA_7與其它的milRNAs及其靶基因間的互作聯(lián)系并不緊密，其靶基因為保守假定蛋白和預測的蛋白。

圖4 milRNA與靶基因間的蛋白互作網(wǎng)絡Fig.4 Protein interaction network of milRNA and its target genes

表3 milRNA靶基因及互作相關聯(lián)基因信息Table 3 Informations of milRNA target genes and interacted genes

將蛋白互作網(wǎng)絡中涉及的基因數(shù)據(jù)輸入DA?VID在線分析軟件進行基因功能分析，可知該網(wǎng)絡主要涉及的分子功能為氧化還原酶活性和GTP結合；生物學過程為小GTP酶介導的信號轉導。模塊1主要涉及的分子功能為氧化還原酶活性。模塊3主要涉及的分子功能為氨甲基轉移酶活性、氨基轉移酶活性和谷氨酰胺連接酶活性。

續(xù)表

3 討論

miRNA的生物合成最初是由依賴DNA的RNA聚合酶II（Pol II）從基因組DNA中轉錄出初級miRNA轉錄本（primary miRNA transcript，primiRNA）［19，31］。隨 后，pri-miRNA經(jīng) 包 含 有Dro?sha、RNA聚 合 酶III、DICER-LIKE1和RNAbinding partner DGCR8等多個分子物質的微處理復合體加工為miRNA［31-32］。研究發(fā)現(xiàn)miRNAs和其pri-miRNAs在不同處理條件下的表達水平呈現(xiàn)相同的趨勢［33-34］，這表明通過研究pri-miRNA和miRNA靶基因的表達水平是初步驗證預測miR?NA功能的一個很好嘗試。本研究通過對尖孢鐮孢菌番茄?；途昵秩痉亚昂髉ri-milRNAs及相關靶基因的基因表達水平進行分析，以初步明確milRNAs與靶基因間的調控關系，并對靶基因的功能進行分析。綜合來看，所涉及的milR?NAs與其靶基因之間在一定程度上均呈負調控關系，進一步驗證了Chen Rui等［17］的靶基因預測結果。病原菌fox_milRNA_2a和fox_milRNA_2b可能通過調控靶基因FOXG_03470的不同位點來調控該基因。該基因編碼甘氨酸裂解酶系H蛋白（表3），通過該甘氨酸裂解酶復合物進行甘氨酸脫羧，將甘氨酸裂解為二氧化碳、氨和亞甲基（GO：0019464）。該基因在侵入寄主初期可能是分別受到fox-milRNA_2a和fox_milRNA_2b的調控微量表達，隨后呈逐漸上升趨勢，表明該基因菌株的初侵染過程中起到重要的作用。fox_milRNA_3b的靶基因FOXG_04910編碼保守的假定蛋白（表3），其參與的生物學過程為調節(jié)Rho蛋白信號轉導的頻率、速率和程度（GO：0035023），而Rho類基因在菌株生長中起重要作用［35］。該基因可能受fox_milRNA_3b調控，在病原菌寄主互作0.5 h時FOXG_04910基因大量表達，隨著fox_milRNA_3b相對表達量增長，F(xiàn)OXG_04910基因表達量下將，由此推斷該基因可能與病原菌侵染寄主時信號識別有關。fox_milRNA_4、fox_milRNA_6的靶基因FOXG_00812、FOXG_00067分別為預測蛋白和保守假定蛋白（表3），F(xiàn)OXG_00812在菌株與寄主互作早期的表達量較低，而FOXG_00067的基因表達量隨著侵染時間延長而逐漸上升，說明其可能與菌株的生長相關。目前，這2個基因的生物學功能尚未公布，基因的具體功能有待于進一步的研究。

病原菌與寄主的互作是一個復雜的生物學過程，需要眾多基因來共同協(xié)作完成。因此，基于STRING蛋白互作網(wǎng)絡平臺可通過病原菌已知蛋白間的相互作用探尋目標蛋白互作信息是可行的［36］。諸多的研究結果表明，STRING蛋白互作網(wǎng)絡所預測的相關基因功能在基因功能應用中具有較高的可信性［37-38］。本研究中，部分milRNAs及其靶基因因引物設計問題，未能通過基因表達驗證兩者的靶標關系。但在基于Chen Rui等預測的milRNAs靶基因信息所建立的蛋白互作網(wǎng)絡中，fox_milRNA_1、fox_milRNA_2、fox_milRNA_3和fox_milRNA_8的靶基因間的互作較為緊密（圖3）；該蛋白互作網(wǎng)絡由3個核心模塊組成，模塊1中基因主要涉及的分子功能為氧化還原酶活性，模塊3中基因涉及的分子功能為氨甲基轉移酶活性動、氨基轉移酶活性和谷氨酰胺連接酶活性。該蛋白互作網(wǎng)絡主要涉及的生物學過程為小GTP酶介導的信號轉導。其中fox_milRNA_1、fox_mil?RNA_2的靶基因FOXG_04240和FOXG_03470能夠與多個基因進行互作，可假定為該蛋白互作網(wǎng)絡中的樞紐基因，兩者與病原菌侵染早期的信號識別密相關。因此，未來進一步對尖孢鐮孢菌番茄?；途曛衅渌黰ilRNAs及其靶基因的調控關系作進一步的研究的同時，明確milRNAs與靶基因間的調控關系將會為未來尖孢鐮孢菌致病機理研究指明新的方向。

4 結論

綜上所述，本研究通過分子試驗和生物信息學預測發(fā)現(xiàn)尖孢鐮孢菌侵染番茄時存在milRNAs及其下游靶基因的調控網(wǎng)絡，其中基因相對表達分析證明fox_milRNA_2、fox_milRNA_3、fox_mil?RNA_4和fox_milRNA_6與其靶基因可能存在靶標關系；蛋白互作網(wǎng)絡結果表明，fox_milRNA_1、fox_milRNA_2、fox_milRNA_3和fox_milRNA_8的靶基因間的互作較為緊密，其中靶基因FOXG_03470在菌株初侵染過程中起到重要的作用，F(xiàn)OXG_04910可通過調節(jié)Rho基因影響菌株的生長，推斷其可能跟菌株與寄主的信號識別和菌株在寄主中定植有關，為進一步深入探索尖孢鐮孢菌milRNA相關功能提供一個新思路。