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        干燥方式對秋葵多糖結(jié)構(gòu)特征和抗氧化性的影響

        2022-03-04 04:53:50馬璐瑤林海峰聶少平殷軍藝
        中國食品學(xué)報(bào) 2022年2期
        關(guān)鍵詞:質(zhì)量

        王 喆, 馬璐瑤, 林海峰, 聶少平, 殷軍藝

        (南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌330047)

        秋葵【Abelmoschus esculentus (L.) Moench】是藥食兩用的一年生草本,有多個品種[1]。 最初生長于非洲,現(xiàn)廣泛種植于亞熱帶與熱帶地區(qū),在我國一些地區(qū)(江西、海南、廣東等)也有種植。 這種營養(yǎng)成分豐富、 有一定保健作用的蔬菜深受人們的喜愛。

        秋葵多糖是一種酸性多糖,主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和半乳糖醛酸等組成[2]。 它具有抗疲勞[3],抗氧化[4],調(diào)節(jié)血糖、血脂[5-6],改善腸道狀況[7],調(diào)節(jié)免疫[8]等多種功能活性。秋葵多糖在合成材料上有應(yīng)用前景,可以提高絮凝劑的混凝活性[9],提高乙酰二胺的促生長活性[10],強(qiáng)化其它材料的凝膠性[11],甚至還可用于改變羥基磷灰石的孔隙率, 有望作為骨與軟骨的修復(fù)材料[12]。 在醫(yī)藥領(lǐng)域,秋葵多糖也有一定價值,它可以合成納米銀離子[13],還可以制成運(yùn)載藥物的包材[14]。

        新鮮秋葵水分含量高,容易腐敗變質(zhì),干燥后可以延長秋葵的儲存時間并保留其營養(yǎng)成分[15]。多糖是秋葵中主要的營養(yǎng)成分之一。 對于果蔬的干燥方法已有一些研究, 常用的干燥方法有真空干燥、冷凍干燥、熱風(fēng)干燥、紅外干燥和微波干燥等[16-17]。不同干燥方式的干燥效率與能耗都有所不同, 干燥處理后多糖的結(jié)構(gòu)特征和功能性質(zhì)也會發(fā)生變化。 本文以秋葵為原料,去頭、尾后采用不同干燥方式前處理,然后提取制備多糖,并用多種分析方法比較多糖的結(jié)構(gòu), 分析干燥方式對秋葵水溶性多糖結(jié)構(gòu)特征以及抗氧化功能的影響,為秋葵加工提供理論基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        新鮮秋葵購于江西省萍鄉(xiāng)市福田鎮(zhèn)。

        葡萄糖(Glucose, Glc)、半乳糖醛酸(Galacturonic acid, GalA)、鼠 李 糖(Rhamnose, Rha)、阿拉伯糖 (Arabinose, Ara)、 半乳糖(Galactose,Gal),美國Merck(Sigma-Aldrich)公司;葡萄糖醛酸 (Glucuronic acid, GlcA)、 葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(MW2.0×106,5.0×105,7.0×104,4.0×104,1.0×104u)、考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清蛋白、沒食子酸、福林酚,上海阿拉丁試劑有限公司;乙醇,西隴科學(xué)股份有限公司;濃硫酸等其它化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純級,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        Aglient 1260 超高效液相色譜儀,美國安捷倫科技有限公司;Bruker AVANCE Ⅲ HD 400 MHz NMR 光譜儀, 瑞士Bruker 公司;Dionex ICS 5000 離子色譜儀、Nicolet 5700 紅外光譜儀、Varioskan Flash 多功能酶標(biāo)儀,美國Thermo Scientific 公司;JSM-7610F 場發(fā)射掃描電鏡帶能譜儀,日本電子公司;ARES-G2 流變儀,美國TA 公司;TU 1900 紫外分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;12 L 立式冷凍干燥機(jī), 美國Labconco 公司;DSH-50 A-1 水分測定儀,上海佑科儀器儀表有限公司;Milli-Q 超純水儀,美國Millipore 公司;AL104 電子天平,上海梅特勒-托利多儀器公司。

        1.3 秋葵干燥與秋葵多糖提取

        1.3.1 秋葵預(yù)處理 取形態(tài)大小相似秋葵等分3份,將其洗凈切成2.5 cm 小段,一份在50 ℃干燥48 h 后粉碎得到熱風(fēng)干燥的秋葵原料, 一份在自然狀態(tài)下干燥72 h 后粉碎得到自然干燥的秋葵原料, 一份在-80 ℃干燥68 h 后粉碎得到冷凍干燥的秋葵原料。

        1.3.2 秋葵多糖提取 稱取一定量的秋葵干粉,按料液比1 ∶10 加入95%乙醇浸泡24 h 脫色,過濾收集樣品,揮干乙醇后,按料液比1 ∶60 加入蒸餾水,于60 ℃下水浴條件下提取4 h,離心收集殘?jiān)?,沉淀物重?fù)提取一次,合并上清液,經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后緩慢加入95%乙醇醇沉(終體積分?jǐn)?shù)約為80%),靜置過夜。離心收集沉淀,加入蒸餾水復(fù)溶濃縮后再次醇沉離心收集沉淀,復(fù)溶于水,濃縮凍干得到秋葵多糖。將從熱風(fēng)干燥、自然干燥和真空冷凍干燥后的秋葵中提取得到的多糖,分別記為OPH-60,OPN-60 和OPF-60。

        1.4 基本理化性質(zhì)測定

        1) 總糖測定 以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品, 采用苯酚-硫酸法測定總糖含量[18]。

        2) 蛋白質(zhì)含量測定 以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品,采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量[19]。

        3) 糖醛酸含量測定 以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品,采用硫酸-咔唑法測定糖醛酸含量[20]。

        4) 總酚含量測定 以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品,采用福林酚法測定總酚含量[21]。

        1.5 單糖組成

        稱取5.0 mg 樣品加入試管中, 在冰浴條件下加入12 mol/L 硫酸0.5 mL 水解,加入2.5 mL 超純水混勻,于120 ℃油浴鍋中水解2 h,然后將水解液加水定容、 稀釋, 過孔徑為0.22 μm 的水系濾膜,進(jìn)樣檢測[22-23]。

        色譜條件: 高效陰離子交換色譜配備CarboPacTMPA20 保護(hù)柱 (3 mm × 30 mm) 和CarboPacTMPA20 分析柱(3 mm×150 mm)串聯(lián);流動相:A 為250 mmol/L 氫氧化鈉,B 為超純水,C 為1 mol/L 醋酸鈉,D 為超純水;流速為0.5 mL/min,進(jìn)樣量為10 μL。

        1.6 相對分子質(zhì)量測定

        使用流動相溶解樣品配制成1 mg/mL 溶液,采用孔徑為0.22 μm 的水系濾膜后進(jìn)樣檢測。

        色譜條件:安捷倫1260 型超高效液相色譜儀系統(tǒng), 帶有UltrahydrogelTM分析柱 (7.8 mm×300 mm); 流動相為0.1 mol/L NaNO3和0.02% NaN3的混合溶液;流速為0.6 mL/min;柱溫為35.0 ℃。

        1.7 紅外光譜測定

        取適量樣品采用壓片法, 用傅里葉紅外光譜于波長4 000~500 cm-1區(qū)域內(nèi)進(jìn)行掃描, 掃描分辨率為4 cm-1。

        1.8 核磁共振光譜測定

        取多糖樣品使其完全溶于D2O 中, 充分交換12 h 以上然后凍干, 重復(fù)3 次, 最后用99.9%的D2O 溶解取適量溶液加入核磁管中,靜置過夜,采用400 MHz 核磁共振儀用5 mm 探頭在50 ℃掃描64 次進(jìn)行核磁共振分析。

        1.9 掃描電鏡測定

        配置1 mg/mL 的多糖溶液,置于液氮中冷卻10 min 后凍干, 取樣品進(jìn)行噴金處理, 用JSM-6701F 型場發(fā)射掃描電鏡帶能譜儀觀察樣品表觀形態(tài)。

        1.10 表觀黏度測定

        配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的多糖溶液,完全溶解后于室溫靜置12 h 后用ARES-G2 流變儀測定,同時采用TA-Orchestrator-7 軟件采集數(shù)據(jù)。

        測試條件:溫度25 ℃,40 mm 不銹鋼平板,上下板間距0.4 mm,剪切速率0.01~1 000 s-1。

        1.11 體外抗氧化活性測定

        參照文獻(xiàn)并略作修改進(jìn)行試驗(yàn)。 分別測定3種多糖對DPPH 自由基清除能力[24]、羥自由基清除能力[25]以及對金屬離子螯合能力[24],DPPH 自由基和羥自由基清除能力試驗(yàn)中以VC 作為陽性對照,金屬離子螯合能力試驗(yàn)以EDTA 為陽性對照。根據(jù)以下公式得出多糖及陽性對照的清除率和螯合率。

        式中,A0——蒸餾水的吸光度;A1——多糖溶液本身的吸光度;A2——加入多糖后的吸光度。

        1.12 數(shù)據(jù)分析

        文中表格數(shù)據(jù)采用SPSS 的單因素方差分析進(jìn)行評價, 圖是根據(jù)數(shù)據(jù)由Origin 2017 處理繪圖。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 秋葵多糖基本理化性質(zhì)及單糖組成

        秋葵經(jīng)不同干燥方式處理后提取所得水溶性多糖, 其基本理化性質(zhì)和單糖組成結(jié)果如表1 所示。 3 種多糖的總糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)、總酚含量分別處于67.0%~69.6%、34.3%~38.4%、2.6%~4.5%和0.6%~1.0%。 其中,冷凍干燥后的樣品OPF-60中總糖和糖醛酸含量最高, 達(dá)到69.6%和38.4%,這可能是由于冷凍干燥過程中植物機(jī)制內(nèi)會形成冰晶,導(dǎo)致了植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)更大程度的破裂,促進(jìn)了樣品中活性成分的提取[28],而在熱風(fēng)干燥和自然干燥過程中, 糖醛酸等會因?yàn)檩^高的環(huán)境溫度而變性[29]。

        表1 3 種干燥方式秋葵多糖的理化性質(zhì)(n=3)Table 1 Physical and chemical properties of okra polysaccharides in three drying methods(n=3)

        通過離子色譜儀測定3 種干燥方式多糖單糖組成,發(fā)現(xiàn)均主要由Rha(13.9%~14.9%)、Gal(21.4%~23.4%)和GalA(10.3%~14.7%)組成,而在含量上有所不同,具有結(jié)構(gòu)差異。常用6 種單糖組成比來評價果膠多糖的結(jié)構(gòu)特征[26-27],其中R1是果膠主鏈糖GalA 與側(cè)鏈中所含中性糖的比例,常用作估算果膠線性度。3 種多糖R1值一致,表明線性程度接近;R2表示鼠李半乳糖醛酸(RG)對果膠的貢獻(xiàn),多糖的R2值依次為OPN-60>OPH-60>OPF-60, 表明冷凍干燥降低了果膠的支鏈程度;R3值反映了RG 的半乳糖側(cè)鏈長度,OPN-60 在3種干燥方式中顯示出最高的RG 分支。 在這3 種多糖中,I 型鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(RG-I)的范圍為97.7 至100.0。

        2.2 分子質(zhì)量分布

        采用HPGPC 法測定干燥方式對多糖的分子質(zhì)量分布的影響(圖1),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品洗脫的時間和分子質(zhì)量建立標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算3 種多糖的分子質(zhì)量,3 種多糖在7~16 min 范圍內(nèi)主要有5 個信號峰,信號峰的分布范圍較寬且互相重疊,其中10 min 左右的峰分子質(zhì)量最大(>2×106u),3 種干燥方式多糖分子質(zhì)量分布基本相似, 然而在低分子質(zhì)量區(qū)域還是存在一定的不同。

        圖1 3 種干燥方式秋葵多糖的HPGPC 圖Fig.1 HPGPC diagram of okra polysaccharides in three drying methods

        表2 列出了秋葵多糖每個信號峰對應(yīng)的具體分子質(zhì)量數(shù)值,3 種多糖的分子質(zhì)量分布在1.76×104~2.04×107u, 出峰時間最早的組分P 1 的相對分子質(zhì)量最大的為OPN-60 和OPF-60,最小的為OPH-60。

        表2 3 種干燥方式秋葵多糖的分子質(zhì)量分布(u)Table 2 Molecular weight distribution of okra polysaccharides in three drying methods (u)

        2.3 干燥方式對秋葵多糖紅外光譜的影響

        由圖2 可知,3 400 cm-1處的強(qiáng)吸收峰為多糖類物質(zhì)的特征吸收峰,是O-H 的伸縮振動[30]。 在2 970 cm-1和2 925 cm-1處的吸收峰可能為CH2、CH3或GalA 單元的C-H 伸縮振動[31]。 而在1 600 cm-1處的吸收峰為COO-的伸縮振動[32]。 1 400 cm-1和1 260 cm-1附近的弱吸收峰為GalA 和GlcA 中羧酸的C-O 伸縮振動[33]。 此外,1 048 cm-1附近為果膠的特征吸收峰[34];在880 cm-1左右的吸收峰表明多糖可能存在β 構(gòu)型, 而840 cm-1也出現(xiàn)了代表α 構(gòu)型的弱吸收峰。 由以上結(jié)果可知,3 種多糖主要官能團(tuán)相似, 且都具有果膠多糖的特征吸收峰。

        圖2 3 種干燥方式對秋葵多糖紅外光譜特征的影響Fig.2 Effects of three drying methods on infrared spectra characteristics of okra polysaccharides

        2.4 干燥方式對秋葵多糖1H NMR 的影響

        圖3 為不同干燥方式秋葵多糖于50 ℃條件下的1H NMR 譜圖。 與文獻(xiàn)報(bào)道相比本試驗(yàn)的NMR 譜圖向低場方向略有偏移。 3 種多糖的譜圖雖然相似,但也有一定的差異。 很明顯,3 種多糖中都含有非支鏈的α-1,2-連接的鼠李糖(δ 1.41)和支鏈α-1,2,4-連接的鼠李糖(δ 1.49),在δ 2.07~2.27 范圍的共振信號為-CH3的質(zhì)子峰, 證明了O-乙酰基的存在[35]。在δ 4.45~4.65 范圍內(nèi)出現(xiàn)的異頭信號表明存在末端半乳糖或1,4-連接的半乳糖[36]。在δ 3.98 處有一處較大的信號峰,可能是由于甲基與半乳糖醛酸上羧基的結(jié)合所致[37]。

        圖3 3 種干燥方式對秋葵多糖1H NMR 譜圖的影響Fig.3 Effects of three drying methods on 1H NMR diagram of okra polysaccharides

        2.5 干燥方式對秋葵多糖表面形貌的影響

        由圖4 可知,3 種多糖的微觀結(jié)構(gòu)相似,其主體均由線性結(jié)構(gòu)和片狀結(jié)構(gòu)組成。 其中,OPH-60為線性結(jié)構(gòu),OPN-60 為線性結(jié)構(gòu)和片狀結(jié)構(gòu)交聯(lián),OPF-60 主要為線性和片狀結(jié)構(gòu), 除此之外還分布著多孔結(jié)構(gòu), 這是由于原料在冷凍干燥過程中, 水分直接由固態(tài)升華到氣態(tài)而未受到外力的破壞所致[28]。

        圖4 3 種干燥方式對秋葵多糖微觀結(jié)構(gòu)的影響(5 000×)Fig.4 Effects of three drying methods on the microstructure of okra polysaccharies (5 000×)

        2.6 干燥方式對秋葵多糖流變特性的影響

        由圖5 可知,剪切速率在0.1~1 000 s-1范圍,3 種秋葵多糖的表觀黏度隨著剪切速率的增大而減小,表現(xiàn)出明顯的剪切稀化現(xiàn)象,多糖黏度減小原因是隨著剪切速率的加快, 分子間的相互作用力被破壞,使得多糖流動性增大[38]。 在0.1~1 000 s-1范圍的剪切速率下,OPH-60 表觀黏度最大,OPF-60 表觀黏度其次,OPN-60 的表觀黏度最小, 這可能與樣品總蛋白質(zhì)與單糖組成的類型和含量有關(guān)[39],例如有文獻(xiàn)報(bào)道稱,蛋白質(zhì)含量降低,黏度增大[40]。 此外3 個組分間的黏度差異可能和分子質(zhì)量也有關(guān)系,即通過測定過膜前、后多糖的糖含量,發(fā)現(xiàn)其含量差異較大,濾膜對于多糖的截留率從大到小依次為OPF-60(50.93%)>OPN-60(45.86%)>OPH-60(40.58%),這可能是由于較小孔徑的水系濾膜將多糖中較大的分子質(zhì)量的組分截留在膜外, 因此導(dǎo)致較大分子質(zhì)量組分未通過儀器檢測,使得測得的分子質(zhì)量相似。

        圖5 3 種干燥方式對秋葵多糖表觀黏度的影響Fig.5 Effects of three drying methods on apparent viscosity of okra polysaccharides

        采用Power-law 模型計(jì)算3 種干燥方式秋葵多糖剪切稀化的流變參數(shù), 模型擬合R2>0.99,表3 中可以發(fā)現(xiàn)它們的流動特性指數(shù)均小于1,表明3 種多糖均屬于假塑性流體。 它們的K 值大小依次是OPH-60>OPF-60>OPN-60,與表觀黏度的變化趨勢一致,OPN-60 的n 值最大, 其假塑性相對最低。

        表3 3 種干燥方式秋葵多糖的剪切稀化流變參數(shù)(n=3)Table 3 Rheological parameters of shear thinning of okra polysaccharide in three drying modes (n=3)

        2.7 干燥方式對秋葵多糖體外抗氧化活性的影響

        圖6 顯示3 種秋葵多糖對DPPH 自由基、羥自由基清除能力和金屬離子螯合能力。 從圖中可以看出, 隨著多糖質(zhì)量濃度的增加,3 種多糖對DPPH 自由基、 羥自由基清除能力和金屬離子螯合能力也都增強(qiáng)。 在相同的多糖質(zhì)量濃度, 對于DPPH 自由基的清除能力依次為OPN-60>OPH-60>OPF-60; 對于羥自由基,OPN-60 的清除能力最強(qiáng),OPH-60 和OPF-60 的清除能力相似;3 種多糖對金屬離子的螯合能力依次為OPN-60>OPH-60>OPF-60??傮w數(shù)據(jù)來看,3 種秋葵多糖都具有體外抗氧化活性,OPN-60 的體外抗氧化活性最強(qiáng),這可能是與多糖中的總酚含量有一定關(guān)系,有研究表明多糖中其抗氧化作用的主要物質(zhì)是多酚[41]。

        圖6 3 種干燥方式秋葵多糖的抗氧化能力Fig.6 Antioxidant capacity of okra polysaccharide in three drying methods

        3 結(jié)論

        3 種干燥方式處理秋葵, 得到的秋葵多糖都是RG-I 型果膠多糖, 它們的得率和化學(xué)組成都有所不同,秋葵多糖的蛋白質(zhì)含量、糖醛酸含量、總酚含量出現(xiàn)了顯著變化。通過單糖組成、紅外光譜和表面形貌分析, 發(fā)現(xiàn)干燥方式主要對多糖相關(guān)成分的含量(如單糖組成比例、官能團(tuán)響應(yīng)值之間的比例) 產(chǎn)生影響, 而對它們的種類影響不明顯。 3 種干燥方式秋葵多糖都表現(xiàn)出弱凝膠行為,都屬于假塑性流體, 熱風(fēng)干燥處理的秋葵所提取的多糖黏度相對較大, 在體外抗氧化活性中可以發(fā)現(xiàn)OPN-60 的抗氧化活性最好, 真空冷凍干燥得到的多糖中總糖、糖醛酸含量最高。 3 種方法在對樣品的處理后得到的多糖都有其各自結(jié)構(gòu)和功能特性。

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