汪媛媛， 常海波， 張 增， 張家超

（海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 海口570228）

淀粉是由葡萄糖分子聚合而成的高分子碳水化合物，是人類膳食中主要的組成部分，主要分為直鏈淀粉、支鏈淀粉和抗性淀粉三大類[1]。

木薯為世界三大薯類作物（木薯、甘薯、馬鈴薯）之一，是一種淀粉根作物，是熱帶、亞熱帶地區(qū)生活的人類日常膳食最主要能量來(lái)源， 其嫩莖葉富含優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)， 具有很高的食用價(jià)值和工業(yè)利用價(jià)值[2-3]。 木薯富含淀粉，其塊根含30%的淀粉，木薯干則含有70%的淀粉，普通木薯淀粉屬于可消化淀粉，支鏈淀粉和直鏈淀粉含量比為4∶1[4]。淀粉組成中支鏈淀粉越高， 越易被人體消化吸收并引起胰島素應(yīng)答，更容易引發(fā)肥胖[5]，而高直鏈淀粉消化速率慢，部分不被前端小腸消化，在后端小腸和大腸中消化吸收， 抗性淀粉不易被小腸消化吸收， 而能夠在盲腸和結(jié)腸中被緩慢吸收利用[6]。 抗性淀粉能促進(jìn)腸道益生菌的生長(zhǎng)繁殖，如雙歧桿菌、乳酸菌等[7]。 人體攝入抗性淀粉食物可減緩餐后血糖上升，增加脂質(zhì)的排泄，從而減少機(jī)體對(duì)熱量的吸收利用，同時(shí)可以維持飽腹感[8]，有效控制體重。

動(dòng)物腸道中存在著種類繁多、 數(shù)量龐大的微生物，它們相互制約、平衡共生，共同維持腸道環(huán)境的穩(wěn)定[9]。腸道菌群在一定程度上也是人類的一個(gè)重要器官， 它在維持人體健康中發(fā)揮的作用遠(yuǎn)超人們的想象[10]，為宿主提供自身不具備的反應(yīng)酶和生化反應(yīng)途徑， 使機(jī)體可以消化吸收一些不能直接吸收利用的物質(zhì)并產(chǎn)生正常生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，與人體的營(yíng)養(yǎng)、免疫和代謝等息息相關(guān)[11]。

相比于抗性淀粉，木薯淀粉屬于可消化淀粉，支鏈淀粉含量高達(dá)80%， 目前的研究多集中于對(duì)結(jié)構(gòu)的解析， 對(duì)體外功能評(píng)價(jià)以及有益碳源的研究[12-13]，有必要對(duì)潛在的有害支鏈淀粉進(jìn)行基于腸道菌群的營(yíng)養(yǎng)評(píng)估。本研究基于小鼠肥胖模型，采用16S rRNA 基因序列同源性分析技術(shù)分析小鼠血液中總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）以及免疫指標(biāo)免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM），并分析腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)以及代謝通路的， 旨在研究攝入木薯淀粉對(duì)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響， 也為以腸道菌群為靶點(diǎn)的人體腸道微生態(tài)平衡調(diào)控及宿主健康飲食提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

C57BL/6 小鼠采購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，均為4 周齡雄性，體重18～20 g，經(jīng)過(guò)一周適應(yīng)期后用于實(shí)驗(yàn)，飼喂溫度為26 ℃，每天更換一次墊料。

基礎(chǔ)飼料（玉米41%、麩皮26%、豆餅29%、食鹽1%、骨粉1%、賴氨酸1%、其它1%）、高脂飼料（膽固醇1%、蛋黃粉10%、豬油10%、膽酸鈉0.2%、基礎(chǔ)飼料78.8%組成），所有的飼料均由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。

木薯淀粉，上海楓未實(shí)業(yè)有限公司；測(cè)定血液總膽固醇（TC）試劑盒、測(cè)定血液甘油三酯（TG）試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；測(cè)定小鼠免疫指標(biāo)免疫球蛋白M（IgM）試劑盒、測(cè)定小鼠免疫指標(biāo)免疫球蛋白A（IgA）試劑盒、測(cè)定小鼠免疫指標(biāo)免疫球蛋白G（IgG）試劑盒，上海信裕生物科技有限公司。

1.2 儀器和設(shè)備

PCR 擴(kuò)增儀，杭州朗基科學(xué)有限公司；凝膠成像分析系統(tǒng)，美國(guó)Cell Biosciences 公司；高速冷凍干燥機(jī)，Thermo Scientific 公 司；DYY-12 電 泳儀，北京市六一儀器廠；TGL-16G 高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 建立模型與實(shí)驗(yàn)樣本分組 所有40 只小鼠平均分成4 組。 4 組分別為對(duì)照組、模型組和2個(gè)處理組。 對(duì)照組（Z）： 飼喂基礎(chǔ)飼料； 高脂組（G）：飼喂高脂飼料；處理組1（MZ）：飼喂基礎(chǔ)飼料和木薯淀粉（含量10%）的混合飼料；處理組2（MG）：飼喂高脂飼料和木薯淀粉（含量10%）的混合飼料。

1.3.2 觀察指標(biāo)

1） 一般情況 體質(zhì)量；

2） 血液臨床指標(biāo) 總膽固醇（TC）、甘油三酯（TC）；

3） 免疫指標(biāo)檢測(cè) 免疫球蛋白G （IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)小鼠血液及糞便收集 每日上午9 點(diǎn)對(duì)每組小鼠置換10 g 新的飼料和飲水，每7 d 對(duì)每組小鼠的體重進(jìn)行稱量并記錄數(shù)據(jù)。 參考相關(guān)肥胖造模方法[14]，試驗(yàn)周期為4 周，第2、4 周分別從各籠子中收集糞便，置于2 mL 樣品管中，收集約1 g 糞便， 做好標(biāo)簽置于-40 ℃冰箱中保存，用于16S rRNA 測(cè)序。 第4 周飼養(yǎng)結(jié)束，對(duì)小鼠禁食12 h 后，眼球取血0.5～0.7 mL，常溫放置1 h 后進(jìn)行離心（2 500 r/min，10 min），吸取血清并保存于-80 ℃冰箱。

1.4 16S rRNA 高通量測(cè)序

采用CTAB 凍融法[15-17]提取菌株基因組DNA。 利用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，100V 電壓，0.5×TBE 電泳液中電泳15 min， 用Nanodrop 通過(guò)OD260/280比值檢測(cè)DNA 的純度并用Qubit 2.0 對(duì)DNA 濃度進(jìn)行精確定量。提取的DNA 樣品于-20℃保存。

擴(kuò)增16s rRNA 的V3-V4 區(qū)， 引物為338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）[18-19]。 PCR 擴(kuò)增體系（50 μL）：基因 組DNA 模板（100 ng/μL）1.5 μL、引物（10 pmol/μL）各1.5 μL、2×Es Taq Master Mix（高純度耐熱DNA 聚合酶）擴(kuò)增預(yù)混合液25 μL、ddH2O 20.5 μL。

反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min， 循環(huán)30次；72 ℃末端延伸10 min；4 ℃恒溫保存。

PCR 擴(kuò)增結(jié)束后， 取2 μL PCR 產(chǎn)物與2 μL 6×上樣緩沖液混合均勻于1.0%瓊脂糖凝膠中點(diǎn)樣電泳（100 V，15 min），如在468 bp 附近觀察到清晰的條帶， 且無(wú)明顯的特異性擴(kuò)增， 表明PCR成功。 DNA 樣品送于北京諾禾致源科技股份有限公司，采用Illumina HiSeq 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。 下機(jī)后使用QIIME 工具包進(jìn)行分析[20]，根據(jù)97%的序列相似度將所有序列進(jìn)行同源比對(duì)并聚類成可操作分類單元（Operational taxonomic units， OTUs）后與數(shù)據(jù)庫(kù)Greengenes 進(jìn)行比對(duì)以獲得物種信息，基于微生物OTU 表進(jìn)行PICRUSt 宏基因組功能預(yù)測(cè)[21]，通過(guò)與KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)得到二級(jí)和三級(jí)功能基因代謝通路的預(yù)測(cè)結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用R 軟件進(jìn)行。使用“ggplot”包進(jìn)行PCoA 分析[22]；熱圖的繪制使用“pheatmap”包繪制的；箱型圖的繪制使用了“ggpubr”包[23]；微生物菌屬的含量以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示， 采用Wilcoxon 檢驗(yàn)和Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)進(jìn)行不同組別差異性比較分析， 基于Weighted Unifrac 距離的PCoA 主坐標(biāo)分析和Heatmap 均采用R 程序做圖，R 程序計(jì)算Spearman 相關(guān)性后， 通過(guò)Cytoscape 實(shí)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)圖的可視化。 原始測(cè)序數(shù)據(jù)已經(jīng)上傳至NCBI（項(xiàng)目號(hào)：PRJNA663287）。

2 結(jié)果分析

2.1 實(shí)驗(yàn)小鼠體重對(duì)比結(jié)果分析

將4 周小鼠的體重進(jìn)行比較， 結(jié)果見(jiàn)圖1（*為P＜0.05）。 在0 周和1 周，4 組小鼠體重?zé)o明顯差異（P＞0.05）；在第2 周，與Z 組小鼠體重進(jìn)行比較，MZ 組和MG 組小鼠體重有顯著升高（P＜0.05）同時(shí)MZ 組和G 組無(wú)顯著差異（P＞0.05）； 在第4周， 與Z 組小鼠進(jìn)行比較，MZ 組和MG 組小鼠體重有顯著升高（P＜0.05），同時(shí)MZ 組和G 組無(wú)顯著差異。由此可見(jiàn)，對(duì)小鼠喂養(yǎng)含有木薯淀粉的飼料更容易導(dǎo)致體重上升。

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠的體質(zhì)量Fig.1 The weight of each group at different times

2.2 實(shí)驗(yàn)小鼠血液臨床與免疫指標(biāo)分析

采用試劑盒對(duì)小鼠血液進(jìn)行血液臨床指標(biāo)TG、TC 和免疫指標(biāo)IgG、IgA、IgM 測(cè)定， 結(jié)果如表1 所 示。 G 組、MZ 組 和MG 組 與Z組免疫指標(biāo)IgG、IgA、IgM 的含量相比顯著升高 （P＜0.05）；G組、MZ 組與Z 組相比TG 的含量顯著升高（P＜0.001），MG 組與Z 組相比無(wú)顯著差異（P＞0.05）；G 組、MZ 組和MG 組與Z 組TC 的含量相比無(wú)顯著差異（P＞0.05）。 由此可見(jiàn)，高脂飲食和含有木薯淀粉的飼料能提高小鼠的血脂水平和免疫球蛋白IgA、IgG、IgM 的含量。

表1 小鼠血清觀察指標(biāo)分析Table 1 Analysis of serum observed indexes of mice

2.3 腸道微生物菌群多樣性分析

為了對(duì)樣品中微生物多樣性和物種豐富度進(jìn)行比較， 計(jì)算了樣品中ACE 指數(shù)、Chao1 指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)（Shannon）和辛普森指數(shù)（Simpson）。如圖2所示，ACE 指數(shù)和Chao1 指數(shù)在各樣品組間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），表示各組樣品微生物豐富度無(wú)顯著差異；對(duì)于香農(nóng)指數(shù)（Shannon），MZ 組與Z組和MZ 組與G 組的2 周和4 周的樣品均有顯著性差異 （P＜0.05），MG 組與G 組4 周的樣品也有顯著性差異（P＜0.05）；對(duì)于辛普森指數(shù)（Simpson），MZ 組與Z 組2 周的樣品有顯著性差異，MZ 組與G 組2 周和4 周的樣品均有顯著性差異 （P＜0.05），MG 組與G 組4 周的樣品也有顯著性差異（P＜0.05），同時(shí)MG 組和MZ 組的樣品在不同的時(shí)間點(diǎn)（2 周和4 周）也有顯著性差異，均能說(shuō)明木薯淀粉攝入后腸道微生物多樣性降低。

圖2 小鼠腸道微生物α 多樣性比較Fig.2 The α diversity of gut microbiota in mice

2.4 腸道微生物群落結(jié)構(gòu)與差異性菌屬分析

基于非加權(quán)（Unweighted unifrac）距離的主坐標(biāo)分析（Principal coordinate analysis， PCoA）對(duì)樣品進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3a 和3b 所示。G 組、MZ 組和MG 組與Z 組相比較， 小鼠腸道菌群構(gòu)成在主坐標(biāo)上的位置存在明顯聚類，MZ 組與G 組，4 周較2 周菌群結(jié)構(gòu)逐漸靠近的趨勢(shì)， 說(shuō)明高脂飲食和木薯淀粉的攝入會(huì)改變小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)。 進(jìn)一步細(xì)化差異性菌屬，G 組、MZ 組和MG 組與Z組相比較， 差異性菌屬中蘇黎世桿菌屬和多爾氏菌屬顯著減少，雙歧桿菌屬顯著增加；MZ 組、G 組與Z 組相比較，差異性菌屬艾克曼菌屬顯著減少。

圖3 β 多樣性與差異性菌屬分析Fig.3 Ananlysis of beta diversity and differential genus

2.5 腸道微生物差異性功能單元分析

選取貢獻(xiàn)率大于1%且經(jīng)Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)P 值小于0.05 的差異微生物代謝通路繪制成氣泡圖，結(jié)果如圖4 所示。三級(jí)代謝通路主要差異主要和碳水化合物代謝、 氨基酸代謝和糖代謝有關(guān)，MZ 組與其它組相比， 氨基酸代謝和碳水化合物代謝呈現(xiàn)增高的趨勢(shì)。 對(duì)于代謝通路分子伴侶催化蛋白質(zhì)折疊， 與Z 組相比，G 組明顯降低，而MG 組明顯升高。對(duì)于與細(xì)菌運(yùn)動(dòng)蛋白相關(guān)的代謝通路，與Z 組相比，G 組明顯上升而MG 組明顯降低。

圖4 腸道微生物差異性功能單元分析Fig.4 Analysis of different ial functional units of gut microbiota

2.6 腸道微生物差異性菌屬、三級(jí)代謝通路以及生化指標(biāo)的相關(guān)性分析

目標(biāo)選取平均含量大于1%、代謝通路貢獻(xiàn)率大于1%的差異性菌屬， 通過(guò)Spearman 相關(guān)性計(jì)算r 值，選擇相關(guān)性大于0.6 的菌屬、三級(jí)代謝通路以及生化指標(biāo)構(gòu)建關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。圖5 中，紅色代表正相關(guān)，藍(lán)色代表負(fù)相關(guān)，用于表示相關(guān)性強(qiáng)弱的線條顏色連續(xù)變化。G 組和Z 組相較（圖5a），三級(jí)代謝通路主要與碳水化合物和糖代謝有關(guān)，其中糖代謝與艾克曼菌屬有極強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系，核糖體合成和氨基酸代謝與擬桿菌屬存在正相關(guān)，碳水化合物代謝和甲烷代謝與艾克曼菌屬極強(qiáng)負(fù)相關(guān)。副擬桿菌屬只與TG 呈正相關(guān)。木薯高脂組和對(duì)照組相較（圖5b），三級(jí)代謝通路主要與碳水化合物和氨基酸代謝有關(guān)， 其中糖代謝和氨基酸代謝與艾克曼菌屬有極強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系， 甲烷代謝和碳水化合物代謝與艾克曼菌屬有極強(qiáng)的負(fù)相關(guān)關(guān)系， 免疫指標(biāo)IgA 和IgM 與厭氧枝原體屬有極強(qiáng)的負(fù)相關(guān)關(guān)系。木薯正常組和對(duì)照組相較（圖5c），三級(jí)代謝通路主要與氨基酸代謝有關(guān)，其中氨基酸代謝主要和低嗜鹽細(xì)菌屬有極強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系， 糖代謝和甲烷代謝與艾克曼菌屬有極強(qiáng)的負(fù)相關(guān)關(guān)系，TG 指標(biāo)與多爾氏菌屬、 瘤胃球菌屬和低嗜鹽細(xì)菌屬有極強(qiáng)的負(fù)相關(guān)關(guān)系。

圖5 腸道微生物差異性菌屬、三級(jí)代謝通路以及生化指標(biāo)的相關(guān)性分析Fig.5 Correlation analysis of different genera of gut microbiota， tertiary metabolic pathways and biochemical indicators

3 討論

本研究采用小鼠動(dòng)物模型， 通過(guò)建立肥胖模型以及喂養(yǎng)含木薯淀粉的飼料， 采用16S rRNA擴(kuò)增子高通量測(cè)序技術(shù)分析了小鼠攝入木薯淀粉后生理生化指標(biāo)以及腸道微生物菌群和代謝通路的變化。

木薯淀粉屬于極易被腸道消化吸收的支鏈淀粉，容易引起胰島素應(yīng)答[24]，因此更容易引發(fā)肥胖。 本研究的試驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠體內(nèi)總膽固醇的含量差異不顯著， 可能由于腸道中具有改善脂質(zhì)代謝紊亂功能的雙歧桿菌相對(duì)豐度的增加。 攝入木薯淀粉有效改變了小鼠的腸道微生物組，與對(duì)照組相比， 蘇黎世桿菌屬和多爾氏菌屬顯著減少，雙歧桿菌屬顯著增加。蘇黎世桿菌屬參與發(fā)酵代謝，乳酸是其主要代謝產(chǎn)物，具有調(diào)節(jié)肌肉和抗疲勞的作用[25]。 由于攝入極易被腸道消化吸收的木薯淀粉， 雙歧桿菌可以高效分解利用碳水化合物，代謝產(chǎn)生乙酸和乳酸，且可以降低血清膽固醇和甘油三酯，改善脂質(zhì)代謝紊亂[26-27]。 試驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠體內(nèi)總膽固醇的含量差異不顯著， 可能是由于雙歧桿菌相對(duì)豐度的增加以及其具有改善脂質(zhì)代謝紊亂的功能所致。

小鼠腸道內(nèi)能代謝產(chǎn)生短鏈脂肪酸的益生菌的顯著減少可能是小鼠更容易患上肥胖癥的原因之一。 短鏈脂肪酸可以作用于β 細(xì)胞促進(jìn)胰島素的分泌從而緩解肥胖以及有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)腸道內(nèi)益生菌代謝產(chǎn)生的丁酸可以抑制非酒精性脂肪肝小鼠的系統(tǒng)性肥胖[28]。 木薯高脂組腸道微生物蘇黎世桿菌屬、多爾氏菌屬、普氏菌屬、糞球菌屬以及瘤胃球菌屬的相對(duì)豐度都顯著降低。 糞球菌屬Coprococcus 能發(fā)酵碳水化合物，代謝產(chǎn)生丁酸[29]。瘤胃球菌屬主要靠吸收單糖和降解黏蛋白來(lái)獲取能量，其主要發(fā)酵代謝產(chǎn)物為乙酸和丁酸[30]。 腸道內(nèi)能代謝產(chǎn)生乙酸、 丁酸等短鏈脂肪酸的有益菌顯著減少， 可能是小鼠更容易患上肥胖癥的原因之一。

小鼠飼喂高脂飲食同時(shí)攝入木薯淀粉， 會(huì)使腸道微生物中一些代謝產(chǎn)生短鏈脂肪酸的有益微生物的相對(duì)豐度顯著降低， 同時(shí)比對(duì)高脂組與木薯高脂組腸道微生物豐富度及均勻度發(fā)現(xiàn)兩者相似。在攝入高脂飼料與木薯淀粉后，小鼠的碳水化合物代謝和甲烷代謝升高， 與相對(duì)豐度降低的艾克曼菌屬呈極強(qiáng)的負(fù)相關(guān)關(guān)系； 木薯高脂組與對(duì)照組相比腸道微生物中艾克曼菌屬相對(duì)豐度顯著增加。 有關(guān)研究表明， 艾克曼菌屬有助于降低肥胖、糖尿病、炎癥等疾病的風(fēng)險(xiǎn)[31]，然而當(dāng)艾克曼菌屬相對(duì)豐度太高的時(shí)候反而會(huì)有相反的作用，加劇肥胖程度[32]，可見(jiàn)木薯淀粉與高脂飲食有類似加劇肥胖程度的作用。

基于腸道微生物及其代謝通路的網(wǎng)路互作分析可以看出， 攝入木薯淀粉提供了豐富的碳水化合物， 促進(jìn)了能分解代謝碳水化合物的微生物如雙歧桿菌屬和多爾氏菌屬相對(duì)豐度的增加， 也增加了如梭狀芽胞桿菌屬[33-34]等致病菌的增殖。木薯淀粉介導(dǎo)的腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變使小鼠腸道代謝產(chǎn)物的改變， 同時(shí)豐富的碳水化合物也給機(jī)體提供了足夠的能量來(lái)源，從而增加了能量的儲(chǔ)存，生理生化指標(biāo)如總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）以及免疫指標(biāo)免疫球蛋白A （IgA）、 免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）以及腸道環(huán)境的改變表明攝入木薯淀粉更容易導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生肥胖癥狀。