◎ 那 吉，張海芬，楊峰玉，馬 嬌

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)海源學(xué)院，云南 昆明 650106；2.云南民族大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650500；3.滇西應(yīng)用技術(shù)大學(xué)，云南 大理 671000）

當(dāng)人體內(nèi)自由基與抗氧化劑失衡時(shí)會(huì)加速人體衰老并誘發(fā)機(jī)體的組織器官發(fā)生病變[1-2]，若能適量攝入外源自由基清除劑可有效清除體內(nèi)過剩自由基，有助于減輕及延緩機(jī)體氧化損傷。因此，從傳統(tǒng)的日常飲食中尋求安全可靠的天然抗氧化劑已成為功能食品開發(fā)的熱點(diǎn)[3-4]。

苦蕎麥（Fagopyrum tataricumGaertn.）又名野蕎麥、韃靼蕎麥，在我國西南、中南、華北等省區(qū)均有分布?！侗静菥V目》記載：“苦蕎味苦，性平寒，能實(shí)腸胃，益氣力，續(xù)精神，利耳目，煉五臟渣穢”[5]?，F(xiàn)代研究證實(shí)，苦蕎麥不僅含有人體所需較為全面均衡的氨基酸、蛋白質(zhì)和維生素，還因其含有其他禾谷類所缺乏的黃酮類化合物而表現(xiàn)出顯著的抗氧化、降三高、抗腫瘤和抗炎鎮(zhèn)痛等多種藥理活性[6-7]，是一種非常符合現(xiàn)代人健康觀念的天然抗氧化劑。

傳統(tǒng)的蕎麥抗氧化研究方法主要集中于利用有機(jī)溶劑提取有效成分后再評(píng)價(jià)抗氧化活性大小。許剛[8]對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)水浴法和超聲法所得蕎麥黃酮提取物對(duì)DPPH具有明顯的清除率。曹曉虹等[9]發(fā)現(xiàn)試劑盒蕎麥水提液對(duì)·OH、O2-·及DPHH·具有較強(qiáng)的清除作用。張國濤[10]等人發(fā)現(xiàn)蕎麥皮、蕎麥粉和蕎麥粒乙醇提取物對(duì)DPPH·自由基和ABTS·自由基均有良好的清除效果。顯然，傳統(tǒng)的蕎麥抗氧化研究方法雖能測(cè)定出苦蕎麥中抗氧化活性成分的含量，但并未考慮人體消化過程對(duì)苦蕎黃酮產(chǎn)生的影響，因此測(cè)定結(jié)果無法真實(shí)反映蕎麥黃酮在人體內(nèi)的抗氧化活性變化[11-13]。

與體內(nèi)消化模型相比，體外模擬胃腸消化模型因具備操作簡(jiǎn)單、安全、可重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)而被廣泛應(yīng)用于模擬消化實(shí)驗(yàn)中[14]。目前有關(guān)云南苦蕎米飯?jiān)隗w外模擬胃腸消化過程中抗氧化成分及其活性的變化研究鮮有報(bào)道。鑒于此，本文以云南苦蕎米為材料，首先通過模擬人體日常飲食方式將其加工成苦蕎米飯后，通過模擬胃腸消化過程，采用水溶性ABTS法測(cè)定模擬消化液的抗氧化活性，研究云南苦蕎米飯?jiān)隗w外模擬胃腸消化過程中黃酮釋放量及抗氧化活性的變化規(guī)律，以期為深入研究云南苦蕎在體內(nèi)的真實(shí)消化及其抗氧化成分變化規(guī)律提供有效的理論依據(jù)，也為苦蕎新功能性食品研發(fā)提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

云南苦蕎米，2019年7月購于云南東巴客食品有限公司，常溫、避光儲(chǔ)藏。胃蛋白酶、胰蛋白酶，北京索萊寶科技有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，購于天津市一方科技有限公司；ABTS，美國Sigma公司；無水乙醇、磷酸二氫鉀、硝酸鋁、亞硝酸鈉等其他試劑均為國產(chǎn)分析純；超純水為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1950紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；JR05-300不銹鋼多功能料理機(jī)、蘇泊爾（SUPOR）電飯煲，浙江蘇泊爾電器有限公司；FA2004電子分析天平，上海上平儀器公司；PHS-3C酸度計(jì)，上海卓精電子科技有限公司；HA-B水浴恒溫振蕩器，天津市泰斯特儀器有限公司；TGL-60B高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 苦蕎米飯樣品的加工

采用模擬人體日常飲食方式加工苦蕎米。取適量苦蕎米于電飯煲中加水煮熟，用多功能料理機(jī)搗碎至一定細(xì)度，裝入自封袋內(nèi)于-4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 體外模擬胃腸消化實(shí)驗(yàn)

（1）體外模擬胃消化。參照文獻(xiàn)[11-13]中方法并改進(jìn)，稱取5 g苦蕎米飯，加入50 mL生理鹽水混勻后搗碎3 min制成勻漿液。模擬胃消化實(shí)驗(yàn)共有3個(gè)平行組，模擬胃消化組：取50 mL勻漿液用水浴加熱至37 ℃，用1.0 mol·L-1的HCl溶液調(diào)節(jié)pH至2.0，加入20 mL模擬胃液（1.0 g胃蛋白酶溶于50 mL水）。胃酸對(duì)照組：胃蛋白酶消化液用等體積的0.01 mol·L-1HCl溶液進(jìn)行替代。胃空白對(duì)照組：50 mL勻漿液中加入20 mL生理鹽水。避光后沖入氮?dú)?，?7 ℃恒溫水浴搖床中振搖，分別在消化0 h、0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h和4 h時(shí)取定量消化液4 500 r·min-1離心兩次，收集上清液儲(chǔ)存于-20 ℃，備用。

（2）體外模擬腸消化。按照上述方法先將苦蕎米飯模擬胃消化過程1.5 h后，在此消化液中繼續(xù)模擬腸消化。模擬腸消化實(shí)驗(yàn)中有2個(gè)平行組。①模擬腸消化組：50 mL勻漿液于37 ℃經(jīng)過模擬胃消化1.5 h后用1 mol/L NaHCO3溶液調(diào)至pH為7.0，加入20 mL人工模擬腸液（0.68 g磷酸二氫鉀中加入50 mL蒸餾水后加入1.0 g胰蛋白酶）。②腸空白對(duì)照組：用等體積的NaHCO3-Na2CO3緩沖溶液替代模擬腸液進(jìn)行試驗(yàn)。兩組模擬消化液均于37 ℃恒溫水浴搖床中避光振搖，分別在消化0 h、0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、3.0 h和4 h時(shí)取定量消化液4 500 r·min-1離心10 min，收集上清液儲(chǔ)存于-20 ℃。

1.3.3 蘆丁濃度與吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

參考繆園欣等[15]的研究方法稍做改進(jìn)，準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品13 mg于25 mL容量瓶中，加乙醇完全溶解后定容；將上述溶液稀釋至質(zhì)量濃度為0.104 mg·mL-1，裝入棕色容量瓶中備用。分別準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL和5.00 mL于10 mL比色管中，加入0.5 mL 5%NaNO2溶液，反應(yīng)靜置5 min后再加入10% Al(NO3)3溶液0.5 mL反應(yīng)5 min。加入4%NaOH溶液4.0 mL，搖勻靜置15 min后于波長510 nm處測(cè)量吸光度值，以吸光度值對(duì)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 模擬消化液中總黃酮含量的測(cè)定

將模擬消化液適當(dāng)稀釋后準(zhǔn)確移取1.0 mL樣品溶液，按1.2.3的操作方法測(cè)得樣品模擬消化液中總黃酮的含量。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，總黃酮含量以每百克苦蕎米飯中所含蘆丁當(dāng)量表示，單位為mg/100 g，根據(jù)模擬胃腸消化液中黃酮含量計(jì)算苦蕎米飯中總黃酮的釋放量。總黃酮的釋放量按下式計(jì)算：

式中：ρ1為模擬胃腸消化液中總黃酮含量，mg·mL-1；V1為模擬胃腸消化液的總體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；m為苦蕎米飯樣品質(zhì)量，g。

1.3.5 模擬胃腸消化液清除ABTS自由基能力測(cè)定

參照李培源等[16]的實(shí)驗(yàn)方法并做改進(jìn)：將7.4 mmol·L-1的 ABTS 儲(chǔ) 備 液 和 等 量 2.6 mmol·L-1的K2S2O8儲(chǔ)備液于室溫下混合避光保存12～16 h后，使用前用磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.40）稀釋，使其吸光度值為0.7±0.02，上述溶液需于4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

向200 μL模擬消化液中加入4.0 mL ABTS溶液，于室溫下避光反應(yīng)8 min后測(cè)定其吸光度值（λmax=734 nm），樣品的清除率（%）計(jì)算如下：

式中：Ai為樣品與ABTS自由基溶液的吸光度；Aj為樣品與緩沖溶液的吸光度；A0為ABTS自由基溶液與蒸餾水的吸光度。）

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2012軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（X—±RSD）和顯著性水平（p＜0.05）。

2 結(jié)果與討論

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為A=11.192C+0.007 3，R2=0.999 0，表明在該濃度范圍內(nèi)蘆丁與吸光度線性關(guān)系良好。

2.2 體外模擬胃腸消化液中總黃酮的釋放量

模擬胃腸消化液中總黃酮釋放量的變化結(jié)果見圖1和圖2。由圖1可知，在模擬胃消化過程的4 h內(nèi)，空白對(duì)照組中黃酮釋放量變化不明顯，但胃酸對(duì)照組和模擬胃液消化組中黃酮釋放量隨模擬時(shí)間的延長而逐漸上升。當(dāng)模擬消化1.5 h時(shí)，兩組中黃酮釋放量均已達(dá)最大值（p＜0.05），具有顯著性差異，之后變化趨于穩(wěn)定。1.5 h時(shí)空白對(duì)照組的黃酮釋放量?jī)H為（58.6±2.69）mg Rutin/100 g，此時(shí)模擬胃液組中黃酮釋放量為（111.8±3.5）mg Rutin/100 g，釋放量比空白組增加1.91倍，胃酸對(duì)照組中黃酮釋放量（73.6±2.86）mg Rutin/100 g比空白組增加1.26倍。由圖2可知，消化液中黃酮釋放量在模擬腸消化階段呈下降的趨勢(shì)（p＜0.05），并于消化1 h后逐漸趨于穩(wěn)定。模擬消化1 h時(shí)，模擬腸液組中黃酮釋放量為（64.20±2.45）mg Rutin/100 g，空白對(duì)照組中黃酮釋放量為（44.20±2.38）mg Rutin/100 g，相比增加1.45倍，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可表明胃蛋白酶、胃酸和胰蛋白酶均可促進(jìn)苦蕎米飯中黃酮的釋放。

通過對(duì)比圖1和圖2可知，苦蕎米飯中黃酮釋放量在胃消化過程中總體增加，模擬腸消化過程中總體有降低的趨勢(shì)，但與空白組相比仍有明顯增加，與李貽等[11]人的研究結(jié)果基本一致。這可能與2個(gè)原因有關(guān)。①苦蕎黃酮主要成分為蘆丁、槲皮素、山奈酚等，各主要成分之間的基團(tuán)作用力會(huì)在模擬胃液消化環(huán)境較低pH中有所減弱，有利于黃酮類物質(zhì)的釋放。②在模擬消化溫度37 ℃時(shí)，苦蕎米飯中易水解的黃酮類物質(zhì)可能因發(fā)生水解而被釋放。

圖1 苦蕎米飯?bào)w外模擬胃消化過程中黃酮釋放量的變化圖

圖2 苦蕎米飯?bào)w外模擬腸消化過程中黃酮釋放量的變化圖

2.3 模擬胃腸消化對(duì)ABTS自由基清除率的影響

圖3、圖4表示了苦蕎米飯?jiān)隗w外模擬胃腸消化過程中ABTS自由基清除率大小的變化，通過ABTS自由基的清除率大小可反映出苦蕎米飯抗氧化活性的大小。

圖3 苦蕎米飯?bào)w外模擬胃消化中ABTS自由基的清除率變化圖

圖4 苦蕎米飯?bào)w外模擬腸消化中ABTS自由基清除率的變化圖

在模擬胃消化階段，空白對(duì)照組對(duì)ABTS自由基的清除率變化不明顯。與空白對(duì)照組相比，模擬胃液消化組和胃酸對(duì)照組1.5 h內(nèi)ABTS自由基的清除率有明顯增加的趨勢(shì)（p＜0.05）。1.5 h時(shí)空白對(duì)照組ABTS自由基的清除率為（41.60±0.06）%，1.5 h時(shí)模擬胃液消化組ABTS自由基的清除率可達(dá)（70.17±0.08）%，比空白對(duì)照組增加了1.67倍。1.5 h時(shí)胃酸對(duì)照組ABTS自由基的清除率達(dá)（56.41±0.06）%，增加1.36倍。在模擬腸消化過程中，ABTS自由基的清除率總體呈下降趨勢(shì)（p＜0.05），1.5 h后趨于穩(wěn)定。1.5 h空白對(duì)照組ABTS自由基的清除率為（31.68±0.05）%，1.5 h腸消化組ABTS自由基的清除率為（35.32±0.06）%，比腸空白組增加1.11倍，由此說明胰蛋白酶有利于苦蕎米飯抗氧化活性的增加。

3 結(jié)論

本研究表明，苦蕎米飯中黃酮主要在模擬胃消化中釋放，黃酮釋放量在胃消化階段總體增加、在腸消化過程中總體降低。與空白對(duì)照組相比，苦蕎米飯模擬胃液消化組1.5 h內(nèi)黃酮釋放量、ABTS自由基清除率具有明顯的上升趨勢(shì)（p＜0.05），最大值分別為（111.8±3.5）mg Rutin/100 g、（70.17±0.08）%，增加了1.91倍、1.67倍，之后趨于穩(wěn)定；胃酸組1.5 h內(nèi)黃酮釋放量、ABTS自由基清除率明顯上升（p＜0.05），最大值分別為（73.6±2.86）mg Rutin/100 g及（56.41±0.06）%，增加了1.26倍、1.36倍，之后趨于穩(wěn)定。苦蕎米飯模擬腸消化組1.5 h內(nèi)黃酮釋放量及其ABTS自由基的清除率明顯高于空白對(duì)照組（p＜0.05），最大值分別為（64.20±2.45）mg Rutin/100 g、（35.32±0.06）%，比空白對(duì)照組增加1.45倍、1.11倍，之后變化基本穩(wěn)定。本研究結(jié)果表明，胃蛋白酶、胃酸和胰酶能促進(jìn)云南苦蕎米飯中抗氧化成分的釋放及其抗氧化活性的增加，為苦蕎新功能性食品的研發(fā)提供了理論依據(jù)。