紀 元，胡利偉，蔡憲杰，許成悅，范子彥，師默聞，唐綱嶺，鄧惠敏*，閆 鼎*

1.國家煙草質量監(jiān)督檢驗中心，鄭州高新技術產業(yè)開發(fā)區(qū)翠竹街6號 450001

2.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號 450001

3.上海煙草集團有限責任公司，上海市長陽路717號 200082

長柄鏈格孢菌（Alternaria longipes）是鏈格孢屬（Alternaria）真菌，也是引起煙草赤星病的主要病原菌［1］。多個國家曾報道過煙草赤星病的爆發(fā)，在我國各煙區(qū)也均有赤星病的發(fā)生，造成了較大的經濟損失［2-4］。目前赤星病主要通過捕捉田間赤星病原孢子來預警，該方法需要相應的設備，準確性較低，檢測用時較長，赤星病一旦發(fā)生則很難控制。因此，建立一種經濟、準確和快速的煙草赤星病檢測方法，在疾病發(fā)生早期檢測煙草幼苗或葉片中的鏈格孢菌，對赤星病的綠色防控尤為重要。

檢測鏈格孢菌的傳統(tǒng)方法包括形態(tài)學法［5-6］、化學分析法［7-8］、分子檢測法［9-10］和免疫檢測法［11-12］等。其中形態(tài)學法采用微生物培養(yǎng)手段，要求微生物必須是可培養(yǎng)的，耗時長且對操作者的專業(yè)性要求高?；瘜W分析法是對微生物特定成分進行檢測，無需對微生物進行培養(yǎng)，雖靈敏度高，但由于該方法的檢測儀器不便攜帶，不適用于現(xiàn)場快速檢測。而膠體金免疫層析技術結合抗原抗體特異性識別和微流層析技術，具有操作簡單、檢測速度快、不受檢測設備和試劑限制等優(yōu)點，已廣泛應用于食品和醫(yī)療等行業(yè)［13-15］。Huang等［16］研制的膠體金免疫層析試紙條成功應用于水稻條紋病毒的快速檢測，該檢測準確性高，特異性好。此外，多個公司制備了檢測血清中抗新型冠狀病毒IgG/IgM抗體的膠體金試紙條，與ELISA結果比較具有一致的特異性和準確性，不僅適用于家庭檢測，也適用于醫(yī)院的即時檢驗（Point-of-care testing）［17］。然而，目前還未見針對鏈格孢菌的膠體金快速檢測試紙條的文獻報道和商品化的快速檢驗試劑盒。

為此，通過將小鼠抗長柄鏈格孢菌單克隆抗體進行膠體金標記，研制能夠靈敏且特異性地檢測長柄鏈格孢菌的膠體金試紙條，旨在實現(xiàn)煙葉生產中赤星病的快速檢測和識別，為赤星病的有效防控提供準確、及時的技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

主要試劑耗材：牛血清白蛋白（BSA）、檸檬酸三鈉、氯金酸、吐溫80、生物素（美國Sigma-Aldrich公司）。Amicon?親和濃度試劑盒蛋白A（美國Merck Millipore公司）。硝酸纖維素膜（德國Sartouris公司）。吸水濾紙、玻璃纖維紙、聚酯纖維紙和PVC板（上海捷寧生物科技有限公司）。

菌株：長柄鏈格孢菌分離自昆明祿勸，由云南省煙草農業(yè)科學院提供。菌落被接種在含10%（體積分數(shù)）新鮮煙葉提取物的馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養(yǎng)基上，26°C培養(yǎng)7 d。大腸桿菌（Escherichia coli）、根黑腐串珠霉菌（Thielaviopsis basicola）、煙草黑脛病菌（Phytophthora nicotianae）和疣孢青霉菌（Penicillium verruculosum）來自鄭州煙草研究院生態(tài)環(huán)境與煙葉質量重點實驗室。黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus）、煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus）和馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y）陽性對照購自美國Agdia公司。

主要儀器：Megafuge 8R離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司），劃膜噴金標機HGS510和切條機HGS201（杭州峰航科技有限公司），雙穩(wěn)定時電泳儀PAC3000（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 長柄鏈格孢菌抗原的制備

將長柄鏈格孢菌菌絲超聲處理15 min，離心后將沉淀進行液氮研磨，再次超聲處理后，13 700×g離心10 min，將上清液超濾濃縮，得鏈格孢菌蛋白1。

將長柄鏈格孢菌菌絲進行液氮研磨，取1 g粉末溶于NS2T裂解液，置于冰上超聲10 min。1L NS2T裂解液的配方為0.1 mol Tris-HCl、0.1 mol NaCl、0.5 mol蔗糖、0.01 mol EDTA、2.4 mmol脫氧膽酸鈉、3 g Triton X-100、4.9 mmol 3-［3-（膽酰胺丙基）二甲基銨］-1-丙磺酸內鹽（CHAPS）、0.01 mol 3-（環(huán)己氨基）2-羥基-1-丙磺酸（CAPSO）、1 mmol蛋白酶抑制劑雞尾酒、2 mmol苯甲基磺酰氟（PMSF）、10 mmol二硫蘇糖醇（DTT）。裂解物13 700×g轉速離心10 min，取上清得鏈格孢菌蛋白2。將蛋白裂解液與上樣緩沖液混合后進行SDS-PAGE檢測，考馬斯亮藍染膠。

將2 g長柄鏈格孢菌菌絲液氮研磨，加入4 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）后超聲處理15 min，13 700×g轉速下離心10 min獲得鏈格孢菌蛋白3。

1.2.2 單克隆抗體的制備和純化

50μg長柄鏈格孢菌菌絲裂解液與弗氏完全佐劑充分乳化后分別皮下注射2只6~8周齡的BALB/c雌鼠（北京維通利華實驗動物技術有限公司），之后菌絲裂解液與弗氏不完全佐劑混合并免疫小鼠3次，每次間隔為2周。最后一次免疫完成1周后，取小鼠血清采用間接競爭ELISA法進行效價檢測［18］。細胞融合3 d前，將50μg菌絲裂解液與PBS混合，對小鼠進行免疫沖擊。將小鼠胰臟細胞與SP2/0骨髓瘤細胞以10∶1混合，接種在96孔板中［19］。以長柄鏈格孢菌裂解蛋白為抗原，采用間接競爭ELISA和蛋白質電泳法篩選雜交瘤細胞株［20］，選取高滴度的細胞株進行2次亞克隆。采用體內誘生法制備腹水，向BALB/c小鼠腹腔注入滅菌液狀石蠟（0.5 mL/只），7 d后將約5×105個雜交瘤細胞注射到小鼠腹腔中。根據(jù)制造商提供的使用說明，利用蛋白A親和層析柱進行抗體純化。純化后的抗體通過間接競爭ELISA和蛋白質電泳法對其特異性進行驗證。

1.2.3 膠體金檢測試紙條的制備

1.2.3.1 膠體金標記單克隆抗體

采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金。將100 mL 0.3 mmol/L氯金酸溶液加熱至沸騰，邊攪拌邊加入檸檬酸三鈉溶液0.04 mol/L）至溶液呈透亮的酒紅色，用碳酸鉀溶液將pH調整為7.2。按每毫升膠體金溶液加入6~16μg單克隆抗體，加BSA至終濃度為1%（質量分數(shù)）。以13 700×g轉速4°C離心40 min，將沉淀用復溶緩沖液［含0.2%BSA、0.1%（體積分數(shù)）吐溫80的0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.2］重懸，4°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 結合物釋放墊制備

將玻璃纖維釋放墊浸潤于Tris緩沖液（pH 7.4）中，37°C干燥。使用噴膜儀將標有膠體金的長柄鏈格孢菌單克隆抗體和IgY噴涂在結合物釋放墊上，37°C干燥后取出備用。

1.2.3.3 反應膜制備

將長柄鏈格孢菌單克隆抗體捕獲抗體包被到反應膜上形成檢測線（T），將山羊抗雞抗體包被在反應膜上構成質控線（C）。

1.2.3.4 試紙條組裝

在PVC底板上依次粘貼樣品吸收墊、噴涂有標記長柄鏈格孢菌抗體的膠體金和IgY的結合墊、噴涂有長柄鏈格孢菌抗體和山羊抗雞二抗的反應膜、吸水墊，切成3.5 mm的寬度的試紙條后裝入卡殼，試紙條結構如圖1所示。

圖1 長柄鏈格孢菌檢測試紙條結構示意圖Fig.1 Schematic illustration of test strips for the detection of A.longipes

1.2.4 測試方法與檢測結果的判斷標準

稱取約0.3 g樣品至1.5 mL離心管中，加入1 mL PBST（含10 mmol/L PBS，1%吐溫20，0.6 mol/L NaCl），搖晃后靜置5 min。取上清液0.1 mL至點樣孔中，等待10 min后觀察結果。

判斷標準：如圖2所示，C線顯色，T線不顯色，表示樣品中長柄鏈格孢菌數(shù)量低于檢測限，即為陰性。C線和T線均顯色，表示樣品中長柄鏈格孢菌數(shù)量等于或高于檢測限，即為陽性。C線不顯色，表示操作不正確或試紙條已失效。

圖2 快速檢測試紙條判斷標準Fig.2 Criteria for rapid detection by test strips

2 結果與分析

2.1 單克隆抗體制備和評價

如圖3所示，長柄鏈格孢菌菌絲裂解液經SDS-PAGE分離，主要條帶出現(xiàn)在120、70、38 kDa附近。裂解液與弗氏完全佐劑乳化后免疫小鼠制備單克隆抗體。

圖3 長柄鏈格孢菌蛋白裂解液SDS-PAGE結果Fig.3 SDS-PAGE analysis of A.longipes protein lysates

使用長柄鏈格孢菌菌絲裂解液免疫BALB/c小鼠，對小鼠血清中的抗體滴度進行檢測。如圖4a所示，與對照相比，小鼠1和2的血清在450 nm處吸光度明顯高于空白小鼠，說明長柄鏈格孢菌菌絲裂解液作為免疫原誘導抗體效價較高。因此，選取長柄鏈格孢菌菌絲裂解液免疫的小鼠進行單克隆抗體制備，并用蛋白質電泳對腹水純化的抗體進行檢測。如圖4b所示，僅在25 kDa和50 kDa有2個條帶，分別對應IgG的輕鏈和重鏈，說明抗體已經被制備并純化。利用ELISA對抗體效價進行評價，包被原為鏈格孢菌蛋白1、2、3，除了蛋白3，抗體對蛋白1和2響應良好（圖4c）。

圖4 單克隆抗體的評價Fig.4 Evaluation of the monoclonal antibody

2.2 條件優(yōu)化

為確定結合墊噴金量，按每厘米結合墊噴涂1.5、2.0、2.5μL金標抗體的噴金量分別將鏈格孢菌蛋白2稀釋1×103倍和1×105倍，檢測結果見圖5。噴金量為1.5或2.0μL/cm時試紙條可識別鏈格孢菌，且噴金量為2.0μL/cm時信號更強；當噴金量為2.5 μL/cm時C線有非特異性吸附。因此，選擇噴金量為2.0μL/cm。

圖5 結合墊噴金量優(yōu)化Fig.5 Optimisation of the amount of colloidal gold-labelled antibody on the conjugate pad

2.3 靈敏度和特異性評價以及加標樣品中的應用

將蛋白濃度為0.2 mg/mL的長柄鏈格孢菌裂解液進行梯度稀釋（圖6a）。空白對照呈陰性，當病菌裂解液稀釋10倍至1×104倍時，均可檢出；當稀釋至1×105倍時，試紙條無檢出，即檢出限為20 ng/mL。但樣品稀釋10倍時，T線信號較弱，說明可能由于上樣濃度過高造成了鉤狀效應，在實際檢測中可能導致假陰性結果。

如圖6b所示，將培養(yǎng)平板上其他微生物菌落混懸在1 mL長柄鏈格孢菌裂解液中，或將病毒的陽性對照用裂解液稀釋10倍，用膠體金試紙條進行檢測，除長柄鏈格孢菌外，其他試紙條均呈陰性，說明膠體金試紙條與其余7種微生物無交叉反應，具有較高的特異性。

在沒有赤星病感染的云煙85煙葉上分別添加無菌PBS和長柄鏈格孢菌，取0.5 g撕碎的煙葉分別置于2個離心管中，加入1 mL云煙85煙葉的提取液后混合均勻，取100μL混合后的液體進行檢測。如圖6c所示，10 min后空白對照T線無信號，然而加標煙葉有檢出，說明試紙條受實際樣品中基質的干擾較小。

圖6 快速檢測試紙條的靈敏度（a）和特異性（b）評價以及在加標樣品中的檢測（c）Fig.6 Sensitivity(a)and specificity(b)of test strips and the detection of a spiked sample by test strips(c)

2.4 穩(wěn)定性評價

將膠體金試紙條密封裝在有干燥劑的鋁箔袋中，在37℃下儲存6個月進行加速老化測試。根據(jù)阿倫尼烏斯方程，加速老化測試可評估長期儲存對其性能的影響，試紙條在37℃下保存91 d可視為25℃條件下保存1年［21］。檢測陰性對照和稀釋100倍的長柄鏈格孢菌裂解液，每個時間點3次重復。如表1所示，37℃條件下加速老化0至6個月期間，結果無假陽性或假陰性，說明試紙條具有良好的穩(wěn)定性。

表1 37℃儲存條件下快速檢測試紙條檢測結果Tab.1 Detection results of tests strips stored at 37℃

2.5 討論

赤星病的病原較多，分類較復雜，有研究鑒定出河南煙區(qū)的煙草赤星病病原菌主要是鏈格孢（A.alternata）、長柄鏈格孢（A.longipes）、鴨梨鏈格孢（A.yalinnficiens）［22］；湖北煙區(qū)煙草赤星病病原菌主要為鏈格孢、長柄鏈格孢、細極鏈格孢（A.tenuissima）和鴨梨鏈格孢［23］；重慶煙區(qū)煙草赤星病病原菌主要為細極鏈格孢［24］；貴州煙區(qū)發(fā)生的煙草赤星病病原菌主要為鏈格孢菌和長柄鏈格孢菌［25］。而本試驗中所選擇的病菌樣本僅來自云南省部分煙區(qū)，試驗材料尚不豐富，對其18S rRNA測序顯示分離的菌株為長柄鏈格孢菌［26］，因此試紙條適用于檢測煙葉中病原菌為長柄鏈格孢菌引起的赤星病，下一步將通過研制復合鏈格孢菌的檢測試紙條，擴大試紙條的檢測范圍和準確度。此外，膠體金快速檢測試紙條目前只對煙葉中的長柄鏈格孢菌進行了試驗，根據(jù)理論，本檢測方法同樣適用于土壤、煙草幼苗、煙草植株其他部分中長柄鏈格孢菌的定性檢測，但仍需進一步試驗驗證。

3 結論

利用裂解的長柄鏈格孢菌菌絲作為免疫原，誘導小鼠制備識別長柄鏈格孢菌的單克隆抗體，并對單克隆抗體進行膠體金微粒標記，構建了一種適用于現(xiàn)場快速檢測煙草中長柄鏈格孢菌的免疫層析試紙條。該快速檢測試紙條的檢出限為20 ng/mL，且特異性較高，不與煙草上常見的幾種真菌、病毒等病原體發(fā)生交叉反應。該試紙條具有操作快捷、無需特殊設備和專業(yè)技能等優(yōu)勢。