魏興 ，解天 ，鐘鑫勤 ，趙鑫 ，王小瑩

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 301617）

心肌梗死是冠狀動(dòng)脈急性、持續(xù)性缺血、缺氧所引起的心肌壞死，多發(fā)生于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化狹窄基礎(chǔ)上[1]。根據(jù)《中國(guó)心血管病報(bào)告2019》數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)約有3.3億人患有心血管疾病，其中冠心病患者約有1 100萬[2]。對(duì)于冠心病的治療，中醫(yī)藥典籍中早有記載，《金匱要略》中記載瓜蔞薤白半夏湯可治冠心病，《太平圣惠方》中記載治療胸痹多用芳香、溫通、辛散之品與益氣、養(yǎng)血、滋陰藥物相互為用，《醫(yī)林改錯(cuò)》首創(chuàng)血府逐瘀湯等活血化瘀名方為治療胸痹之經(jīng)典方，沿用至今[3-4]。神香蘇合丸源于《太平惠民和劑局方》卷三中的蘇合香丸[5]，有溫通開竅、行氣止痛之效，主治寒邪、穢濁或氣郁閉阻機(jī)竅之證。該藥由麝香、冰片、蘇合香、安息香、乳香、丁香、廣木香、沉香、白術(shù)、香附、水牛角共11味藥物組成，用于寒凝心脈、氣機(jī)不暢所致的胸痹，癥見心痛、胸悶、脹滿、遇寒加重，冠心病心絞痛見上述癥狀者，具有良好的療效。前期研究基于超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-Q-TOF-MS/MS）對(duì)神香蘇合丸中的化學(xué)成分進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)到麝香酮等38種有效成分，通過Lipinski五原則進(jìn)一步篩選得到18個(gè)可吸收成分[6]?，F(xiàn)代藥理學(xué)初步研究表明，神香蘇合丸能夠緩解實(shí)驗(yàn)性大鼠心肌梗死[7]，且對(duì)斑馬魚的心功能、缺氧運(yùn)動(dòng)耐受能力具有改善作用[8]。

前期實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠進(jìn)行冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎造成大鼠心肌缺血，誘導(dǎo)大鼠心肌梗死[9-10]。神香蘇合丸給藥劑量為0.126 g/kg，連續(xù)給藥2周能顯著改善大鼠心肌梗死狀態(tài)。運(yùn)用小動(dòng)物超聲心動(dòng)檢測(cè)等方法進(jìn)行了神香蘇合丸治療心肌梗死的藥效學(xué)驗(yàn)證，顯示大鼠心肌梗死后心臟左心室前壁運(yùn)動(dòng)幅度減弱，心肌收縮力下降，射血分?jǐn)?shù)降低，左心室短軸縮短率降低。心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，間質(zhì)出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，給予神香蘇合丸后，上述藥效指標(biāo)均有顯著改善。隨著基因組測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，腸道微生物在心血管疾病發(fā)病機(jī)制中的組成和潛在作用得到了深入研究[11-13]。其中有關(guān)“腸滲漏”的概念認(rèn)為心肌梗死后會(huì)導(dǎo)致腸缺血、水腫，進(jìn)而導(dǎo)致腸道穩(wěn)態(tài)遭到破壞，體循環(huán)中的腸源細(xì)菌和有害代謝產(chǎn)物（如內(nèi)毒素）發(fā)生移位，加重機(jī)體炎癥狀態(tài)[14]。因此，有效恢復(fù)腸道穩(wěn)態(tài)、重塑菌群結(jié)構(gòu)是藥物治療疾病的重要途徑之一。截至目前，神香蘇合丸對(duì)心肌梗死疾病的治療作用是否與腸道菌群相關(guān)尚不明確，因此本研究通過高通量測(cè)序技術(shù)探討神香蘇合丸對(duì)心肌梗死大鼠腸道菌群的改善作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器 小動(dòng)物超聲實(shí)時(shí)影像系統(tǒng)、MISEQ測(cè)序儀、HISEQ 測(cè)序儀 （Illumina）；Covaris M220（Gene Company Limited）；聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（Applied Biosystems）；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)、超微量分光光度計(jì)（Eppendorf）；電泳儀（北京市六一儀器廠）；酶標(biāo)儀（Biotek）；微型熒光計(jì)（TurnerBioSystems）；生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；酶標(biāo)儀（Tecan）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化廠）；移液器（Eppendorf）；電子天平（天津億諾科學(xué)儀器有限公司）；快速混勻器（江蘇新康醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 菌種和試劑 約氏乳桿菌EU03（Lactobacillus johnsoniiEU03，登記號(hào) CPCC101288）、鼠乳桿菌 EU04（Lactobacillus murinus EU04，登記號(hào)CPCC101290）由天津中醫(yī)藥大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室自主分離鑒定并保藏于中國(guó)藥學(xué)微生物菌種保藏管理中心（CPCC）。DNA抽提試劑盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，美國(guó)）；DNA聚合酶（FastPfu，TransGen）；DNA 凝膠回收試劑盒（Axygen，美國(guó)）；MRS肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂粉、甘油（北京索萊寶生物科技有限公司）；脫脂乳培養(yǎng)基（山東拓普生物工程有限公司）；神香蘇合丸（杭州胡慶余堂有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)Sprague-Dawley雄性大鼠，體質(zhì)量為（220±10）g，該批動(dòng)物由天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房，飼養(yǎng)條件為室溫20～25℃，相對(duì)濕度40%～60%，飼養(yǎng)用滅菌顆粒飼料由動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，飼養(yǎng)用清潔飲用水由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供且每日更換飲水，所有大鼠自由飲水，實(shí)驗(yàn)室光照環(huán)境為明暗環(huán)境各12 h交替。運(yùn)用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支的方法制備大鼠心肌梗死模型[15]。將造模成功的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為假手術(shù)組、模型組、神香蘇合丸組，每組8只。各組大鼠灌胃給予神香蘇合丸，劑量為0.126 g/kg，連續(xù)給藥14 d，給藥后運(yùn)用小動(dòng)物超聲實(shí)時(shí)影像系統(tǒng)檢測(cè)各組大鼠的左心室功能。

給藥14 d后在無菌環(huán)境下操作取糞便樣本，包括假手術(shù)組、模型組和神香蘇合丸組。用酒精消毒的鑷子和無菌離心管撿取新鮮的大鼠糞便2～3粒放于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

2.1 DNA抽提和PCR擴(kuò)增 根據(jù)DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop 2000進(jìn)行檢測(cè)，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的提取質(zhì)量；用338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和 806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）引物對(duì)V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min，27個(gè)循環(huán)（95℃變性30 s，55℃退 30 s，72℃延伸30 s），最后 72℃延伸10min。擴(kuò)增體系為20μL，包括4μL5×FastPfu緩沖液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL 引物（5μmol/L），0.4 μL FastPfu聚合酶及10 ng DNA模板，用無菌水補(bǔ)足剩余體積。

2.2 Illumina Miseq測(cè)序 PCR產(chǎn)物利用Axy Prep DNA Gel Extraction Kit進(jìn)行純化，三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）洗脫，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。利用Quanti FluorTM-ST進(jìn)行檢測(cè)定量。根據(jù)Illumina MiSeq平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2×300的文庫（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

2.3 生物信息學(xué)分析 本研究根據(jù)所擴(kuò)增的16S區(qū)域特點(diǎn)，基于Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)，構(gòu)建小片段文庫進(jìn)行雙末端測(cè)序。通過對(duì)Reads拼接過濾，使用 UPARSE 軟件（version 7.1，http：//drive5.com/uparse/），根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行操作分類單元（OTU）聚類，并在聚類過程中去除單序列和嵌合體。利用 RDP classifier（http：//rdp.cme.msu.edu/）對(duì)每條序列進(jìn)行物種注釋及豐度分析，比對(duì)Silva數(shù)據(jù)庫（SSU123），設(shè)置比對(duì)閾值為70%，揭示樣品物種構(gòu)成；進(jìn)一步的α多樣性分析、β多樣性分析用于挖掘樣品之間的差異。

2.4 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定 將凍存的Lactobacillus johnsonii EU03、Lactobacillus murinus EU04 轉(zhuǎn)移至滅菌的脫脂乳培養(yǎng)基中，42℃培養(yǎng)4h，反復(fù)活化3代，使菌種活力恢復(fù)，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。將活化的菌液分別轉(zhuǎn)種至MRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)16 h，以此作為種子液。運(yùn)用平板計(jì)數(shù)法對(duì)不同稀釋倍數(shù)的 100 μL Lactobacillus johnsonii EU03、Lactobacillus murinus EU04進(jìn)行涂布，對(duì)菌落數(shù)30～300個(gè)的平板計(jì)數(shù)，以CFU/mL為單位得到菌落計(jì)數(shù)結(jié)果。其中CFU/mL指的是每毫升種子液中含有的細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)，菌落計(jì)數(shù)=（C/V）×M，其中C代表某一稀釋液環(huán)境平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液體積，M代表稀釋倍數(shù)。

用滅菌水配制0.1 mg/mL神香蘇合丸藥液，超聲溶解過濾膜。Lactobacillus johnsonii EU03、Lactobacillus murinus EU04活化后，分別每次10倍稀釋至107倍稀釋液，在96孔板中分別加入實(shí)驗(yàn)組100 μL不同稀釋倍數(shù)菌液以及100 μL藥液，加藥對(duì)照組100 μL藥液加入100 μL MRS肉湯培養(yǎng)基，菌液對(duì)照組100 μL不同稀釋倍數(shù)菌液加入100 μL滅菌水，空白對(duì)照組100 μL MRS肉湯培養(yǎng)基加入100 μL滅菌水，放入酶標(biāo)儀中，設(shè)置時(shí)間為每循環(huán)2 h，共13個(gè)循環(huán)，吸光度檢測(cè)波長(zhǎng)600 nm，溫度37℃，確定促進(jìn)菌體最佳稀釋倍數(shù)。按以下公式計(jì)算細(xì)菌生長(zhǎng)率并繪制生長(zhǎng)曲線（生長(zhǎng)率的計(jì)算原則為實(shí)驗(yàn)組凈生長(zhǎng)量/對(duì)照組凈生長(zhǎng)量）：生長(zhǎng)率（%）=（[A加藥實(shí)驗(yàn)組-A加藥對(duì)照組）（/A菌液對(duì)照組-A空白對(duì)照組）]×100%。

2.5 神香蘇合丸對(duì)益生菌生長(zhǎng)的影響 配制1mg/mL神香蘇合丸，分別稀釋不同濃度至0.75、0.5、0.25、0.1 mg/mL，在96孔板中分別加入實(shí)驗(yàn)組100 μL最佳稀釋倍數(shù)為104的Lactobacillus johnsonii EU03、Lactobacillus murinus EU04菌液以及100 μL藥液，加藥對(duì)照組100 μL藥液加入100 μL MRS肉湯培養(yǎng)基，菌液對(duì)照組100 μL不同稀釋倍數(shù)菌液加入100μL滅菌水，空白對(duì)照組100μLMRS肉湯培養(yǎng)基加入100 μL滅菌水，放入酶標(biāo)儀中，設(shè)置時(shí)間為每循環(huán)2 h，共25個(gè)循環(huán)，吸光度檢測(cè)波長(zhǎng)600 nm，溫度37℃，確定促進(jìn)益生菌生長(zhǎng)的最佳藥物濃度。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，當(dāng)方差齊時(shí)選用LSD檢驗(yàn)方法，方差不齊選擇Dunnett’s T3檢驗(yàn)方法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 神香蘇合丸對(duì)心肌梗死大鼠腸道菌群多樣性的影響 射血分?jǐn)?shù)（EF）和短軸縮短率（FS）是評(píng)價(jià)左心室功能的關(guān)鍵指標(biāo)，給藥14 d后運(yùn)用小動(dòng)物超聲實(shí)時(shí)影像系統(tǒng)對(duì)各組大鼠進(jìn)行左心室功能檢測(cè)，結(jié)果見圖1。圖1A為給藥14 d后各組大鼠左心室EF變化情況，模型組大鼠左心室EF顯著降低（P＜0.05），給藥后顯著升高（P＜0.05）；圖 1B 為給藥 14 d后各組左心室FS的變化情況，模型組大鼠左心室FS顯著降低（P＜0.05），給藥后顯著升高（P＜0.05）。表明神香蘇合丸對(duì)心肌梗死大鼠左心室功能具有明顯的改善作用。

給藥后取各組大鼠糞便樣本進(jìn)行檢測(cè)，各組樣品復(fù)雜度分析結(jié)果提示分組合理，測(cè)序數(shù)據(jù)合理，各樣本分布均勻且多樣性豐富。圖1C為Rank-Abundance曲線圖，Rank-Abundance曲線可用來解釋多樣性的兩個(gè)方面，即物種豐富度和群落均勻度。在水平方向，曲線寬度反映物種豐富度，曲線在橫軸上的范圍越大，物種的豐富度就越高；曲線的形狀（平緩程度）反映了樣本中群落的均勻度，曲線越平緩，物種分布越均勻。Rank-Abundance曲線結(jié)果顯示假手術(shù)組物種豐富度最低，模型組和神香蘇合丸組均增加，神香蘇合丸組豐富度最高；神香蘇合丸組群落均勻度分布最均勻。圖1D為稀釋曲線，是從樣本中隨機(jī)抽取一定數(shù)量的序列，統(tǒng)計(jì)這些序列對(duì)應(yīng)樣本的Alpha多樣性指數(shù)，以抽取的數(shù)據(jù)量為橫坐標(biāo)，以Alpha多樣性指數(shù)值為縱坐標(biāo)繪制曲線，根據(jù)曲線是否達(dá)到平緩來判斷本次測(cè)序數(shù)據(jù)的數(shù)量是否足夠。圖中各組數(shù)據(jù)均達(dá)到平緩，表明測(cè)序數(shù)據(jù)合理。Alpha多樣性主要指一個(gè)特定區(qū)域或者生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性，Shannon指數(shù)可以確定物種多樣性。圖1E為Alpha多樣性組間差異檢驗(yàn)，結(jié)果顯示假手術(shù)組與模型組多樣性低，在給藥神香蘇合丸后腸道菌群多樣性顯著增加。Beta多樣性分析通過對(duì)不同生境或微生物群落間的物種多樣性進(jìn)行組間比較分析，探索不同分組樣本間群落組成的相似性或差異性。圖1F通過基于Bray-Curtis算法的主坐標(biāo)分析（PCoA），分析各組間差異所展現(xiàn)的腸道菌群Beta多樣性，圖中假手術(shù)組與模型組有一定程度離散，給予神香蘇合丸后群落與模型組比較有一定離散程度，且群落相似度趨近于假手術(shù)組。

圖1 藥效評(píng)價(jià)及樣本多樣性分析

3.2 神香蘇合丸對(duì)心肌梗死大鼠腸道中微生物物種豐度的調(diào)節(jié)作用 厚壁菌門和擬桿菌門是主要的門，占存在細(xì)菌90%以上。圖2為腸道菌群門水平的豐度分析，與假手術(shù)組比較，模型組厚壁菌門豐度增加，擬桿菌門豐度減少，厚壁菌門/擬桿菌門比值增大；神香蘇合丸組與模型組比較，厚壁菌門豐度減少，擬桿菌門豐度增加，厚壁菌門/擬桿菌門比值減小。與假手術(shù)組比較，模型組Patescibacteria豐度顯著上升（P＜0.05），給予神香蘇合丸后有下降趨勢(shì)但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

圖2 門水平上的物種豐度分析（±s）

進(jìn)一步對(duì)腸道菌群屬水平的菌群進(jìn)行豐度分析，結(jié)果見圖3。與假手術(shù)組比較，模型組鏈球菌、羅姆布茨菌、毛螺菌科、單球菌屬豐度顯著升高（P＜0.05），給予神香蘇合丸后顯著降低（P＜0.05）；與假手術(shù)組比較，模型組理研菌科、普雷沃氏菌科豐度顯著升高（P＜0.05），給予神香蘇合丸后有降低趨勢(shì)但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；給藥后羅斯氏菌和乳球菌屬豐度與模型組比較明顯升高（P＜0.05），假手術(shù)組與模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；神香蘇合丸還能增加心肌梗死大鼠腸道中乳桿菌屬豐度，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

圖3 屬水平上的物種豐度分析（±s）

乳桿菌作為益生菌的重要成員之一，對(duì)心血管具有良好的保護(hù)作用，能夠通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、炎癥等過程緩解心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展。其屬水平上，約氏乳桿菌和鼠乳桿菌占乳桿菌屬中大部分細(xì)菌豐度，且神香蘇合丸能在一定程度上促進(jìn)約氏乳桿菌和鼠乳桿菌生長(zhǎng)，見圖4。

圖4 神香蘇合丸對(duì)兩種乳桿菌種益生菌豐度的影響（±s）

采用基于OTU的韋恩圖對(duì)給藥14 d后假手術(shù)組、模型組與神香蘇合丸組樣品進(jìn)行聚類分析，以查找組間特有菌，見圖5。結(jié)果顯示假手術(shù)組有71種特有菌，模型組有93種特有菌，神香蘇合丸組有72種特有菌。神香蘇合丸組的特有菌主要有毛螺菌科和克里斯滕森菌科，屬水平上有罕見小球菌屬、羅斯氏菌屬、糞球菌屬和阿洛巴氏菌屬。結(jié)果提示神香蘇合丸能夠改變心肌梗死大鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)。

圖5 基于OTU的組間分布豐度分析

3.3 體外檢測(cè)神香蘇合丸對(duì)益生菌生長(zhǎng)的影響 圖6為平板計(jì)數(shù)法對(duì)稀釋倍數(shù)為104的Lactobacillus johnsonii EU03、Lactobacillus murinus EU04各100μL的涂布結(jié)果，計(jì)算得出Lactobacillus johnsonii EU03菌液濃度為 3×109CFU/mL，Lactobacillus murinus EU04菌液濃度為4×108CFU/mL。

圖6 104稀釋倍數(shù)下益生菌生長(zhǎng)情況（涂布量 100 μL，培養(yǎng) 24 h）

統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)率結(jié)果顯示菌株在104稀釋倍數(shù)下，實(shí)驗(yàn)組吸光度較大、生長(zhǎng)率高，說明在此菌株生長(zhǎng)濃度下藥物能較好地促進(jìn)其生長(zhǎng)，見圖7。

圖7 菌株最適宜生長(zhǎng)條件篩選

統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示神香蘇合丸可提高Lactobacillus johnsonii EU03生長(zhǎng)率，濃度為0.1mg/mL時(shí)促進(jìn)作用最大；神香蘇合丸還可提高Lactobacillus murinus EU04生長(zhǎng)率，濃度為0.5 mg/mL時(shí)促進(jìn)作用最大，見圖8。

圖8 神香蘇合丸作用于不同益生菌的生長(zhǎng)曲線

4 討論

腸道菌群及其代謝產(chǎn)物參與了心肌梗死早期的心肌修復(fù)。作為腸道菌群的代謝產(chǎn)物之一，短鏈脂肪酸可以誘導(dǎo)髓樣細(xì)胞募集進(jìn)入心臟參與修復(fù)，對(duì)心肌梗死有益。心肌梗死通過飲食補(bǔ)充短鏈脂肪酸或靜脈輸注單核細(xì)胞系RAW264.7可顯著降低抗生素所致的病死率，緩解心臟損傷[16]。腸道菌群結(jié)構(gòu)被破壞可能會(huì)引起心肌梗死預(yù)后不良。除此之外，腸道菌群還可以通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、血壓、細(xì)胞凋亡等多種方式干預(yù)心肌梗死病程。腸道菌群能夠調(diào)節(jié)與炎癥、心肌梗死發(fā)病機(jī)制相關(guān)的宿主信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而減小心肌梗死面積，改善心肌梗死[17]。

腸道微生物群及其代謝產(chǎn)物作為心血管疾病的整體介質(zhì)，已成為預(yù)防和治療心血管疾病的新治療靶標(biāo)，腸道微生態(tài)平衡在維持健康的心血管功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用[18-19]。本研究通過16S擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)檢測(cè)神香蘇合丸給藥后對(duì)心肌梗死大鼠腸道菌群組成的影響，結(jié)果表明神香蘇合丸可以恢復(fù)心肌梗死大鼠腸道微生物組的豐富度和均勻度，增加物種多樣性。研究表明動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓病、肥胖和2型糖尿病等心血管相關(guān)疾病中，來源于厚壁菌門的腸道微生物豐度顯著增加[20]。給予神香蘇合丸后腸道菌群結(jié)構(gòu)得到改善，主要表現(xiàn)在減小厚壁菌門/擬桿菌門比值，降低毛螺菌科、理研菌科、普雷沃氏菌科、鏈球菌屬、羅姆布茨菌屬等與心血管危險(xiǎn)因素相關(guān)的菌群豐度[21-24]。其中，鏈球菌屬還可引起主動(dòng)脈炎癥，加速動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展[25]。除此之外，給予心肌梗死大鼠神香蘇合丸后，羅斯氏菌、乳球菌屬、乳桿菌屬等72種優(yōu)勢(shì)腸道微生物豐度增加。羅氏菌屬作為腸道中能產(chǎn)生丁酸鹽的特有菌屬，可通過產(chǎn)生短鏈脂肪酸發(fā)揮抗炎作用，與小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化病變發(fā)展呈負(fù)相關(guān)[26-27]。用乳球菌屬菌株發(fā)酵的食品可以抗氧化，抗血栓形成，降低血壓和膽固醇活性[28-30]。乳桿菌作為腸道益生菌中數(shù)量較多的一類，在心血管相關(guān)疾病預(yù)防和治療中得到廣泛研究，其主要機(jī)制是影響脂質(zhì)膽固醇代謝、免疫炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)以及所涉及的腸道代謝物（包括氧化三甲胺、短鏈脂肪酸、脂多糖和膽汁酸）[31-34]。

現(xiàn)有研究表明除了多樣化和均衡的飲食外，使用益生元和益生菌也可預(yù)防心血管疾病[35]。因此本研究重點(diǎn)關(guān)注乳桿菌等益生菌，推測(cè)神香蘇合丸可能通過增加腸道益生菌的豐度而改善大鼠體內(nèi)代謝物質(zhì)的水平，起到改善心肌梗死的作用。臨床研究顯示，人體在攝入益生菌（或益生元）后，益生菌會(huì)在人體的腸道定植，參與到人體的消化、吸收、代謝過程中，從而發(fā)揮分解脂肪等功效。肥胖及代謝性疾病患者采用益生菌治療可降低體質(zhì)量[36]。通過合理的給藥方式也可以間接增加腸道菌群中的益生菌，進(jìn)而改善抗氧化能力與脂質(zhì)分布，起到保護(hù)冠心病的作用[37]。體外驗(yàn)證表明可顯著促進(jìn)活性的菌株是從腸道中分離的Lactobacillus murinus EU04，提示直接補(bǔ)充鼠乳桿菌可恢復(fù)乳桿菌在腸道菌群內(nèi)的比例，重塑菌群結(jié)構(gòu)，進(jìn)而調(diào)節(jié)血壓[38]。

5 結(jié)論

本研究通過分析神香蘇合丸體內(nèi)給藥對(duì)心肌梗死大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響及體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證神香蘇合丸對(duì)益生菌生長(zhǎng)的作用，證明了神香蘇合丸對(duì)心肌梗死大鼠腸道菌群具有改善作用，尤其是促進(jìn)腸道益生菌的生長(zhǎng)，推測(cè)腸道益生菌可能是神香蘇合丸改善心肌梗死的潛在靶標(biāo)。在后續(xù)研究中會(huì)進(jìn)行糞菌移植實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確腸道菌群對(duì)神香蘇合丸治療心肌梗死的靶點(diǎn)作用，闡明藥物直接依賴的腸道菌群調(diào)節(jié)機(jī)制，為后續(xù)益生菌的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。