趙 鵬，常 靖，吳小軍，董林沛，劉冰潔，張云峰*

（1.公安部物證鑒定中心，北京 100038；2.愛博才思亞太應(yīng)用支持中心，北京 100015）

β2-受體激動劑可選擇性作用于呼吸道平滑肌的β2受體，使支氣管擴(kuò)張和增加肺通氣量，在臨床醫(yī)學(xué)上用于治療支氣管哮喘和慢性阻塞性肺疾病等。由于β2-受體激動劑在動物體內(nèi)能促進(jìn)脂肪分解，增加機(jī)體的蛋白質(zhì)合成，增強(qiáng)骨骼肌收縮力，常被運(yùn)動員濫用于減肥健美，或被禽畜生產(chǎn)企業(yè)非法添加在動物飼料中［1-3］。長期攝入此類藥物會危害人體健康，小劑量也會引起急性中毒，引發(fā)頭痛、胸悶、心悸、呼吸急促、惡心、嘔吐和肌肉震顫等中毒癥狀［4-5］，并可誘發(fā)和加重心腦血管系統(tǒng)患者的病情，甚至導(dǎo)致死亡。目前已有大量β2-受體激動劑中毒或死亡的相關(guān)案例被報道［4-8］，而β2-受體激動劑的檢測集中在畜產(chǎn)品的可食性組織和藥物的非法添加方面［9-12］，在法庭毒物分析領(lǐng)域的報道相對較少［13］。因此，為滿足毒物分析檢驗的應(yīng)用需求，亟需建立中毒血液中β2-受體激動劑的檢測方法。

干血斑（Dried blood spots，DBS）是一種簡單易行的血液采集和儲藏方法，最初被用于大批新生兒苯丙酮尿癥的診斷和治療［14］。DBS以棉纖維構(gòu)成的采血卡為吸附載體，通過纖維素孔隙吸附基質(zhì)和目標(biāo)物，具有采樣量小、易于儲存和運(yùn)輸?shù)奶攸c，在常溫條件下具有較高的穩(wěn)定性［15-16］，可保存數(shù)天甚至數(shù)月。近年來，DBS技術(shù)被逐步應(yīng)用于藥物代謝和毒物分析，已有大量濫用藥物和精神活性成分的DBS檢測方法被報道［17-20］。本研究以DBS為樣本保存載體，建立了全血中29種β2-受體激動劑的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。該方法具有樣品量小、保存方便和基質(zhì)干擾小的特點，可用于法庭毒物分析領(lǐng)域。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

LC-30A 型超高效液相色譜儀（日本Shimadzu 公司）；QTRAP 5500 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國AB Sciex公司）配有電噴霧離子源（ESI）；CM-1000振蕩器（日本Eyela公司）；Biofuge Primo R 高速離心機(jī)（美國Thermo公司）。

甲醇（MeOH）、乙腈（ACN）、甲酸（HCOOH）、甲酸銨（色譜級，美國Fisher Scientific 公司）；29 種β2-受體激動劑標(biāo)準(zhǔn)品（見表1，天津阿爾塔公司，質(zhì)量濃度均為100 μg/mL），用甲醇稀釋并配制成質(zhì)量濃度為1 μg/mL的混合儲備溶液，于-20 ℃下儲存；Whatman 903采血卡（英國Whatman公司）。

1.2 樣品前處理

干血斑提?。何?00 μL 全血滴在Whatman 903 采血卡上（半徑約1 cm），室溫下干燥2 h 后，待測。取整個血斑，絞碎后置于離心管中，加入1 mL甲醇，旋渦振蕩10 min，8 000 r/min離心5 min，上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜后待測。

全血提?。何?00 μL全血于離心管中，加入0.9 mL乙腈，其余操作同上。

1.3 色譜條件

Phenomenex Kinetex F5（3.0 mm×100 mm，2.6 μm）色譜柱；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL/min；流動相：A 為1 mmol/L 甲酸銨-0.01%甲酸水溶液，B 為乙腈；進(jìn)樣體積為2 μL。梯度程序：0～1 min，5% B；1～1.1 min，5%～20% B；1.1～6 min，20%～95% B；6～8 min，95% B；8～8.1 min，95%～5%B；8.1～11 min，5%B。

1.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；離子源溫度：550 ℃；噴霧電壓：5 500 V；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；29種β2-受體激動劑的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 29種β2-受體激動劑的保留時間、質(zhì)譜參數(shù)、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 1 Retention times（RT），MS parameters，linear ranges，correlation coefficients（r2）and detection limits（LOD）for 29 β2-agonists

1.5 血斑穩(wěn)定性實驗

將100 ng·mL-1的全血和干血斑加標(biāo)樣品置于-20 ℃冰箱中儲藏。分別于第1、21、35、56 d測定全血加標(biāo)樣品和干血斑加標(biāo)樣品中的藥物含量，比較藥物在干血斑和全血中含量的比值隨時間的變化情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

考察了0.01%甲酸水溶液-甲醇和0.01%甲酸水溶液-乙腈2 種流動相體系對各化合物的分離效果。結(jié)果表明，以0.01%甲酸水溶液-乙腈為流動相時各化合物的峰形較好，且各色譜峰能彼此分離。向流動相中加入一定濃度的甲酸銨，比較色譜峰的豐度，結(jié)果表明，當(dāng)加入1 mmol/L 甲酸銨時，大多數(shù)化合物的響應(yīng)有一定增加，因此選擇流動相為1 mmol/L 甲酸銨-0.01%甲酸水溶液和乙腈體系。29種β2-受體激動劑的選擇離子流圖如圖1所示。

圖1 29種β2-受體激動劑的選擇離子流圖Fig.1 The selected ion chromatograms of 29 β2-agonists

2.2 提取條件的優(yōu)化

比較了甲醇、乙腈、1%甲酸甲醇和甲醇-乙腈（1∶1）4 種提取溶劑對干血斑中目標(biāo)物的提取效果（見圖2）。結(jié)果表明，當(dāng)提取溶劑為甲醇時干血斑中目標(biāo)物的整體提取率較大，回收率為62.7%～118%；采用1%甲酸甲醇提取時，除沙丁胺醇、3-甲氧酪胺、非諾特羅和丙卡特羅之外，其余目標(biāo)物的回收率均有所下降；使用乙腈提取時，回收率下降明顯；采用甲醇-乙腈（1∶1）提取時，除丙卡特羅外，其余目標(biāo)物的回收率均小于甲醇提取時的回收率。因此使用甲醇對采血卡上的干血斑進(jìn)行提取。當(dāng)血滴加在采血卡表面時，血中的大分子蛋白和小分子目標(biāo)物被充分吸附在采血卡基質(zhì)中。有機(jī)溶劑的加入使干燥的血斑表面更加失水，導(dǎo)致蛋白聚合，甲醇沉淀蛋白時多為絮狀，而乙腈對蛋白的沉淀效果更明顯，可使血斑表面被大面積聚合蛋白覆蓋而無法析出，因此甲醇更適合對干血斑提取。

圖2 不同溶劑對目標(biāo)物的提取效果Fig.2 Extraction effects of different extraction solvents for analytes

考察了干血斑和甲醇的體積比分別為1∶5、1∶10和1∶15時對目標(biāo)物提取效率的影響，結(jié)果表明，當(dāng)兩者的體積比為1∶5時，一部分甲醇潤濕在采血卡纖維素基質(zhì)中，導(dǎo)致上清液較少且基質(zhì)效應(yīng)大；當(dāng)體積比為1∶10和1∶15時，目標(biāo)物的回收率無明顯差異，最終選擇血斑和甲醇的體積比為1∶10。

2.3 線性范圍與檢出限

制備一系列質(zhì)量濃度為1～200 ng·mL-1的干血斑樣本，按照“1.2”方法處理后進(jìn)行UPLC-MS/MS 分析，以干血斑中目標(biāo)分析物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，29種化合物在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）為0.995 8～0.999 9，滿足方法學(xué)要求。以3 倍信噪比（S/N= 3）所對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為方法檢出限（LOD），29 種化合物的LOD為1～10 ng·mL-1（見表1）。

2.4 回收率與基質(zhì)效應(yīng)

通過在空白血中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液制備干血斑樣本，考察29 種β2-受體激動劑的回收率、基質(zhì)效應(yīng)和重復(fù)性，3-甲氧酪胺和多巴胺的加標(biāo)水平為40、100 ng·mL-1，其余27 種化合物則為10、40、100 ng·mL-1，每個加標(biāo)水平平行5 次，按照“1.2”方法進(jìn)行處理。按以下方法計算回收率和基質(zhì)效應(yīng)：回收率=B/A×100%，基質(zhì)效應(yīng)=A/C×100%，其中A為空白干血斑基質(zhì)處理后添加相同含量β2-受體激動劑的響應(yīng)值，B為添加相同含量β2-受體激動劑的干血斑處理后的響應(yīng)值，C為與空白基質(zhì)加標(biāo)樣本同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值。如表2 所示，除非諾特羅外，干血斑中其余28 種化合物的回收率為60.9%～124%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于20%，可滿足檢測要求。非諾特羅的回收率雖僅為26.9%～65.5%，但可用于藥物的篩查定性。本文以采血卡為干血斑的存儲介質(zhì)，采血卡的纖維結(jié)構(gòu)一定程度上吸附了血液中磷脂、多糖等干擾物質(zhì)，降低了血液基質(zhì)的干擾，但也不可避免地引入采血卡中某些化學(xué)試劑，對目標(biāo)物的響應(yīng)起到增強(qiáng)或抑制的效果。例如，基質(zhì)對齊帕特羅、丙卡特羅和福莫特羅起到增強(qiáng)作用，對利托君、克倫塞羅、萊克多巴胺和拉貝洛爾起到較強(qiáng)的抑制作用，但均可滿足藥物的篩查定性要求。

以40 ng·mL-1加標(biāo)水平的干血斑為考察對象，按照“1.2”方法進(jìn)行處理，連續(xù)進(jìn)樣5 d，每天重復(fù)5次，計算每日平均值的RSD作為日間精密度。如表2所示，日間RSD為3.2%～19%，可滿足檢測要求。

表2 29種β2-受體激動劑的回收率、基質(zhì)效應(yīng)和精密度Table 2 Recoveries，matrix effects and precision results of 29 β2-agonists

2.5 干血斑的穩(wěn)定性

為考察29 種β2-受體激動劑在所制備干血斑中的穩(wěn)定性，將全血和干血斑的加標(biāo)樣品置于-20 ℃冰箱中儲藏，比較29 種化合物在兩種基質(zhì)中含量的比值（C血斑/C全血）隨時間的變化情況。若比值增大，表明血斑中的化合物較全血穩(wěn)定；反之，全血中化合物穩(wěn)定。結(jié)果顯示，C血斑/C全血在8 周內(nèi)變化不顯著，因此在-20 ℃的冰箱儲存環(huán)境下，29種目標(biāo)物在干血斑和全血中具有相同的穩(wěn)定性，均能穩(wěn)定保存8 周。干血斑在保存過程中，酶和蛋白由于處于失水狀態(tài)而失活，化合物的轉(zhuǎn)化、降解等化學(xué)反應(yīng)受到抑制，化合物更加穩(wěn)定。同時細(xì)菌作用也受到抑制，更利于樣本的長期保存。

2.6 實際樣品的檢測

采用本文建立的方法對10 份血液進(jìn)行前處理和分析，均未檢出上述29 種β2-受體激動劑。選取其中3 份血液，加入29 種β2-受體激動劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，使加標(biāo)濃度為50、150 ng·mL-1，按照本方法進(jìn)行分析，得29種β2-受體激動劑的加標(biāo)回收率為65.3%～106%，表明所建方法可用于實際樣品檢驗。

3 結(jié) 論

本研究以Whatman 903 采血卡為全血樣品的采集和儲存基質(zhì)，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對干血斑中的29種β2-受體激動劑進(jìn)行定性定量分析。結(jié)果表明，在最優(yōu)條件下，除非諾特羅外，其余目標(biāo)物的回收率為60.9%～124%，RSD 均小于20%，干血斑在-20 ℃下保存8 周后與全血樣本具有相同的穩(wěn)定性。該方法準(zhǔn)確、樣品用量小，保存和運(yùn)輸便利，可應(yīng)用于法庭毒物分析領(lǐng)域。