李金敏，高緒娜，桑瑞新，宮本芝，徐海燕，谷 巍，郝木強(qiáng)，蘭江華，王 紅

(1.山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司，山東省動(dòng)物微生態(tài)制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰安 271000；2.濟(jì)寧市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，濟(jì)寧 272031)

禽致病性大腸桿菌(avian pathogenicEscherichiacoli，APEC)是一種腸外致病性大腸桿菌，可引起禽類大腸桿菌病，并常與其他呼吸道疾病混合感染，引發(fā)禽類腹膜炎、肝周炎、心包炎等病變，嚴(yán)重的可引發(fā)敗血癥，導(dǎo)致禽類死亡[1-2]。此外，禽大腸桿菌病不僅會(huì)降低禽類生產(chǎn)性能，提高死亡率，與其他疾病混合感染還會(huì)加重病情，降低疫苗免疫效力[3]。

目前國(guó)內(nèi)外防治禽大腸桿菌病的主要手段仍為抗生素，但抗生素的長(zhǎng)期使用所引發(fā)的藥物殘留等食品安全問題及產(chǎn)生耐藥菌等問題已引起了廣泛關(guān)注[4-5]。因此，亟需開發(fā)安全、高效的禽大腸桿菌病防治手段。鑒于該病的自然感染途徑主要通過呼吸系統(tǒng)及消化系統(tǒng)兩方面單獨(dú)或協(xié)同誘發(fā)，從調(diào)控養(yǎng)殖環(huán)境中致病性大腸桿菌的數(shù)量入手，對(duì)于防控該病的發(fā)病率具有重要的生物安全意義。

噬菌體作為一種專一侵襲目標(biāo)細(xì)菌的病毒，具有繁殖迅速、特異性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，能快速裂解目標(biāo)菌株，從而達(dá)到殺菌的目的。自被發(fā)現(xiàn)至今一百多年的時(shí)間里，研究者一直嘗試著將其作為新型抗菌劑應(yīng)用于病原菌的防控，且有些已在國(guó)外獲批上市[6]。大量研究表明，噬菌體對(duì)人及動(dòng)物是安全的[7-9]，噬菌體作為一種可替代抗生素的生物制劑及環(huán)境改良劑，具有廣闊的應(yīng)用前景。

本研究以O(shè)2血清型禽大腸桿菌為研究對(duì)象，從養(yǎng)殖環(huán)境中分離相應(yīng)的噬菌體，并對(duì)噬菌體的生物學(xué)特性及環(huán)境殺菌效果進(jìn)行綜合評(píng)估，以期為噬菌體制劑的推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 宿主菌O2血清型禽大腸桿菌CVCC1552購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心。

1.1.2 主要試劑及儀器 胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)培養(yǎng)基均購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；Tris-HCl緩沖溶液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；PEG8000購(gòu)自長(zhǎng)春天佳生物技術(shù)有限公司；氯仿購(gòu)自重慶川東化工有限公司；DNase Ⅰ、RNase A、微量病毒提取試劑盒、限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；0.22 μm微孔濾膜購(gòu)自PALL公司。 超凈工作臺(tái)、電熱恒溫培養(yǎng)箱、恒溫振蕩培養(yǎng)箱等均購(gòu)自山東博科科學(xué)儀器有限公司；Philips Tecnai 10透射式電鏡購(gòu)自Philips公司。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體的分離純化 于山東省泰安市某鴨場(chǎng)糞池采集糞便樣品。將采集到的樣品加入15 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液，4 ℃靜置過夜。將樣品于12 000 r/min離心10～15 min去除大部分固體雜質(zhì)，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌。取10 mL過濾液加入10 mL已滅菌TSB培養(yǎng)基中，再按照1%接種量加入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的宿主菌種子液，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，次日將培養(yǎng)液8 000 r/min離心15 min,取1 mL上清液加入10 mL TSB培養(yǎng)基，并按照1%接種量接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的宿主菌種子液，室溫靜置1 h后于37 ℃振蕩培養(yǎng)4 h，培養(yǎng)結(jié)束后8 000 r/min離心15 min，過濾，即得噬菌體原液。

用50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液對(duì)噬菌體原液進(jìn)行梯度稀釋，取合適梯度噬菌體稀釋液0.3 mL與0.3 mL宿主菌種子液混合，加入5 mL 約55 ℃ TSB半固體培養(yǎng)基，混勻后倒入TSA平板上，平板凝固后倒置于37 ℃培養(yǎng)箱4～6 h，觀察噬菌斑生長(zhǎng)情況。挑取直徑大且透亮的噬菌斑于Tris-HCl緩沖溶液，適當(dāng)稀釋后按照前述分離方法進(jìn)行純化，重復(fù)3～5次，直至噬菌斑形狀大小均勻。挑取單個(gè)噬菌斑至10 mL TSB培養(yǎng)基，并按照1%接種量接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的宿主菌液，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)過夜；離心過濾后即得純化的噬菌體裂解液，同時(shí)參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行噬菌體滴度測(cè)定[10]。

1.2.2 噬菌體電鏡觀察 參照文獻(xiàn)提供方法，采用PEG8000制備噬菌體顆粒濃縮液，取10 μL濃縮液滴于銅網(wǎng)上，自然沉淀10 min，用濾紙吸去側(cè)面多余液體，加1滴磷鎢酸至銅網(wǎng)上，染色10 min，銅網(wǎng)干燥后用透射電鏡進(jìn)行觀察[11]。

1.2.3 基因組提取及核酸類型確定 利用PEG8000制備噬菌體顆粒濃縮液，在濃縮液中加入DNaseⅠ、RNase A，37 ℃孵育30 min，采用微量病毒提取試劑盒提取噬菌體核酸。用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ 對(duì)提取到的噬菌體核酸進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物用0.7%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，根據(jù)酶切圖譜鑒定噬菌體核酸類型。

1.2.4 噬菌體生物學(xué)特性分析

1.2.4.1 噬菌譜測(cè)定 測(cè)定該噬菌體對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的除宿主菌之外的其余10株大腸桿菌的宿主譜，10株大腸桿菌于37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，噬菌體過濾液及大腸桿菌菌液各取100 μL，加入5 mL TSB半固體培養(yǎng)基，混勻后倒入TSA平板上，凝固后倒置于37 ℃培養(yǎng)箱4～6 h，觀察有無(wú)噬菌斑生長(zhǎng)。

1.2.4.2 最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)測(cè)定 將宿主菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。宿主菌按照培養(yǎng)基體積的1%加至滅菌的TSB液體培養(yǎng)基中，噬菌體裂解液按照感染復(fù)數(shù)為0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001加入，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)3.5 h，5 000 r/min離心15 min，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，梯度稀釋法測(cè)定裂解液滴度，以產(chǎn)生最高滴度的感染復(fù)數(shù)組作為該噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)。

1.2.4.3 一步生長(zhǎng)曲線 將噬菌體及對(duì)數(shù)生成長(zhǎng)期的宿主菌按照最佳感染復(fù)數(shù)加至100 mL TSB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)箱靜置孵育15 min 后180 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔20 min 取樣，測(cè)定噬菌體滴度。以時(shí)間為橫坐標(biāo)、噬菌體滴度為縱坐標(biāo)繪制一步生長(zhǎng)曲線圖。 通過下列公式計(jì)算噬菌體裂解量。

裂解量=裂解末期噬菌體滴度/裂解初期宿主菌數(shù)

1.2.4.4 熱穩(wěn)定性測(cè)定 取1 mL 噬菌體純培養(yǎng)液(109PFU/mL)置于無(wú)菌EP管內(nèi)，分別于40、50、60、70、80 ℃水浴中孵育1 h 后，測(cè)定噬菌體滴度。以溫度為橫坐標(biāo)、噬菌體滴度為縱坐標(biāo)繪制溫度耐受性曲線圖。

1.2.4.5 酸堿穩(wěn)定性測(cè)定 取噬菌體純培養(yǎng)液(109PFU/mL)按照1∶9的比例分別加至pH為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0的Tris-HCl緩沖溶液中，37 ℃水浴中孵育1 h 后，測(cè)定噬菌體滴度。以pH為橫坐標(biāo)、噬菌體滴度為縱坐標(biāo)，繪制酸堿耐受性曲線圖。

1.2.5 環(huán)境殺菌效果評(píng)估

1.2.5.1 液體殺菌效果評(píng)估 制備宿主菌菌懸液，離心、緩沖液重懸后獲得去培養(yǎng)基菌懸液，將菌懸液活菌數(shù)調(diào)整到2.0×105CFU/mL，然后按體積比1∶1加入相應(yīng)噬菌體(混勻后效價(jià)分別為在1.0×104、1.0×105、1.0×106PFU/mL左右)，對(duì)照組加入等量TSB培養(yǎng)基，25 ℃放置，分別在1和6 h取樣，測(cè)定宿主菌活菌數(shù)。

1.2.5.2 載體(雞糞)殺菌效果評(píng)估 制備宿主菌菌懸液，稀釋菌液濃度到4.0×106CFU/mL，分別以體積比1∶1加入濃度為4.0×105、4.0×106、4.0×107PFU/mL的噬菌體，混勻后取1 mL混合液滴加于已高壓滅菌并烘干的10 g雞糞中，攪拌均勻(使得雞糞含宿主菌為2.0×105CFU/g；雞糞含噬菌體分別為2.0×104、2.0×105和2.0×106PFU/g)，以加等量TSB培養(yǎng)基為空白對(duì)照組，用玻璃紙密封，于25 ℃培養(yǎng)箱放置，分別在5和10 h 取樣，測(cè)定宿主菌活菌數(shù)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2010進(jìn)行初步處理后，采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，并進(jìn)行LSD多重比較。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 噬菌體的分離純化

通過雙層平板法分離純化出1株禽大腸桿菌(O2血清型)噬菌體，命名為ФECP2-1。該噬菌體在雙層平板上形成直徑1 mm 左右圓形透明噬菌斑，有較大暈圈(圖1)。

圖1 噬菌體ФECP2-1噬菌斑

2.2 噬菌體電鏡觀察結(jié)果

在透射電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，該噬菌體具有正多面體的頭部和細(xì)而長(zhǎng)的尾部結(jié)構(gòu)，頭部直徑約98 nm，尾部長(zhǎng)約123 nm(圖2)，初步判定為肌尾科噬菌體。

圖2 噬菌體ФECP2-1電鏡圖片(400 000×)

2.3 基因組提取及核酸類型確定

由圖3可知，噬菌體ФECP2-1可被限制性內(nèi)切酶切開，表明噬菌體ФECP2-1為雙鏈DNA噬菌體。根據(jù)酶切結(jié)果預(yù)測(cè)其基因組大小約為29 kb。

1，噬菌體DNA；M1，15 kb DNA Marker；2，EcoRⅠ酶切；3，Hind Ⅲ 酶切；M2，10 kb DNA Marker

2.4 噬菌體生物學(xué)特性測(cè)定結(jié)果

2.4.1 噬菌譜測(cè)定結(jié)果 對(duì)除宿主菌之外其余10株大腸桿菌進(jìn)行宿主譜測(cè)定，發(fā)現(xiàn)噬菌體ФECP2-1還能裂解C8-0008、C8-0020、C8-0033、C8-0040、C8-0045、C8-0047、C8-0106、CVCC1568 8株宿主菌(含與宿主菌不同血清型菌株)(表1)，表明該噬菌體還可裂解自身血清型之外的其他大腸桿菌，具有較寬的裂解譜。

表1 噬菌體ФECP2-1宿主譜

2.4.2 最佳感染復(fù)數(shù)測(cè)定結(jié)果 噬菌體ФECP2-1在感染復(fù)數(shù)為0.00001時(shí)所產(chǎn)生的的子代噬菌體滴度最高，為1.66×1010PFU/mL(圖4)，表明噬菌體ФECP2-1最佳感染復(fù)數(shù)為0.00001。

圖4 噬菌體ФECP2-1最佳感染復(fù)數(shù)

2.4.3 一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果 通過一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定發(fā)現(xiàn)，噬菌體ФECP2-1感染宿主菌的潛伏期為20～40 min，裂解時(shí)間為80～100 min，120 min后進(jìn)入平臺(tái)期，噬菌體最高滴度為6.20×1010PFU/mL(圖5)，通過裂解量公式得出該噬菌體裂解量為4 133 PFU/cell。

圖5 噬菌體ФECP2-1一步生長(zhǎng)曲線

2.4.4 熱穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果 由熱穩(wěn)定性曲線圖可知，噬菌體ФECP2-1在40～50 ℃滴度變化不明顯，60 ℃處理1 h，噬菌體滴度降低接近50%，60 ℃以上噬菌體滴度驟降，至80 ℃時(shí)基本降至0(圖6)。

圖6 噬菌體ФECP2-1熱穩(wěn)定性

2.4.5 酸堿穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果 噬菌體ФECP2-1在 pH 3.0～11.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定。強(qiáng)酸、強(qiáng)堿都會(huì)造成噬菌體活性降低。在經(jīng)pH為1.0及12.0緩沖液處理后，噬菌體ФECP2-1完全失活(圖7)。

圖7 噬菌體ФECP2-1酸堿穩(wěn)定性

2.5 噬菌體ФECP2-1環(huán)境殺菌效果評(píng)估

2.5.1 液體殺菌效果評(píng)估 由表2可知，在液體條件下，濃度為1.0×104～1.0×106PFU/mL的噬菌體ФECP2-1 對(duì)濃度1.0×105CFU/mL的宿主菌殺菌率均在99.9%以上，且殺菌率隨著噬菌體濃度的增加而顯著增加(P<0.05),隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)殺菌率略有增加。說明該噬菌體在液體中具有較好的殺菌效果，可用于養(yǎng)殖環(huán)境中液體的消毒。

表2 噬菌體ФECP2-1對(duì)液體殺菌效果

2.5.2 載體(雞糞)殺菌效果評(píng)估結(jié)果 由表3可知，濃度為2.0×104～2.0×106PFU/g 的噬菌體ФECP2-1 對(duì)雞糞中濃度為2.0×105CFU/g的宿主菌均具有殺菌效果，殺菌率均在99.0%以上。殺菌率隨著噬菌體濃度的增加顯著增加(P<0.05)，隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)殺菌率略有增加。說明該噬菌體針對(duì)雞糞中的宿主菌也具有一定的殺菌效果。

表3 噬菌體ФECP2-1雞糞殺菌效果

3 討 論

目前養(yǎng)殖業(yè)中關(guān)于禽大腸桿菌病的防控手段仍主要采用抗生素療法，但大腸桿菌極易對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性，進(jìn)而增強(qiáng)該菌的致病力，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)更大的經(jīng)濟(jì)損失[12]。針對(duì)細(xì)菌耐藥性問題，相關(guān)部門也出臺(tái)了一系列限抗禁抗政策，在這種情況下，尋求新的防控手段成為一種必然。噬菌體以其獨(dú)特的生物學(xué)特性及在防控細(xì)菌性疾病方面的巨大優(yōu)勢(shì)及潛力而備受關(guān)注[13]。

本研究以禽大腸桿菌CVCC1552為宿主菌，從山東泰安某養(yǎng)鴨場(chǎng)糞污樣品中分離得到1株具有較寬裂解譜的禽大腸桿菌噬菌體，將其命名為ФECP2-1。該噬菌體在雙層平板上形成的噬菌斑清晰、透亮，且在噬菌斑周圍形成較大的環(huán)形暈圈。暈圈的形成被認(rèn)為是由噬菌體產(chǎn)生的一種具有多糖降解能力的解聚酶降解噬菌斑周邊宿主菌多糖骨架而成。此外，暈圈的形成也被認(rèn)為是噬菌體具有莢膜水解酶活性的指示器。以上結(jié)果說明該噬菌體不僅可裂解宿主菌，還可降解細(xì)菌生物膜，具有較強(qiáng)的殺菌能力[14]。

通過透射電鏡觀察噬菌體ФECP2-1具有正多面體的頭部和細(xì)而長(zhǎng)的尾部結(jié)構(gòu)，同時(shí)結(jié)合酶切鑒定結(jié)果，確定該噬菌體為雙鏈DNA、肌尾科噬菌體，這與現(xiàn)有文獻(xiàn)[15-16]中報(bào)道的大腸桿菌噬菌體結(jié)構(gòu)特征基本一致。

根據(jù)噬菌體裂解譜的寬窄可將噬菌體分為寬譜噬菌體和專一性噬菌體。自然界中大部分噬菌體專一性較強(qiáng)，只能特異性裂解某一細(xì)菌的某一血清型，但為了應(yīng)對(duì)當(dāng)前養(yǎng)殖行業(yè)中出現(xiàn)的病原菌混合感染，篩選寬譜噬菌體具有重要應(yīng)用價(jià)值[17]。噬菌體ФECP2-1可裂解多種來(lái)源且不同血清型的大腸桿菌，裂解譜寬于吳圓圓等[18]報(bào)道的雞大腸桿菌噬菌體的裂解譜，說明該噬菌體可與多種細(xì)菌表面受體相結(jié)合進(jìn)而裂解細(xì)菌，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

噬菌體ФECP2-1最佳感染復(fù)數(shù)為0.00001，表明噬菌體對(duì)宿主菌CVCC1552極度易感。 潛伏期為20～40 min，對(duì)宿主菌的裂解量為4 133 PFU/cell，遠(yuǎn)高于魏炳棟等[19]報(bào)道的大腸桿菌噬菌體裂解量370 PFU/cell。說明該噬菌體具有較強(qiáng)的裂解能力，適于投入生產(chǎn)使用，提高噬菌體的生產(chǎn)效率。

溫度和pH的變化對(duì)噬菌體滴度也具有不同程度的影響。 噬菌體ФECP2-1的溫度及pH穩(wěn)定性結(jié)果顯示，在60 ℃及以下溫度條件下噬菌體滴度相對(duì)穩(wěn)定，高于此溫度則滴度驟降。 這一結(jié)果與楊慧敏等[20]報(bào)道的雞大腸桿菌噬菌體在60 ℃作用20 min噬菌體全部失活不同。 說明本研究分離到的禽大腸桿菌噬菌體溫度耐受性更強(qiáng)，這一性能更有利于噬菌體制劑的商品化。噬菌體ФECP2-1在pH 3.0～11.0范圍內(nèi)滴度較穩(wěn)定，這一結(jié)果也優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道的同類噬菌體的酸堿耐受范圍[21-22]。說明該噬菌體在不同的酸堿環(huán)境中均具有裂解細(xì)菌的能力，這一特性對(duì)于噬菌體作為環(huán)境消毒劑進(jìn)行開發(fā)具有重要意義。

O2血清型大腸桿菌是禽類常見的致病力較強(qiáng)且發(fā)病率較高的大腸桿菌血清型之一，可引起禽類的胸膜炎及敗血癥[23]。在實(shí)際生產(chǎn)中由于雜菌干擾、噬菌體施用及取樣不均勻等因素的存在，以致于無(wú)法對(duì)某一特異性噬菌體的真實(shí)殺菌效果進(jìn)行評(píng)估。本研究排除以上干擾因素的影響，較理想化的使用噬菌體ФECP2-1針對(duì)處理過的養(yǎng)殖水體及雞糞中宿主菌進(jìn)行防控，以最大程度的呈現(xiàn)噬菌體的真實(shí)殺菌效果。結(jié)果顯示噬菌體干預(yù)組液體及糞便大腸桿菌活菌數(shù)較初始均有明顯降低，殺菌率均在99%以上。其中噬菌體ФECP2-1針對(duì)液體中大腸桿菌殺菌效果優(yōu)于對(duì)雞糞中大腸桿菌殺菌效果，這可能與2種基質(zhì)中噬菌體與宿主菌的接觸概率有一定關(guān)系，此外雞糞中有機(jī)質(zhì)對(duì)于噬菌體的殺菌效果也可能存在一定干擾。噬菌體ФECP2-1對(duì)雞糞中大腸桿菌殺菌效果仍略優(yōu)于文獻(xiàn)中報(bào)道的殺菌效果[24]。 綜上可知，噬菌體ФECP2-1對(duì)于實(shí)驗(yàn)室模擬的養(yǎng)殖環(huán)境感染的大腸桿菌具有良好的防控效果。

4 結(jié) 論

本研究從養(yǎng)殖環(huán)境中分離篩選到1株禽大腸桿菌O2血清型強(qiáng)裂解性噬菌體ФECP2-1，屬于肌尾科噬菌體，具有較寬的裂解譜及良好的熱穩(wěn)定性、pH耐受性。該噬菌體感染復(fù)數(shù)低、裂解量高，在模擬養(yǎng)殖環(huán)境中表現(xiàn)出較好的殺菌效果，是一株具有較好應(yīng)用前景的噬菌體。本研究為噬菌體類生物消毒劑的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)，為禽大腸桿菌病的防控提供了新的思路。