陳 強(qiáng)，程悅寧，馮秋菊，郭 利，張淑琴，譚 斌，易 立，趙 權(quán)，程世鵬，孫 娜

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部經(jīng)濟(jì)動(dòng)物疫病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130112；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)春 130118；3.四川省涼山彝族自治州農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心，西昌 615000)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)是腸桿菌科克雷伯氏菌屬中最為重要的一類菌，呈卵圓形桿狀，單獨(dú)、成雙或短鏈狀排列，有較厚的莢膜，多數(shù)有菌毛，無(wú)芽孢，無(wú)鞭毛，廣泛分布于自然界。近年來(lái)，肺炎克雷伯菌已成為僅次于大腸桿菌的人畜共患條件致病菌[1]。肺炎克雷伯菌主要引起腸炎、尿路感染、膀胱炎、肺炎、腦膜炎、肝膿腫、內(nèi)源性眼內(nèi)炎及敗血癥等嚴(yán)重感染性疾病[2]。肺炎克雷伯菌主要引起水貂肺炎，表現(xiàn)為呼吸困難、發(fā)病急、死亡快，多發(fā)生于秋季溫暖潮濕的季節(jié)，目前該病已成為危害水貂養(yǎng)殖業(yè)的主要傳染病之一，給養(yǎng)貂業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。對(duì)于該病的治療臨床上主要使用抗生素類藥物。近年來(lái)，由于抗生素的選擇壓力及不恰當(dāng)?shù)氖褂?，致使肺炎克雷伯菌耐藥性日趨?yán)重，呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，主要表現(xiàn)為多重耐藥現(xiàn)象[4-5]。因此，了解肺炎克雷伯菌的耐藥情況及解決其耐藥問題具有十分重要的意義。

本研究主要收集2019年吉林省某水貂養(yǎng)殖場(chǎng)送檢的6只患有肺炎的病死水貂的病料，通過細(xì)菌分離純化和PCR方法對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定，采用多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing technique，MLST)方法測(cè)定分離菌株的基因型，通過感染小鼠確定菌株的致病性，分析菌株毒力基因的攜帶情況，檢測(cè)菌株對(duì)臨床常用抗菌藥物的敏感性及耐藥基因的攜帶情況，為臨床合理用藥提供科學(xué)依據(jù)和建議。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌ATCC 25922由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部經(jīng)濟(jì)動(dòng)物疫病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；試驗(yàn)菌株均分離自2019年吉林省某水貂養(yǎng)殖場(chǎng)送檢的患有肺炎的病死水貂的病料樣品。

1.1.2 主要試劑 LB肉湯、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基均購(gòu)自O(shè)XOID公司；PremixTaqVersion 2.0、DL2000 DNA Marker均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離純化及鑒定 收集病死水貂的肺臟，劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。挑取麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落接種于3 mL LB肉湯中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，待用。分離菌株經(jīng)生化方法進(jìn)行初步鑒定。

khe基因僅存在于肺炎克雷伯菌中，可作為鑒定肺炎克雷伯菌的特異性靶標(biāo)。按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取菌株的基因組DNA，參考Neuberger等[6]合成khe基因引物(F：5′-TG-ATTGCATTCGCCACTGG-3′；R：5′-GGTCAAC-CCAACGATCCTG-3′)進(jìn)行PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系25 μL：2×PCR Premix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/mL)各0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，滅菌ddH2O補(bǔ)足體系。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，選取PCR陽(yáng)性產(chǎn)物送往吉林省庫(kù)美生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果提交NCBI進(jìn)行序列比對(duì)，確認(rèn)目的基因。

1.2.2 菌株MLST分型 根據(jù)Diancourt等[7]報(bào)道的引物序列合成肺炎克雷伯菌擴(kuò)增引物,引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系25 μL：2×PCR Premix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/mL)各0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，滅菌ddH2O補(bǔ)足體系。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性20 s，退火(退火溫度見表1)30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，將擴(kuò)增出目的條帶的PCR產(chǎn)物送至吉林省庫(kù)美生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，序列上傳至肺炎克雷伯菌的MLST數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html)進(jìn)行比對(duì)，可獲得菌株的MLST型。

表1 肺炎克雷伯菌MLST引物

1.2.3 菌株致病性檢測(cè) 選擇35只SPF級(jí)昆明小鼠，共設(shè)定6個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每組各5只。將純化好的菌株接種于LB肉湯中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，用0.85%無(wú)菌生理鹽水稀釋菌液為1.0×109CFU/mL，試驗(yàn)組每只小鼠腹腔注射0.2 mL菌液；對(duì)照組注射等量生理鹽水。對(duì)注射菌液后小鼠6、12、24、36、48和60 h的發(fā)病和死亡情況分別進(jìn)行觀察記錄，并及時(shí)對(duì)死亡小鼠進(jìn)行病原分離。

1.2.4 血清型及毒力基因檢測(cè) 根據(jù)和晉渝[8]報(bào)道引物序列合成引物，擴(kuò)增莢膜多糖(K抗原)K1、K2、K3、K5、K20、K54、K57型7種血清型，以及rmpA、allS、iroNB、wcaG、kfuBC、fimH、ureA、ybtA、iucB、uge、wabG11種毒力基因。 PCR反應(yīng)體系25 μL：2×PCR Premix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/mL)各0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，滅菌ddH2O補(bǔ)足體系。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，將鑒定正確的PCR產(chǎn)物送往吉林省庫(kù)美生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)目的基因。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)的指導(dǎo)原則，采用瓊脂稀釋法測(cè)定多黏菌素B、氨芐西林、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、青霉素、氟苯尼考、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、左氧氟沙星、頭孢曲松、頭孢噻呋、頭孢他啶、頭孢西丁、亞胺培南、美羅培南、多西環(huán)素18種藥物對(duì)菌株的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)。依據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定，標(biāo)準(zhǔn)為少于5個(gè)單菌落或通過接種造成的微弱的薄霧狀生長(zhǎng)視為陰性，陰性出現(xiàn)最低濃度為MIC值。以MIC值位于CLSI規(guī)定的敏感(sensitive，S)、中介(intermediate，I)、耐藥(resistance，R)折點(diǎn)值范圍判斷結(jié)果。質(zhì)控菌株選用大腸埃希菌ATCC 25922。

1.2.6 耐藥基因檢測(cè) 根據(jù)Sun等[9]報(bào)道設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增氨基糖苷類、喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類、氟苯尼考和多黏菌素等25種耐藥基因。PCR反應(yīng)體系25 μL：2×PCR Premix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/mL)各0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，滅菌ddH2O補(bǔ)足體系。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，將鑒定正確的PCR產(chǎn)物送往吉林省庫(kù)美生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)目的基因。

2 結(jié) 果

2.1 菌株分離鑒定

6株分離菌株在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上形成“奶油狀”、濕潤(rùn)、圓形的菌落(圖1)，分別命名為K1、K2、K3、K4、K5、K6。生化鑒定結(jié)果顯示， 6株分離菌的生化特性與肺炎克雷伯菌相似。菌株在動(dòng)力半固體培養(yǎng)基中無(wú)動(dòng)力，氧化酶陰性，尿素酶、V-P試驗(yàn)、西蒙氏枸櫞酸鹽和賴氨酸脫羧酶鑒定均為陽(yáng)性，靛基質(zhì)、MR鑒定均為陰性，分解葡萄糖產(chǎn)氣(表2)。分離菌株khe基因PCR擴(kuò)增結(jié)果發(fā)現(xiàn)，獲得了長(zhǎng)度約為428 bp單一、特異性的條帶(圖2)，與預(yù)期長(zhǎng)度相符。通過序列比對(duì)結(jié)果表明，分離得到的6株菌株均為肺炎克雷伯菌。

圖1 分離菌株菌落形態(tài)

表2 分離菌株生化鑒定

1～6，樣品PCR產(chǎn)物;M，DL2000 DNA Marker；

2.2 MLST分型

通過MLST分型方法表明，6株肺炎克雷伯菌株分為6種ST型，分別為：ST2594、ST1782、ST2844、ST2330、ST86和ST661(表3)。

表3 菌株MLST分型

2.3 致病性分析

在接種菌液12 h后小鼠開始出現(xiàn)被毛粗亂、行動(dòng)遲緩、精神沉郁等癥狀；在接種菌液24 h后小鼠開始陸續(xù)死亡，48 h后試驗(yàn)組小鼠全部死亡，對(duì)照組小鼠未出現(xiàn)任何癥狀，生存曲線結(jié)果見圖3。剖檢死亡小鼠可見肝臟、脾臟和肺臟均有不同程度的出血點(diǎn)，同時(shí)從死亡小鼠的臟器組織中均能分離到肺炎克雷伯菌。

圖3 小鼠生存曲線

2.4 血清型及毒力基因檢測(cè)結(jié)果

以6株肺炎克雷伯菌DNA為模板檢測(cè)7種毒力較強(qiáng)的血清型和11種毒力基因，檢測(cè)結(jié)果見表4。由表4可知，共檢測(cè)出6種毒力基因，分別為：fimH、ureA、uge、wabG、kfuBC和allS，7種血清型均未檢測(cè)到。

表4 菌株毒力基因檢測(cè)結(jié)果

2.5 藥物敏感性分析

選用臨床常用的18種抗菌藥物對(duì)6株肺炎克雷伯菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，結(jié)果見表5。由表5可知，6株菌株對(duì)頭孢西丁、頭孢他啶、阿米卡星、亞胺培南和美羅培南均表現(xiàn)為較強(qiáng)的敏感性；對(duì)青霉素、卡那霉素、環(huán)丙沙星和恩諾沙星均表現(xiàn)為耐藥；對(duì)鏈霉素和氟苯尼考的耐藥率為83.3%(5/6)，對(duì)氨芐西林、頭孢曲松、慶大霉素及多西環(huán)素的耐藥率為66.7%(4/6)，對(duì)頭孢噻呋的耐藥率為50.0%(3/6)，對(duì)左氧氟沙星和多黏菌素B的耐藥率為16.7%(1/6)。

表5 肺炎克雷伯菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

以6株肺炎克雷伯菌DNA為模板，采用PCR方法檢測(cè)氨基糖苷類、喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類、氟苯尼考和多黏菌素等25種耐藥基因，菌株耐藥基因攜帶情況見表6。由表6可知，共檢測(cè)出18種耐藥基因，主要包括β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaSHV、blaTEM-1和blaCTX-M-1G；氨基糖苷類耐藥基因aadA1、aac(3’)-Ⅳ、aac(3’)-Ⅱc、aph(4’)-Ⅰa、aph(3’)-Ⅶ，aph(3’)-Ⅳ,aph(2’)-Ⅰb和rmtB；喹諾酮類耐藥基因qnrB、qnrD、qnrS、qepA和oqxAB；氟苯尼考耐藥基因floR；多黏菌素類耐藥基因mcr-1。

表6 菌株藥物敏感性及耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

肺炎克雷伯菌是致使醫(yī)院和社區(qū)內(nèi)感染的常見病原菌之一，可引起呼吸、泌尿等多系統(tǒng)的感染。目前，抗生素是治療肺炎克雷伯菌感染的最主要手段之一，臨床上用于治療肺炎克雷伯菌感染的抗菌藥主要有β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類、碳青霉烯類及多黏菌素。由于抗生素長(zhǎng)期、大量、不規(guī)范地使用，致使菌株在藥物的選擇壓力作用下產(chǎn)生耐藥性。 近年來(lái)，隨著多耐藥菌和泛耐藥菌的出現(xiàn)，耐藥率呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，肺炎克雷伯菌的耐藥問題也越來(lái)越嚴(yán)重。同時(shí)，毛皮動(dòng)物細(xì)菌耐藥性問題也日趨嚴(yán)重，應(yīng)給予高度重視[10-11]。

本試驗(yàn)分離得到6株水貂源肺炎克雷伯菌，經(jīng)MLST分型可知6株菌株具有6種ST型，表明肺炎克雷伯菌的流行存在一定的分子差異。目前，關(guān)于水貂肺炎克雷伯菌ST型流行性的報(bào)道較少。楊帆等[12]對(duì)67株動(dòng)物源肺炎克雷伯菌進(jìn)行MLST分析表明，全部菌株共分成17個(gè)ST型，其中雞源菌株有5個(gè)(ST235、ST37、ST2019、ST2021、ST726)，豬源菌株有6個(gè)(ST258、ST11、ST270、ST106、ST1863、ST263)，兔源菌株有4個(gè)(ST17、ST148、ST60、ST168)，犬源菌株有3個(gè)(ST11、ST65、ST74)。據(jù)研究報(bào)道，ST258型為歐美國(guó)家主要流行的分子型，ST37型是雞群中主要流行的分子型，ST11型為國(guó)內(nèi)醫(yī)院感染肺炎克雷伯菌的主要流行的分子型[13-14]。本試驗(yàn)6株肺炎克雷伯菌雖然為同一養(yǎng)殖場(chǎng)送檢的樣品，但主要表現(xiàn)為6種ST型，該現(xiàn)象十分罕見，可能是因?yàn)樗醴窝卓死撞嬖谔赜械腟T型，又或是這些菌株很可能來(lái)源于人，經(jīng)過人類的活動(dòng)或環(huán)境傳播到動(dòng)物。莢膜多糖是肺炎克雷伯菌的主要毒力因子，其中K1、K2、K3、K5、K20、K54和K57型是毒力較強(qiáng)的血清型。另外，肺炎克雷伯菌感染動(dòng)物與其自身攜帶的致病因子關(guān)系密切[15]。本試驗(yàn)中分離菌株均檢測(cè)到毒力基因，且每株菌株都攜帶至少4種毒力基因，檢出率較高；7種血清型均未檢測(cè)到，說明6株分離菌株的致病力主要與攜帶的毒力基因有關(guān)。

近年來(lái)，關(guān)于毛皮動(dòng)物肺炎克雷伯菌的研究逐漸增多。孫虎芝等[16]對(duì)從山東地區(qū)分離得到的水貂肺炎克雷伯菌進(jìn)行藥敏檢測(cè)，結(jié)果表明，菌株對(duì)諾氟沙星、頭孢吡肟、阿米卡星、磷霉素、左氟沙星、頭孢他啶、大觀霉素、環(huán)丙沙星、氯霉素、多黏菌素B及頭孢西丁敏感；對(duì)氨芐西林、卡那霉素、紅霉素、林可霉素、四環(huán)素、頭孢噻吩、頭孢呋辛、頭孢唑啉及青霉素G耐藥。韓坤等[17-18]研究結(jié)果表明，不同年份分離得到的菌株的藥物敏感性不盡相同，2015年從山東地區(qū)分離的10株菌株對(duì)氨基糖苷類、青霉素類、三代頭孢菌素類、喹諾酮類及磺胺類抗菌藥的耐藥性較高，但對(duì)阿莫西林/克拉維酸、亞胺培南及多黏菌素等抗生素敏感；2018年從河北地區(qū)分離的1株菌株對(duì)單環(huán)內(nèi)酰胺類、氯霉素類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、磺胺類及大部分頭孢類耐藥，但對(duì)阿米卡星、阿莫西林/克拉維酸、頭孢他啶和亞胺培南敏感。朱利霞等[19]對(duì)從河北昌黎分離得到的1株水貂肺炎克雷伯菌進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，菌株對(duì)頭孢曲松、阿米卡星、恩諾沙星敏感，對(duì)卡那霉素，頭孢拉定、氨芐西林、阿莫西林、青霉素、多西環(huán)素、恩諾沙星、林可霉素和復(fù)方新諾明耐藥。本試驗(yàn)中菌株藥敏結(jié)果與以上研究結(jié)果略有不同，表明不同年份不同地區(qū)菌株的耐藥情況也不同，主要是由各養(yǎng)殖場(chǎng)用藥方案不同導(dǎo)致的。因此，為減少耐藥菌株的產(chǎn)生，必須制定有效的防控措施，合理應(yīng)用抗生素。

細(xì)菌的耐藥機(jī)制包括多種，耐藥基因是其中最為常見的一種機(jī)制。韓坤等[17]從分離得到的10株肺炎克雷伯菌中檢測(cè)到耐藥基因blaTEM、blaSHV和blaCTX- M；朱利霞等[20]從毛皮動(dòng)物肺炎克雷伯菌中檢測(cè)出blaTEM、aadA1、gyrB、gyrA、blaSHV-1、sul1、sul2、sul3、blaROB-1、tetA和tetD基因；張傳美等[21]從貂源肺炎克雷伯菌中檢測(cè)出aac(3’)-Ⅱ、blaTEM、blaSHV、blaCTX-M-8、qnrS、aac(6’)-Ⅰb和aac(2)基因。本試驗(yàn)共檢測(cè)出18種耐藥基因，且多數(shù)為質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因，與以上研究有共同的耐藥基因。質(zhì)粒是一種能夠自主復(fù)制的染色體外DNA分子，它是捕捉、積累和傳播抗菌藥物耐藥性決定基因的重要載體，可以攜帶對(duì)β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類、四環(huán)素類、氯霉素、磺胺類、甲氧芐啶類、大環(huán)內(nèi)酯類、多黏菌素類和碳青霉烯類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥的基因在細(xì)胞內(nèi)外進(jìn)行交換形成新的重組質(zhì)粒[22-26]。因此，質(zhì)粒在耐藥基因積累和水平傳播方面發(fā)揮著重要作用。監(jiān)測(cè)質(zhì)粒攜帶的耐藥基因?qū)χ笇?dǎo)臨床治療、預(yù)防和控制耐藥基因的水平傳播具有重要意義。

4 結(jié) 論

本研究從患有肺炎的病死水貂中分離得到6株肺炎克雷伯菌，可分為6個(gè)ST型；6株分離菌株均可引起小鼠死亡，并攜帶多種毒力基因；至少對(duì)7種抗菌藥物表現(xiàn)為耐藥，主要呈現(xiàn)為多重耐藥現(xiàn)象。同時(shí)分離菌株攜帶18種耐藥基因，其中包括β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類、氟苯尼考和多黏菌素類耐藥基因，且多數(shù)耐藥基因?yàn)橘|(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因，其可引起細(xì)菌耐藥性的快速傳播，從而增強(qiáng)細(xì)菌的耐藥性。