張艷敏，周亞南，曹 磊，田 園，劉旭平，譚文松，趙 亮

(1.華東理工大學(xué),生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海 200237；2.上海倍諳基生物科技有限公司，上海 201203)

豬瘟(classical swine fever,CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的豬的高傳染性、高致病性疾病，嚴(yán)重危害動物健康和養(yǎng)豬業(yè)[1-2]。CSFV屬于黃病毒科(Flaviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)，有4種結(jié)構(gòu)蛋白(C、E0、E1和E2)[3]。其中，E2蛋白是CSFV的主要保護性抗原，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對CSFV的中和抗體，是研究各種CSFV基因工程疫苗的首選靶蛋白[4]。CSF的防控措施主要是清除政策和預(yù)防性疫苗接種，但因清除政策在高密度養(yǎng)豬區(qū)會造成巨大的經(jīng)濟損失，所以在除歐盟外的許多國家仍使用預(yù)防性疫苗接種防控CSF[5-6]。目前可用的CSFV疫苗有減毒活疫苗、亞單位疫苗和嵌合疫苗，應(yīng)用最廣泛的是減毒活疫苗。這3類疫苗均有一定的局限性，如減毒活疫苗不能從血清學(xué)上區(qū)分豬群中的疫苗接種豬和野毒感染豬(differentiation of infected from vaccinated animals,DIVA)，給CSF的控制和凈化帶來了挑戰(zhàn)；嵌合疫苗在DIVA鑒定診斷方面會受到牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)和邊界病毒(Border disease virus,BDV)的交叉反應(yīng)影響，樣品檢測的特異性低；而E2亞單位疫苗除了具有DIVA特性外，還具有安全性好、穩(wěn)定性強、便于運輸和儲存等優(yōu)點，是防控CSF的有效措施[7]，但E2亞單位疫苗的免疫原性較低，不能提供完全保護[8-9]。因此，為了預(yù)防和控制CSF，開發(fā)安全有效的新型CSFV標(biāo)記疫苗十分必要。近年來，已有學(xué)者利用不同的表達系統(tǒng)對E2亞單位疫苗進行表達研究，如大腸桿菌表達系統(tǒng)[10]、酵母表達系統(tǒng)[11]和桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)[12]等，但E2亞單位疫苗的免疫原性并沒有明顯提高。為進一步開發(fā)E2亞單位疫苗，將E2蛋白與分子佐劑結(jié)合、使用改良佐劑的E2乳劑及使用流行株的E2蛋白等多種途徑被嘗試用于提高E2蛋白免疫原性[8]。細胞因子是參與免疫發(fā)展和調(diào)控的關(guān)鍵分子，已在一些治療性和預(yù)防性疫苗中作為分子佐劑來提高抗原免疫效力[13-14]。其中，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)在先天免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中有廣泛的調(diào)節(jié)作用，如募集抗原遞呈細胞(antigen-presenting cells,APCs)到抗原加工位點，增強抗原特異性CD8+T細胞反應(yīng)等[13]。研究表明，GM-CSF可作為免疫佐劑增強抗原的免疫原性[15-16]。因此，在表達CSFV E2蛋白的同時表達GM-CSF，有望提高E2蛋白的免疫原性，增強免疫反應(yīng)。CSFV的宿主細胞是哺乳動物細胞，用哺乳動物細胞表達CSFV E2蛋白更有利于其形成天然構(gòu)象和合適的糖基化形式[17]。本研究通過構(gòu)建穩(wěn)定表達E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重組細胞，實現(xiàn)E2-GM-CSF融合蛋白在哺乳動物細胞中的表達，并通過小鼠免疫試驗分析E2-GM-CSF融合蛋白的免疫原性，以期為CSFV亞單位疫苗開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

HEK293T細胞(編號：CRL-3216)購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection,ATCC)；慢病毒表達載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-puro(pCDH)購自SBI公司；慢病毒包裝質(zhì)粒pMD2.G和psPAX2均購自ThermoFisher Scientific公司；DNA Marker、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、細胞基因組DNA提取試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；嘌呤霉素鹽酸鹽和BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)公司；His-TrapTMexcel預(yù)裝柱購自GE公司；CSFV抗原檢測ELISA試劑盒購自Median公司；Montanide ISA61佐劑購自SEPPIC公司。4～6周齡健康BALB/c雌鼠購自杭州華安生物技術(shù)有限公司。

1.2 重組慢病毒表達載體的構(gòu)建

為了使E2蛋白分泌表達，去除其C-端胞內(nèi)區(qū)和跨膜區(qū)的蛋白，同時在其C-端加入6個組氨酸標(biāo)簽以便于純化。合成符合上述要求的CSFV 石門株E2基因(GenBank登錄號:AF092448.2)和豬GM-CSF基因(GenBank登錄號:AAB06854.1)并克隆至pGH載體構(gòu)建pGH-E2和pGH-GM-CSF質(zhì)粒。以pGH-E2和pGH-GM-CSF質(zhì)粒為模板PCR擴增E2、E2-F和GM-CSF DNA序列(引物信息見表1)，其中E2-F片段是在E2基因的5′-端加上與GM-CSF基因3′-端同源的序列。以E2-F和GM-CSF為模板，F(xiàn)1和R3為引物通過重疊PCR(Overlap PCR)擴增E2-GM-CSF基因。將E2和E2-GM-CSF基因與pCDH載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Stabl3感受態(tài)細胞，經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切和測序鑒定，重組質(zhì)粒命名為pCDH-E2和pCDH-E2-GM-CSF。

表1 引物信息

1.3 重組慢病毒包裝

將HEK293T細胞接種至6孔板，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基。配制DNA-轉(zhuǎn)染試劑混合物：向DMEM培養(yǎng)液中加入pCDH-E2、pCDH-E2-GM-CSF或pCDH對照質(zhì)粒和慢病毒包裝質(zhì)粒pMD2.G和psPAX2，再加入Lipo8000TM轉(zhuǎn)染試劑，混勻后加至上述6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，收集培養(yǎng)上清，經(jīng)濾膜過濾后，于-80 ℃保存。

1.4 重組細胞的構(gòu)建和鑒定

分別用pCDH對照、E2和E2-GM-CSF慢病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)HEK293T細胞，經(jīng)嘌呤霉素加壓篩選后，獲得HEK293T-pCDH對照細胞及HEK293T-E2和HEK293T-E2-GM-CSF重組細胞。將重組細胞接種至6孔板，培養(yǎng)120 h，收集細胞提取基因組DNA進行PCR驗證；收集培養(yǎng)上清通過ELISA和Western blotting檢測E2蛋白和E2-GM-CSF融合蛋白。設(shè)計并合成引物對基因組DNA進行PCR驗證。引物序列為：上游引物：5′-CGCAAATGGG-CGGTAGGCGTG-3′；下游引物：5′-GGCACCGG-AGCGATCGCAGATC-3′。以基因組DNA為模板PCR擴增E2和E2-GM-CSF片段，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。用CSFV抗原ELISA試劑盒檢測培養(yǎng)上清中E2蛋白的表達，根據(jù)樣品(sample)D450 nm值同陽性對照(positive)D450 nm值比較后得到的SP值(sample/positive),判斷樣品中蛋白的結(jié)果；以鼠抗豬GM-CSF單克隆抗體作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗,Western blotting分析E2-GM-CSF融合蛋白。

1.5 重組蛋白的純化

離心收集HEK293T-E2和HEK293T-E2-GM-CSF細胞培養(yǎng)上清，經(jīng)濾膜過濾除雜，用His-TrapTMexcel柱進行蛋白純化，用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測純化蛋白濃度。純化后蛋白用10% SDS-PAGE膠分離，經(jīng)考馬斯亮藍染色、純水脫色后觀察蛋白條帶。

1.6 亞單位疫苗制備和免疫原性分析

將純化后的E2蛋白、E2-GM-CSF融合蛋白和PBS與Montanide ISA61佐劑以2∶3比例混合制成疫苗。將4～6周齡BALB/c雌鼠隨機分為3組，每組5只。E2組小鼠腹腔注射含25 μg E2蛋白的疫苗，200 μL/只；E2-GM-CSF組小鼠腹腔注射含25 μg E2-GM-CSF融合蛋白的疫苗，200 μL/只；對照組小鼠注射等體積的PBS乳劑。第1次免疫后21 d以相同劑量和相同方式進行第2次免疫。第1次免疫后第0、14、21和28天對免疫鼠采血，用于檢測E2特異性抗體。

1.7 ELISA檢測小鼠血清中的E2特異性抗體

利用間接ELISA方法測定免疫小鼠血清中抗體效價。用包被液稀釋純化的E2蛋白，以4 ng/μL E2蛋白包被96孔酶標(biāo)板，于4 ℃包被過夜；PBST洗板3次；用含3% BSA的PBST室溫封閉2 h；PBST洗板3次；加入梯度稀釋的待檢血清(血清從1∶300至1∶24 300進行3倍倍比稀釋)，室溫孵育1 h；PBST洗板5次；加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，置于室溫孵育1 h；PBST洗板5次；加入TMB顯色液，避光顯色10 min；加入硫酸終止顯色，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光值。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因克隆

分別以pGH-E2和pGH-GM-CSF質(zhì)粒為模板，PCR擴增E2、E2-F和F-GM-CSF DNA片段，得到大小分別約為1 089、1 157和438 bp 的E2、E2-F和F-GM-CSF條帶(圖1A)。 以純化后的E2-F和F-GM-CSF為模板，用重疊PCR方法擴增E2-GM-CSF融合基因，得到大小為1 515 bp的E2-GM-CSF條帶。表明成功擴增了E2和E2-GM-CSF基因，可用于重組質(zhì)粒構(gòu)建。

M，D2000 DNA Marker；1，E2-F片段；2，F(xiàn)-GM-CSF片段；3，E2基因；4，E2-GM-CSF基因

2.2 重組質(zhì)粒pCDH-E2和pCDH-E2-GM-CSF的雙酶切鑒定

重組質(zhì)粒pCDH-E2和pCDH-E2-GM-CSF經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定，結(jié)果顯示，分別得到大小為8 172 bp的載體片段及1 112和1 521 bp的E2及E2-GM-CSF基因片段(圖2)。測序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pCDH-E2和pCDH-E2-GM-CSF的目的基因序列正確。

M，D15000 DNA Marker；1，重組質(zhì)粒pCDH-E2雙酶切；2，重組質(zhì)粒pCDH-E2-GM-CSF雙酶切

2.3 HEK293T-E2和HEK293T-E2-GM-CSF重組細胞鑒定

在HEK293T-E2和HEK293T-E2-GM-CSF細胞基因組DNA PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖中分別觀察到1 258和1 686 bp的條帶(圖3)，與預(yù)期大小相符，證明E2和E2-GM-CSF基因成功整合至細胞基因組DNA。

M，D2000 DNA Marker；1，未處理的HEK293T細胞；2，HEK293T-pCDH對照細胞；3，HEK293T-E2細胞；4，HEK293T-E2-GM-CSF細胞

2.4 重組蛋白的ELISA和Western blotting鑒定

收集重組細胞培養(yǎng)上清，進行ELISA和Western blotting鑒定。ELISA結(jié)果顯示，未處理的HEK293T細胞和HEK293T-pCDH對照細胞培養(yǎng)上清SP值遠<20%，未檢測到E2蛋白；HEK293T-E2和HEK293T-E2-GM-CSF細胞培養(yǎng)上清SP值遠>20%，檢測到E2蛋白(圖4)，證明E2蛋白在重組細胞中分泌表達。Western blotting結(jié)果顯示，細胞培養(yǎng)上清中檢測到大小約70 ku的E2-GM-CSF融合蛋白(圖5)，說明E2-GM-CSF融合蛋白在重組細胞中分泌表達。

NC，未處理細胞上清；pCDH，HEK293T-pCDH對照細胞上清；E2，HEK293T-E2細胞上清；E2-GM-CSF，HEK293T-E2-GM-CSF細胞上清

圖5 Western blotting檢測培養(yǎng)上清中的E2-GM-CSF融合蛋白

2.5 重組蛋白純化

SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示，獲得清晰單一的大小分別約為50和70 ku的E2蛋白和E2-GM-CSF融合蛋白條帶(圖6)，說明純化后的E2蛋白和E2-GM-CSF融合蛋白純度較高。

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，E2蛋白；2，E2-GM-CSF融合蛋白

2.6 小鼠血清E2特異性抗體檢測

用ELISA檢測免疫小鼠血清中的E2特異性抗體水平，結(jié)果見表2。由表2可知，PBS對照組小鼠血清中未檢測到E2特異性抗體；E2組在免疫后14 d檢測到E2特異性抗體，在免疫后28 d抗體效價達到最高值，為1∶1 800；E2-GM-CSF組在免疫后14 d檢測到與E2組相同量的抗體，在免疫后21和28 d抗體效價均高于E2組，最高為1∶8 100，表明HEK293T細胞表達的E2蛋白和E2-GM-CSF融合蛋白均有免疫原性，且E2-GM-CSF融合蛋白的免疫原性更高。

表2 ELISA檢測小鼠血清中的E2特異性抗體效價

3 討 論

E2亞單位疫苗是新型CSFV疫苗的重要研究方向，但與減毒活疫苗相比，由于E2蛋白的免疫原性較低導(dǎo)致E2亞單位疫苗保護效果不理想，所以有必要配合高效的佐劑使用。已有研究表明，細胞因子作為“抗原-細胞因子”融合蛋白疫苗或作為“抗原+細胞因子”混合疫苗給藥時可顯著增強各種抗原的免疫原性，且作為“抗原-細胞因子”融合蛋白疫苗給藥時，細胞因子表現(xiàn)出更好的佐劑活性[18]。GM-CSF是一類能促進早期造血細胞生成并調(diào)節(jié)成熟中性粒細胞功能的細胞因子，在臨床上對調(diào)節(jié)免疫功能、促進疫苗的效果有顯著作用。 Liu等[19]研究表明，GM-CSF可通過免疫應(yīng)答增強HPV16/18疫苗的抗腫瘤作用，證明了GM-CSF的佐劑活性。又因為原核表達的E2蛋白缺乏正確的翻譯后修飾且多為包涵體，而CSFV的宿主是哺乳動物細胞，用哺乳動物細胞表達CSFV E2蛋白更有利于其形成天然構(gòu)象和合適的糖基化形式。

本研究構(gòu)建了穩(wěn)定表達E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重組細胞，并通過小鼠免疫試驗分析了表達的E2-GM-CSF融合蛋白的免疫原性。利用慢病毒載體構(gòu)建了表達E2蛋白和E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重組細胞，實現(xiàn)了重組蛋白在哺乳動物細胞中相對快速的生產(chǎn)。研究表明，E2蛋白缺乏合適的翻譯后修飾，尤其是糖基化時不能誘導(dǎo)可檢測的病毒中和抗體反應(yīng)和針對CSFV的保護，且CSFV是哺乳動物細胞病毒，GM-CSF也是由哺乳動物細胞表達的細胞因子，所以與其他表達系統(tǒng)相比，哺乳動物細胞表達系統(tǒng)更有利于形成具有正確結(jié)構(gòu)和合適糖基化的E2-GM-CSF融合蛋白[17，20]。Lorenzo等[21]利用HEK293細胞表達了CSFV E2蛋白和豬CD154分子的融合蛋白E2-CD154，發(fā)現(xiàn)即使在不同的培養(yǎng)條件下，HEK293細胞表達的蛋白批次間也具有高度的可重復(fù)性和一致性。這為用HEK293細胞表達E2蛋白和E2-GM-CSF融合蛋白提供了依據(jù)。通過常規(guī)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定細胞系費時費力，又因質(zhì)粒在細胞基因組中的隨機整合，使得結(jié)果難以預(yù)測，而慢病毒傾向于高頻率整合至具有轉(zhuǎn)錄活性的染色質(zhì)中，可在細胞中產(chǎn)生更高、更穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因表達[22-23]。因此，與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染構(gòu)建穩(wěn)定細胞株相比，本研究用慢病毒載體構(gòu)建表達E2蛋白和E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293重組細胞是相對快速的方法。重組細胞表達的E2蛋白和E2-GM-CSF融合蛋白純化后，通過小鼠免疫試驗分析了其免疫原性。免疫小鼠血清的ELISA結(jié)果表明，E2-GM-CSF融合蛋白免疫原性高于E2蛋白。這與倪蒞文等[24]用大腸桿菌表達的E2和GM-CSF融合蛋白的小鼠免疫結(jié)果一致，E2和GM-CSF融合蛋白比E2蛋白免疫小鼠后產(chǎn)生的抗體水平更高。而Wang等[25]進行的豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白(PCV2-Cap)亞單位疫苗的研究結(jié)果表明，Cap-PoGM-CSF融合蛋白免疫小鼠后誘導(dǎo)的PCV2特異性抗體水平與PCV2-Cap蛋白沒有明顯差異，但可引起更強的淋巴細胞增殖反應(yīng)和更多的白介素-2和干擾素-γ分泌，表明GM-CSF不能增強由PCV2-Cap疫苗誘導(dǎo)的體液免疫，卻可增強由PCV2-Cap疫苗誘導(dǎo)的細胞免疫。GM-CSF在體液免疫中展現(xiàn)不同作用的原因可能是由抗原蛋白本身的特點導(dǎo)致的，也可能與抗原蛋白與GM-CSF形成的融合蛋白的結(jié)構(gòu)有關(guān)，具體原因還有待進一步研究。本研究并沒有驗證E2-GM-CSF融合蛋白是否會像Cap-PoGM-CSF融合蛋白一樣引起更強的細胞免疫反應(yīng)，所以需進行免疫試驗進一步分析，E2-GM-CSF融合蛋白的免疫原性也需進行豬免疫和攻毒試驗進一步評估。

4 結(jié) 論

本研究利用慢病毒載體構(gòu)建了表達E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重組細胞，可正確表達具有免疫原性的E2-GM-CSF融合蛋白，為預(yù)防和控制CSF提供了新型的候選E2亞單位疫苗，并為其他亞單位疫苗在哺乳動物細胞中的表達提供參考。