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        胚胎移植前供體牛與受體牛血漿外泌體miRNA差異表達分析

        2022-03-03 01:15:36翟亞瑩施巧婷楚秋霞朱肖亭滑留帥張子敬陳付英祁興磊王二耀呂世杰
        中國畜牧獸醫(yī) 2022年2期
        關鍵詞:血漿差異信號

        翟亞瑩,施巧婷,楚秋霞,朱肖亭,滑留帥,張子敬,陳付英,祁興磊,王二耀,呂世杰

        (1.河南省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所,河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調控重點實驗室,鄭州 450002;2.河南農業(yè)大學動物科技學院,鄭州 450008;3.泌陽縣畜牧技術服務中心,駐馬店 463700)

        繁殖性狀是奶牛和肉牛產業(yè)中重要的經濟性狀,繁殖效率的高低顯著影響牛場的經濟效益。母牛屢配不孕導致的輸精次數增加、空懷時間加長和被動淘汰率升高等問題給牛產業(yè)帶來了嚴重的經濟損失。影響牛群受胎率的原因復雜,除了飼養(yǎng)管理外,與個體牛妊娠前后的體內環(huán)境變化也有關系,成功的妊娠不僅需要胚胎自身的正常發(fā)育,還需要有利于胚胎著床的子宮環(huán)境[1-2]。

        近年來,關于外泌體的研究越來越多,由于絕大多數細胞均能分泌外泌體,并且其分泌量和內容物(核酸、蛋白質和脂質等)在正常及病理狀態(tài)下存在顯著差異,因此外泌體備受科研工作者關注[3-4]。外泌體是一種能被大多數細胞分泌的微小膜泡,是細胞間通訊的一種重要介質[5]。隨著外泌體研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)外泌體在哺乳動物妊娠過程中也發(fā)揮重要作用,如子宮液外泌體可以調控胚胎的發(fā)育和著床[6]。

        對人而言,胎盤在懷孕6周就將外泌體釋放到母體循環(huán)中[7]。外泌體作為細胞間信息傳遞介質,將作用于母體的蛋白質、mRNA等生物成分釋放到母體循環(huán)后,被母體免疫和血管系統(tǒng)的細胞吸收,從而調節(jié)整個母體生理系統(tǒng)以適應妊娠引起的變化[8-11]。Ramkumar等[12]分析了人足月妊娠和早產的循環(huán)外泌體miRNA譜,并提出母體血液中循環(huán)外泌體miRNA含量可能代表妊娠進展的雙分子“指紋”。外泌體也具有調控牛妊娠的作用,如Zhao等[13]運用轉錄組測序(RNA-Seq)技術,對奶牛妊娠各階段的血漿外泌體miRNA進行分析,在奶牛妊娠的不同階段都檢測到了特異性的外泌體miRNA,妊娠30 d時外泌體通過bta-let-7和bta-miR-499等miRNA直接或間接靶向核因子κB(NF-κB)信號通路,調節(jié)子宮局部免疫微環(huán)境促炎/抗炎平衡[14]。另外,Kesavan等[15]對3頭正常未妊娠和妊娠30 d的健康奶牛的血液樣本進行miRNA的檢測與分析發(fā)現(xiàn),與正常未妊娠相比,妊娠30 d時有29個miRNAs差異顯著。上述研究表明,血漿外泌體miRNA及血液miRNA對奶牛妊娠均具有一定的調控作用。母牛卵母細胞成功受精后第7天形成囊胚,并在子宮內處于游離狀態(tài),此時子宮開始為胚胎著床做準備,探明此時供體牛與受體牛血漿外泌體miRNA差異表達譜對調控早期妊娠具有重要作用。本研究通過分析人工授精后第7天供體牛與受體牛的血漿外泌體miRNA表達差異情況,以期為研究血漿外泌體miRNA對牛早期妊娠的調控作用提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 試驗動物及處理

        本研究以3~6歲、體重480~600 kg的夏南牛作為研究對象,選取10頭供體牛(G)進行同期發(fā)情、超數排卵和人工授精,23頭受體牛(S)只進行同期發(fā)情。在人工授精后第7天沖洗供體牛子宮,根據供體牛沖出的胚胎情況選取3頭胚胎數相近的供體牛用于后續(xù)研究。同時選取3頭與供體牛體重和年齡均相近的受體牛。頸靜脈采血,收集供體牛和受體牛血液并分離血漿,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2 外泌體的分離與鑒定

        將血漿樣品37 ℃解凍后,4 ℃、2 000×g離心30 min,收集上清液,4 ℃、12 000×g離心45 min,去除較大的囊泡。 收集上清液,用0.45 μm濾膜過濾,將濾液4 ℃、110 000×g離心70 min。去除上清液,用10 mL預冷的PBS重懸,4 ℃、110 000×g離心70 min。去除上清液,用50 μL預冷的PBS重懸,-80 ℃保存?zhèn)溆谩K脴悠肪捎肸etaView S/N 17-310(Particle Metrix,Germany)進行納米顆粒跟蹤分析(NTA)檢測外泌體的粒徑。

        1.3 miRNA的篩選與鑒定

        提取血漿外泌體總RNA,構建并純化small RNA文庫,檢測質量合格后,使用高通量測序方法進行測序。 測序得到原始數據后去除接頭序列,進行Q20質控,然后去掉序列長度<15 nt、>41 nt的所有重復序列,得到clean reads。 使用bowtie軟件[16]將miRNA篩選出來,對過濾后的序列和miRBase數據庫進行比對,統(tǒng)計已知的miRNA。未注釋上miRBase數據庫的序列,進行新miRNA預測。 通過Benjamini & Hochberg多重檢驗校正的FDR(false discovery rate)值篩選出差異顯著的miRNA。

        1.4 差異表達miRNA的的靶基因預測與分析

        對已知miRNA和新預測miRNA進行表達量計算,采用TPM(transcript per million)值作為度量指標。使用R語言的DESeq數據包分析供體牛與受體牛的差異表達miRNA,以P<0.05和|log2FoldChange|>1作為差異表達閾值。使用miRanda軟件[17]對差異表達miRNA進行靶基因預測(S≥150,ΔG≤-125.6 kJ/mol),并對靶基因進行GO功能富集分析和KEGG信號通路分析[18]。

        2 結 果

        2.1 血漿外泌體粒徑分析

        納米顆粒跟蹤分析(NTA)的結果顯示,6個樣本的囊泡粒徑均在135 nm左右,符合外泌體的直徑特征(圖1)。

        圖1 血漿外泌體粒徑

        2.2 miRNA的鑒定分析

        所有樣本比對上已知miRNA的總數為432,新預測miRNA的總數為451。其中有22個miRNAs顯著差異富集,通過Benjamini & Hochberg多重檢驗校正的FDR值,篩選出差異最顯著(FDR<0.05)的5個miRNAs分別為bta-miR-2431-5p、bta-miR-4657、novel492-mature、novel56-star和novel376_mature(表1)。受體牛與供體牛對比分析發(fā)現(xiàn),受體牛中有9個miRNAs上調,13個miRNAs下調(圖2)。

        表2 差異表達miRNA

        ①G,供體牛;S,受體牛

        2.3 差異表達miRNA的GO功能富集分析和KEGG信號通路分析

        22個差異表達的miRNAs中,有15個miRNAs預測到2 990個無重復靶基因,注釋到52個GO亞類中(level 2),參與的生物學過程包括生物黏附(biological adhesion)、定位(localization)、定位的建立(establishment of localization)、生物調節(jié)(biological regulation)、刺激反應(response to stimulus)等;涉及的細胞成分為細胞器(organelles)、細胞連接(cell junction)和大分子配合物(macromolecular complexes)等;發(fā)揮的分子功能包括結合(binding)、催化活性(catalytic activity)、受體活性(receptor activity)、轉運活性(transporter activity)等(圖3)。其中生物黏附(biological adhesion)、定位(localization)和細胞連接(cell junction)等生物過程在胚胎著床中發(fā)揮著重要作用。

        圖3 差異表達miRNA的GO功能富集分析

        KEGG信號通路分析發(fā)現(xiàn)81個顯著富集信號通路,包括黏著斑(focal adhesion)、黏著連接(adherens junction)、催產素信號通路(oxytocin signaling pathway)、促性腺激素釋放激素(GnRH)信號通路(GnRH signaling pathway)、Wnt信號通路(Wnt signaling pathway)、吲哚生物堿的生物合成(biosynthesis of indole alkaloids)和轉化生長因子-β(TGF-β)信號通路(TGF-β signaling pathway)等(圖4)。

        圖4 差異表達miRNA顯著富集的KEGG信號通路(前20)

        綜合GO功能富集分析與KEGG信號通路分析,22個差異miRNAs中有10個miRNAs富集在與生物黏附(biological adhesion)、定位(localization)、細胞連接(cell junction)、黏著斑(focal adhesion)和黏著連接(adherens junction)有關的生物功能和信號通路上,分別是bta-miR-339a、novel229_mature、novel270_mature、novel305_mature、bta-miR-11971、novel475_mature、novel492_mature、novel588_mature、novel613_mature和bta-miR-199a-3p。其中bta-miR-339a、novel229_mature、novel305_mature和novel588_mature等4個miRNAs在供體牛中的表達量顯著上調,其靶基因富集在細胞定位和黏附連接的通路上。

        3 討 論

        胚胎著床是一個持續(xù)的動態(tài)過程,包括定位、黏附和侵入等著床事件,研究表明外泌體對胚胎著床具有重要影響[19]。目前關于人類的胚胎著床的研究較多,對胚胎反復著床失敗患者與有生育能力的婦女所分泌子宮液的miRNA進行差異表達分析,發(fā)現(xiàn)其差異表達miRNA同樣富集在黏著連接(adherens junction)、細胞黏附(cell adhesion)等信號通路上[20]。在胚胎準備著床時,人子宮內膜的黏附性會發(fā)生改變,為滋養(yǎng)層的成功植入做準備[21]。在胚胎準備著床時,倉鼠的子宮內膜上皮細胞的黏附蛋白也會發(fā)生變化,并且由于黏著連接(adherens junction)通路參與了細胞識別、黏附、建立細胞極性和通透性屏障的特性,對維持子宮結構的完整性、腔內環(huán)境的組成以及著床的開始都非常重要[22]。本研究表明,血漿外泌體中有22個差異表達的miRNAs,其中受體牛有9個miRNAs上調,13個miRNAs下調。GO功能富集分析表明,這些差異表達基因主要富集在生物黏附(biological adhesion)、定位(localization)、細胞連接(cell junction)等生物過程。將這些靶基因在KEGG數據庫中進一步注釋發(fā)現(xiàn),差異表達miRNA在黏著斑(focal adhesion)、黏著連接(adherens junction)信號通路顯著富集,這些通路調控著許多與胚胎著床有關的蛋白[23-26],進一步說明本研究得到的血漿外泌體差異表達miRNA所富集的通路與胚胎著床有關。

        在TGF-β信號通路中發(fā)揮重要功能的TGF-β是一種抗炎細胞因子,研究表明,其可以促進羊膜上皮細胞的上皮-間質轉化,以維持胎膜穩(wěn)態(tài)[27]。在胎盤中,TGF-β1和胰島素樣生長因子結合蛋白3(IGFBP-3)可通過TGF-β受體信號影響人滋養(yǎng)層細胞的增殖[28]。對正常妊娠和分娩過程的外泌體miRNA的分析表明,TGF-β介導的組織穩(wěn)態(tài)(調節(jié)細胞增殖和轉化)是維持妊娠所必需的[29]。Wnt信號通路的功能最常見于胚胎發(fā)育和癌癥,也參與成年動物的正常生理過程[30-33]。早在1993年,就有研究發(fā)現(xiàn)Wnt的錯誤表達對囊胚滋養(yǎng)層細胞的體外分化有明顯影響,Wnt信號可以調節(jié)細胞間間隙連接的通透性,調節(jié)生長因子反應性及改變細胞黏附性[34]。目前已經有研究證明,Wnt信號對牛胎盤滋養(yǎng)層和囊胚的發(fā)育有重要影響[35-36]。不但如此,生殖系統(tǒng)的早期發(fā)育、卵巢的發(fā)育、動情周期、妊娠和乳腺發(fā)育都受到Wnt信號通路的調控與影響[37]。本研究中,KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)了81個顯著富集的通路,其中也包括Wnt信號通路(Wnt signaling pathway)、TGF-β信號通路(TGF-β signaling pathway),說明本試驗得到的血漿外泌體差異表達miRNA所富集的通路與妊娠維持有關。

        本研究發(fā)現(xiàn),供體牛顯著上調的4個miRNAs(bta-miR-339a、novel229_mature、novel305_mature、novel588_mature)參與了定位與黏附連接的生物過程。有研究表明,bta-miR-339a在奶牛懷孕4周和8周時的表達量與未懷孕的奶牛相比差異顯著,而12周后差異不顯著[29],bta-miR-339a在未懷孕與懷孕30 d奶牛的血液中的表達也存在顯著差異[15]。這些均提示bta-miR-339a在妊娠早期胚胎著床過程中發(fā)揮了重要作用。 novel229_mature、novel305_mature、novel588_mature為新預測的miRNA,與bta-miR-339a作用在相同的功能通路與信號通路上,間接表明這3個miRNAs同樣在胚胎著床中起到重要的調控作用。

        盡管本試驗選擇了體重相近、年齡相仿的供體牛和受體牛進行血漿外泌體miRNA差異表達分析,但仍不能排除個體經濟性狀上的差異對試驗結果造成的影響。差異miRNA的靶基因多富集在胚胎著床相關的功能和信號通路上,表明這些miRNA可能參與牛胚胎的著床。本試驗所篩選的4個miRNAs可考慮作為牛胚胎著床相關的候選基因進行深入研究,但其生物學功能及其對胚胎著床的具體調控機制仍需要進一步驗證。

        4 結 論

        本研究通過比較胚胎移植前供體牛和受體牛血漿外泌體miRNA的表達,獲得了22個顯著差異的miRNAs,GO功能富集分析和KEGG信號通路分析表明這些miRNA參與細胞定位和黏附連接有關的生物過程,說明血漿外泌體miRNA可能通過影響胚胎定位與細胞黏附調控胚胎著床而影響母牛妊娠,結果可為進一步探究外泌體miRNA對牛妊娠的調控機制提供理論參考。

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