翟亞瑩,施巧婷,楚秋霞,朱肖亭,滑留帥，張子敬，陳付英，祁興磊,王二耀，呂世杰

(1.河南省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調控重點實驗室，鄭州 450002；2.河南農業(yè)大學動物科技學院，鄭州 450008；3.泌陽縣畜牧技術服務中心，駐馬店 463700)

繁殖性狀是奶牛和肉牛產業(yè)中重要的經濟性狀，繁殖效率的高低顯著影響牛場的經濟效益。母牛屢配不孕導致的輸精次數增加、空懷時間加長和被動淘汰率升高等問題給牛產業(yè)帶來了嚴重的經濟損失。影響牛群受胎率的原因復雜，除了飼養(yǎng)管理外，與個體牛妊娠前后的體內環(huán)境變化也有關系，成功的妊娠不僅需要胚胎自身的正常發(fā)育，還需要有利于胚胎著床的子宮環(huán)境[1-2]。

近年來，關于外泌體的研究越來越多，由于絕大多數細胞均能分泌外泌體，并且其分泌量和內容物(核酸、蛋白質和脂質等)在正常及病理狀態(tài)下存在顯著差異，因此外泌體備受科研工作者關注[3-4]。外泌體是一種能被大多數細胞分泌的微小膜泡，是細胞間通訊的一種重要介質[5]。隨著外泌體研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)外泌體在哺乳動物妊娠過程中也發(fā)揮重要作用，如子宮液外泌體可以調控胚胎的發(fā)育和著床[6]。

對人而言，胎盤在懷孕6周就將外泌體釋放到母體循環(huán)中[7]。外泌體作為細胞間信息傳遞介質，將作用于母體的蛋白質、mRNA等生物成分釋放到母體循環(huán)后，被母體免疫和血管系統(tǒng)的細胞吸收，從而調節(jié)整個母體生理系統(tǒng)以適應妊娠引起的變化[8-11]。Ramkumar等[12]分析了人足月妊娠和早產的循環(huán)外泌體miRNA譜，并提出母體血液中循環(huán)外泌體miRNA含量可能代表妊娠進展的雙分子“指紋”。外泌體也具有調控牛妊娠的作用，如Zhao等[13]運用轉錄組測序(RNA-Seq)技術,對奶牛妊娠各階段的血漿外泌體miRNA進行分析，在奶牛妊娠的不同階段都檢測到了特異性的外泌體miRNA，妊娠30 d時外泌體通過bta-let-7和bta-miR-499等miRNA直接或間接靶向核因子κB(NF-κB)信號通路，調節(jié)子宮局部免疫微環(huán)境促炎/抗炎平衡[14]。另外，Kesavan等[15]對3頭正常未妊娠和妊娠30 d的健康奶牛的血液樣本進行miRNA的檢測與分析發(fā)現(xiàn)，與正常未妊娠相比，妊娠30 d時有29個miRNAs差異顯著。上述研究表明，血漿外泌體miRNA及血液miRNA對奶牛妊娠均具有一定的調控作用。母牛卵母細胞成功受精后第7天形成囊胚，并在子宮內處于游離狀態(tài)，此時子宮開始為胚胎著床做準備，探明此時供體牛與受體牛血漿外泌體miRNA差異表達譜對調控早期妊娠具有重要作用。本研究通過分析人工授精后第7天供體牛與受體牛的血漿外泌體miRNA表達差異情況，以期為研究血漿外泌體miRNA對牛早期妊娠的調控作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及處理

本研究以3～6歲、體重480～600 kg的夏南牛作為研究對象，選取10頭供體牛(G)進行同期發(fā)情、超數排卵和人工授精，23頭受體牛(S)只進行同期發(fā)情。在人工授精后第7天沖洗供體牛子宮，根據供體牛沖出的胚胎情況選取3頭胚胎數相近的供體牛用于后續(xù)研究。同時選取3頭與供體牛體重和年齡均相近的受體牛。頸靜脈采血，收集供體牛和受體牛血液并分離血漿，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 外泌體的分離與鑒定

將血漿樣品37 ℃解凍后，4 ℃、2 000×g離心30 min，收集上清液，4 ℃、12 000×g離心45 min，去除較大的囊泡。 收集上清液，用0.45 μm濾膜過濾，將濾液4 ℃、110 000×g離心70 min。去除上清液，用10 mL預冷的PBS重懸，4 ℃、110 000×g離心70 min。去除上清液，用50 μL預冷的PBS重懸，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｋ脴悠肪捎肸etaView S/N 17-310(Particle Metrix,Germany)進行納米顆粒跟蹤分析(NTA)檢測外泌體的粒徑。

1.3 miRNA的篩選與鑒定

提取血漿外泌體總RNA，構建并純化small RNA文庫，檢測質量合格后，使用高通量測序方法進行測序。 測序得到原始數據后去除接頭序列，進行Q20質控，然后去掉序列長度<15 nt、>41 nt的所有重復序列，得到clean reads。 使用bowtie軟件[16]將miRNA篩選出來，對過濾后的序列和miRBase數據庫進行比對，統(tǒng)計已知的miRNA。未注釋上miRBase數據庫的序列，進行新miRNA預測。 通過Benjamini & Hochberg多重檢驗校正的FDR(false discovery rate)值篩選出差異顯著的miRNA。

1.4 差異表達miRNA的的靶基因預測與分析

對已知miRNA和新預測miRNA進行表達量計算，采用TPM(transcript per million)值作為度量指標。使用R語言的DESeq數據包分析供體牛與受體牛的差異表達miRNA，以P<0.05和|log2FoldChange|>1作為差異表達閾值。使用miRanda軟件[17]對差異表達miRNA進行靶基因預測(S≥150,ΔG≤-125.6 kJ/mol)，并對靶基因進行GO功能富集分析和KEGG信號通路分析[18]。

2 結 果

2.1 血漿外泌體粒徑分析

納米顆粒跟蹤分析(NTA)的結果顯示，6個樣本的囊泡粒徑均在135 nm左右，符合外泌體的直徑特征(圖1)。

圖1 血漿外泌體粒徑

2.2 miRNA的鑒定分析

所有樣本比對上已知miRNA的總數為432，新預測miRNA的總數為451。其中有22個miRNAs顯著差異富集,通過Benjamini & Hochberg多重檢驗校正的FDR值,篩選出差異最顯著(FDR<0.05)的5個miRNAs分別為bta-miR-2431-5p、bta-miR-4657、novel492-mature、novel56-star和novel376_mature(表1)。受體牛與供體牛對比分析發(fā)現(xiàn)，受體牛中有9個miRNAs上調，13個miRNAs下調(圖2)。

表2 差異表達miRNA

①G，供體牛；S，受體牛

2.3 差異表達miRNA的GO功能富集分析和KEGG信號通路分析

22個差異表達的miRNAs中，有15個miRNAs預測到2 990個無重復靶基因，注釋到52個GO亞類中(level 2)，參與的生物學過程包括生物黏附(biological adhesion)、定位(localization)、定位的建立(establishment of localization)、生物調節(jié)(biological regulation)、刺激反應(response to stimulus)等；涉及的細胞成分為細胞器(organelles)、細胞連接(cell junction)和大分子配合物(macromolecular complexes)等；發(fā)揮的分子功能包括結合(binding)、催化活性(catalytic activity)、受體活性(receptor activity)、轉運活性(transporter activity)等(圖3)。其中生物黏附(biological adhesion)、定位(localization)和細胞連接(cell junction)等生物過程在胚胎著床中發(fā)揮著重要作用。

圖3 差異表達miRNA的GO功能富集分析

KEGG信號通路分析發(fā)現(xiàn)81個顯著富集信號通路，包括黏著斑(focal adhesion)、黏著連接(adherens junction)、催產素信號通路(oxytocin signaling pathway)、促性腺激素釋放激素(GnRH)信號通路(GnRH signaling pathway)、Wnt信號通路(Wnt signaling pathway)、吲哚生物堿的生物合成(biosynthesis of indole alkaloids)和轉化生長因子-β(TGF-β)信號通路(TGF-β signaling pathway)等(圖4)。

圖4 差異表達miRNA顯著富集的KEGG信號通路(前20)

綜合GO功能富集分析與KEGG信號通路分析，22個差異miRNAs中有10個miRNAs富集在與生物黏附(biological adhesion)、定位(localization)、細胞連接(cell junction)、黏著斑(focal adhesion)和黏著連接(adherens junction)有關的生物功能和信號通路上，分別是bta-miR-339a、novel229_mature、novel270_mature、novel305_mature、bta-miR-11971、novel475_mature、novel492_mature、novel588_mature、novel613_mature和bta-miR-199a-3p。其中bta-miR-339a、novel229_mature、novel305_mature和novel588_mature等4個miRNAs在供體牛中的表達量顯著上調，其靶基因富集在細胞定位和黏附連接的通路上。

3 討 論

胚胎著床是一個持續(xù)的動態(tài)過程，包括定位、黏附和侵入等著床事件，研究表明外泌體對胚胎著床具有重要影響[19]。目前關于人類的胚胎著床的研究較多，對胚胎反復著床失敗患者與有生育能力的婦女所分泌子宮液的miRNA進行差異表達分析，發(fā)現(xiàn)其差異表達miRNA同樣富集在黏著連接(adherens junction)、細胞黏附(cell adhesion)等信號通路上[20]。在胚胎準備著床時，人子宮內膜的黏附性會發(fā)生改變，為滋養(yǎng)層的成功植入做準備[21]。在胚胎準備著床時，倉鼠的子宮內膜上皮細胞的黏附蛋白也會發(fā)生變化，并且由于黏著連接(adherens junction)通路參與了細胞識別、黏附、建立細胞極性和通透性屏障的特性，對維持子宮結構的完整性、腔內環(huán)境的組成以及著床的開始都非常重要[22]。本研究表明，血漿外泌體中有22個差異表達的miRNAs，其中受體牛有9個miRNAs上調，13個miRNAs下調。GO功能富集分析表明，這些差異表達基因主要富集在生物黏附(biological adhesion)、定位(localization)、細胞連接(cell junction)等生物過程。將這些靶基因在KEGG數據庫中進一步注釋發(fā)現(xiàn)，差異表達miRNA在黏著斑(focal adhesion)、黏著連接(adherens junction)信號通路顯著富集，這些通路調控著許多與胚胎著床有關的蛋白[23-26]，進一步說明本研究得到的血漿外泌體差異表達miRNA所富集的通路與胚胎著床有關。

在TGF-β信號通路中發(fā)揮重要功能的TGF-β是一種抗炎細胞因子，研究表明，其可以促進羊膜上皮細胞的上皮-間質轉化，以維持胎膜穩(wěn)態(tài)[27]。在胎盤中，TGF-β1和胰島素樣生長因子結合蛋白3(IGFBP-3)可通過TGF-β受體信號影響人滋養(yǎng)層細胞的增殖[28]。對正常妊娠和分娩過程的外泌體miRNA的分析表明，TGF-β介導的組織穩(wěn)態(tài)(調節(jié)細胞增殖和轉化)是維持妊娠所必需的[29]。Wnt信號通路的功能最常見于胚胎發(fā)育和癌癥，也參與成年動物的正常生理過程[30-33]。早在1993年，就有研究發(fā)現(xiàn)Wnt的錯誤表達對囊胚滋養(yǎng)層細胞的體外分化有明顯影響，Wnt信號可以調節(jié)細胞間間隙連接的通透性，調節(jié)生長因子反應性及改變細胞黏附性[34]。目前已經有研究證明，Wnt信號對牛胎盤滋養(yǎng)層和囊胚的發(fā)育有重要影響[35-36]。不但如此，生殖系統(tǒng)的早期發(fā)育、卵巢的發(fā)育、動情周期、妊娠和乳腺發(fā)育都受到Wnt信號通路的調控與影響[37]。本研究中，KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)了81個顯著富集的通路，其中也包括Wnt信號通路(Wnt signaling pathway)、TGF-β信號通路(TGF-β signaling pathway)，說明本試驗得到的血漿外泌體差異表達miRNA所富集的通路與妊娠維持有關。

本研究發(fā)現(xiàn)，供體牛顯著上調的4個miRNAs(bta-miR-339a、novel229_mature、novel305_mature、novel588_mature)參與了定位與黏附連接的生物過程。有研究表明，bta-miR-339a在奶牛懷孕4周和8周時的表達量與未懷孕的奶牛相比差異顯著，而12周后差異不顯著[29]，bta-miR-339a在未懷孕與懷孕30 d奶牛的血液中的表達也存在顯著差異[15]。這些均提示bta-miR-339a在妊娠早期胚胎著床過程中發(fā)揮了重要作用。 novel229_mature、novel305_mature、novel588_mature為新預測的miRNA，與bta-miR-339a作用在相同的功能通路與信號通路上，間接表明這3個miRNAs同樣在胚胎著床中起到重要的調控作用。

盡管本試驗選擇了體重相近、年齡相仿的供體牛和受體牛進行血漿外泌體miRNA差異表達分析，但仍不能排除個體經濟性狀上的差異對試驗結果造成的影響。差異miRNA的靶基因多富集在胚胎著床相關的功能和信號通路上，表明這些miRNA可能參與牛胚胎的著床。本試驗所篩選的4個miRNAs可考慮作為牛胚胎著床相關的候選基因進行深入研究，但其生物學功能及其對胚胎著床的具體調控機制仍需要進一步驗證。

4 結 論

本研究通過比較胚胎移植前供體牛和受體牛血漿外泌體miRNA的表達，獲得了22個顯著差異的miRNAs，GO功能富集分析和KEGG信號通路分析表明這些miRNA參與細胞定位和黏附連接有關的生物過程，說明血漿外泌體miRNA可能通過影響胚胎定位與細胞黏附調控胚胎著床而影響母牛妊娠，結果可為進一步探究外泌體miRNA對牛妊娠的調控機制提供理論參考。