余親平，黃靜宇，張翠萍，劉 靜，黃遠(yuǎn)彬，俞 婷，張曉愛，王 蕾，陳進(jìn)勝，陳文卿，王志林，陳 莊，容 庭

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物基因研究中心，廣東省農(nóng)作物種質(zhì)資源保存與利用重點實驗室，廣州 510640；2.廣州智特奇生物科技股份有限公司，廣州 510700；3.廣東海大集團，廣州 511400；4.廣東蟲蟲生物科技有限公司，廣州 511462；5.饒平縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所，潮州 515700；6.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所，畜禽育種國家重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，廣東省動物育種與營養(yǎng)公共實驗室，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室，廣州 510640)

大麥蟲屬于鞘翅目擬步甲族昆蟲[1]，是中國近年從東南亞國家引進(jìn)的資源型昆蟲。大麥蟲含有抗菌肽、有機酸等化合物，在抗菌消炎、改善免疫系統(tǒng)機能等生物活性方面有著巨大的潛在價值，有待深入開發(fā)利用。研究表明，病原真菌白僵菌感染大麥蟲后，表達(dá)具有抗真菌活性的肽——Tenecin 3，可激發(fā)自身防御機能[2]。Benzertiha等[3]研究發(fā)現(xiàn)，大麥蟲幼蟲粉能顯著提高肉雞免疫力，同時有效降低沙門氏菌和大腸桿菌感染。Islam等[4]用腸炎沙門氏菌KCTC2021和大腸桿菌KCTC2571的混合物攻毒試驗也進(jìn)一步證明，攻毒后，在飼糧中添加0.4%大麥蟲干蟲粉或0.4%大麥蟲發(fā)酵蟲粉，發(fā)現(xiàn)大麥蟲干蟲粉和大麥蟲發(fā)酵蟲粉均可提高肉雞的平均日增重(ADG)、免疫球蛋白G(IgG)和IgA水平。大麥蟲營養(yǎng)豐富，可作為動物脂肪和高蛋白源飼料[5-6]，改善動物生長性能、養(yǎng)分消化吸收、抗氧化功能和機體健康。Sankian等[7]用大麥蟲粉部分替代飼糧中魚粉，可顯著降低斑鱖魚血漿總膽固醇含量，顯著提高血清溶菌酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性，對機體健康有一定的促進(jìn)作用。同樣，在飼糧中用大麥蟲油全部替代豆油，對肉雞養(yǎng)分消化率無不利影響[8]。大麥蟲能夠改善斷奶仔豬的生長性能和營養(yǎng)物質(zhì)消化，可作為斷奶仔豬飼糧中魚粉的替代蛋白質(zhì)來源[9]。 在肉雞飼糧中添加少量(0.2%、0.3%)黃粉蟲和大麥蟲粉作為蛋白質(zhì)來源，也起到提高肉雞生長性能的作用[3]。但國內(nèi)外對有關(guān)大麥蟲粉作為黃羽肉雞的一種蛋白質(zhì)需求，尤其是飼糧中添加大麥蟲粉對黃羽肉雞生長性能、腸道結(jié)構(gòu)和菌群組成的影響鮮見報道。因此，本試驗擬通過研究大麥蟲粉對黃羽肉雞生長性能、腸道結(jié)構(gòu)和菌群組成的影響，以期為在黃羽肉雞生產(chǎn)中應(yīng)用大麥蟲提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及儀器 大麥蟲粉購自廣東蟲蟲生物科技有限公司，其常規(guī)營養(yǎng)成分及抑菌活性見表1；MH肉湯與瓊脂培養(yǎng)基均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；QIAGEN DAN提取試劑盒購自上海拜力生物科技有限公司。高壓滅菌鍋(HVE-50)購自Hirayama公司；低溫冷凍離心機(Rotina 420R)購自Hettich公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RV10 Basic)購自上海鷹迪儀器設(shè)備有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9052)購自上海申賢恒溫設(shè)備廠；熒光正置顯微鏡(YKY-700)購自上海永科光學(xué)儀器有限公司；NanoDrop 2000分光光度計購自Thermo Fisher Scientific公司。

表1 大麥蟲粉營養(yǎng)成分(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.1.2 試驗動物與分組 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院基因中心微生物研究室前期試驗結(jié)果表明大麥蟲粉脂類提取物具有明顯抑菌作用(表2)。鑒于此，本研究進(jìn)行后續(xù)的大麥蟲粉對黃羽肉雞生產(chǎn)性能、腸道結(jié)構(gòu)和菌群組成影響的試驗研究。選用初始體重為(30.03±0.23) g的1日齡健康黃羽肉雞216只，隨機分成對照組、1%大麥蟲粉組、3%大麥蟲粉組3個處理組，分別飼喂基礎(chǔ)飼糧、基礎(chǔ)飼糧+1%大麥蟲粉及基礎(chǔ)飼糧+3%大麥蟲粉3種飼糧。每組6個重復(fù)，每個重復(fù)12只。各組飼糧營養(yǎng)水平相同。試驗期為63 d。

表2 大麥蟲粉抑菌活性

1.2 試驗飼糧與飼養(yǎng)管理

根據(jù)《中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 33-2004.雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》設(shè)計黃羽肉雞飼糧配方和營養(yǎng)水平(表3～5)。試驗前做好雞舍衛(wèi)生和消毒工作，試驗雞自由采食和飲水，按常規(guī)免疫程序免疫。

表3 1～21日齡黃羽肉雞飼糧組成與營養(yǎng)水平

表5 43～63日齡黃羽肉雞飼糧組成與營養(yǎng)水平

續(xù)表

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 生長性能、各腸段長度測量 分別在21、42和63日齡統(tǒng)計試驗雞的體重和耗料量，計算平均日增重、平均日采食量、料重比；稱重后每個重復(fù)選取1只雞屠宰采集十二指腸、空腸、回腸、盲腸腸段，并在冰上擺直，用皮尺測量各腸段長度。

平均日增重(g/d)=(試驗?zāi)┢骄w重-試驗初平均初重)/試驗天數(shù)

平均日采食量(g/d)=總采食量/(試驗雞數(shù)×試驗天數(shù))

料重比=總耗料量/總增重量

死淘率(%)=(期初雞數(shù)-期末雞數(shù))/初始雞數(shù)×100%

1.3.2 腸道黏膜形態(tài)分析 63日齡時，每重復(fù)中挑選1只雞進(jìn)行屠宰。取十二指腸近端5 cm處、空腸中段和回腸中段約1 cm，用PBS輕輕漂洗腸道內(nèi)容物后，先在4%多聚甲醛溶液中固定24 h，然后用70%乙醇室溫下保存。將固定好的腸道樣品經(jīng)水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋等處理后，在室溫下切成約6 μm厚的切片，蘇木精-伊紅染色。中性樹脂封片，樹脂凝固后，將載玻片裝盒。在熒光正置顯微鏡下觀察切片，每個腸段選取6個視野，測量視野中絨毛高度及隱窩深度，并計算絨毛高度/隱窩深度的比值。

1.3.3 腸道微生物16S rDNA測序分析 63日齡時采集黃羽肉雞回腸中段內(nèi)容物和盲腸內(nèi)容物用于腸道微生物16S rDNA測序分析。高通量測序部分委托天津諾禾致源科技股份有限公司完成，具體操作方法如下：①采取QIAGEN微生物DNA提取試劑盒抽提內(nèi)容物中的微生物DNA，用NanoDrop 2000分光光度計檢測DNA的濃度，并調(diào)整DNA模板濃度及純度至D260 nm/D280 nm=1.8～2.0，用于制備DNA文庫；②DNA文庫制備：根據(jù)所擴增的16S區(qū)域特點，構(gòu)建小片段文庫，采用PCR擴增一步法進(jìn)行建庫，擴增16S rDNA基因的V4區(qū)域，V4擴增引物520F/802R，引物用PAGE方法純化；③基于Illumina NovaSeq 測序平臺對該文庫進(jìn)行雙末端測序(Paired_End)；④測序得到的原始數(shù)據(jù)(Raw Data)，存在一定比例的干擾數(shù)據(jù)(Dirty Data)，為使信息分析的結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠，首先對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行Reads拼接過濾得到有效數(shù)據(jù)(Clean Data)，然后基于有效數(shù)據(jù)進(jìn)行OTUs(operational taxonomic units)聚類進(jìn)行物種注釋，采用BugBase軟件中Alpha多樣性和Beta多樣性分析進(jìn)行菌群組成差異及豐度分析，根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取每個樣本或分組在各分類水平上相對豐度較高的物種及其比例。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One Way-ANOVA)，采用Tukey’s法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 添加大麥蟲粉對黃羽肉雞生產(chǎn)性能的影響

2.1.1 添加大麥蟲粉對1～21日齡黃羽肉雞生產(chǎn)性能的影響 由表6可知，與對照組相比，1%和3%大麥蟲粉組平均日增重、21日齡體重、平均日采食量、料重比和死淘率無明顯變化。

表6 1～21日齡黃羽肉雞生產(chǎn)性能

2.1.2 添加大麥蟲粉對22～42日齡黃羽肉雞生產(chǎn)性能的影響 由表7可知，與對照組相比，1%和3%大麥蟲粉組平均日增重和42日齡體重均顯著增加(P<0.05)，料重比顯著降低(P<0.05)；平均日采食量和死淘率均無顯著差異(P>0.05)。

表7 22～42日齡黃羽肉雞生產(chǎn)性能

2.1.3 添加大麥蟲粉對43～63日齡黃羽肉雞生產(chǎn)性能的影響 由表8可知，與對照組相比，1%大麥蟲粉組63日齡體重顯著增加(P<0.05)，3%大麥蟲粉組63日齡體重增加，但差異不顯著(P>0.05)，比對照組分別增加5.11%和3.13%；3%大麥蟲粉組平均日采食量顯著降低(P<0.05)；平均日增重和料重比均無顯著差異(P>0.05)。3組43～63日齡的死淘率均為0。

表8 43～63日齡黃羽肉雞生產(chǎn)性能

2.2 中添加大麥蟲粉對黃羽肉雞消化道長度的影響

由表9可知，與對照組相比，21日齡時，1%和3%大麥蟲粉組盲腸長度均顯著增加(P<0.05)；其他指標(biāo)均差異不顯著(P>0.05)。42日齡時，3%大麥蟲粉組十二指腸長度顯著增加(P<0.05)，其他指標(biāo)差異不顯著(P>0.05)。63日齡時，各處理組十二指腸、空腸、回腸和盲腸長度差異均不顯著(P>0.05)。

表9 21～63日齡黃羽肉雞腸道長度

2.3 添加大麥蟲粉對黃羽肉雞腸道絨毛高度和隱窩深度的影響

由表10可知，63日齡時，對照組和1%大麥蟲組十二指腸、空腸和回腸的絨毛高度、隱窩深度和絨隱比差異均不顯著(P>0.05)。

表10 63日齡黃羽肉雞腸道絨毛高度與隱窩深度

2.4 大麥蟲粉對黃羽肉雞腸道菌群組成的影響

由表11可知，63日齡時，1%大麥蟲粉組回腸優(yōu)勢菌屬是乳桿菌屬、羅氏桿菌屬和擬桿菌屬；1%大麥蟲粉組盲腸優(yōu)勢菌屬依次是擬桿菌屬、Alistipes屬和乳桿菌屬。與對照組相比，1%大麥蟲粉組回腸中乳桿菌屬、擬桿菌屬和Alistipes屬比例上升，羅氏桿菌屬下降；1%大麥蟲粉組盲腸中擬桿菌屬和Alistipes屬比例上升，乳桿菌屬和羅氏桿菌屬下降。

表11 黃羽肉雞腸道菌群組成

3 討 論

3.1 添加大麥蟲粉對黃羽肉雞生產(chǎn)性能的影響

據(jù)報道，目前世界上可用作動物飼料的昆蟲有500多種。飼料中添加昆蟲粉對肉雞能產(chǎn)生積極的影響。利用超臨界CO2萃取獲得的黃粉蟲油和大麥蟲油可以完全替代肉雞飼糧中的大豆油，對肉雞的生長性能和消化率無不利影響[10]。研究表明，用大麥蟲粉替代肉雞飼糧中的豆粕可增加平均日增重，提高飼料轉(zhuǎn)化率[3,10]。大麥蟲粉代替飼糧中25%和50%的豆粕可提高鷓鴣60日齡時的體重[11]。Piccolo等[12]用大麥蟲粉代替鯛魚中的魚粉，飼糧中大麥蟲粉的含量達(dá)25%時，對鯛魚體重增加、粗蛋白質(zhì)消化率沒有負(fù)面影響，相反，當(dāng)飼糧中大麥蟲粉的含量為50%時，對鯛魚營養(yǎng)物質(zhì)的消化率有負(fù)面影響。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，1%大麥蟲粉和3%大麥蟲粉都提高黃羽肉雞體重，比對照組分別增加5.11%和3.13%,其中1%大麥蟲組試末均重顯著高于對照組。Benzertiha等[10]在肉雞飼糧中添加各比例的大麥蟲全脂粉，可顯著提高試末均重，其中0.3%大麥蟲全脂粉組的體重比對照組增加7.11%。本試驗結(jié)果與以上研究一致，說明添加適量大麥蟲粉可以提高黃羽肉雞的生產(chǎn)性能。

3.2 添加大麥蟲粉對黃羽肉雞腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

Loponte等[11]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加大麥蟲增加腸道總長度和盲腸長度。本研究結(jié)果表明，飼糧中添加大麥蟲粉顯著增加黃羽母雞盲腸和十二指腸長度。絨毛高度與隱窩深度反映小腸消化吸收能力，絨毛越高，隱窩越淺，小腸對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力就越好[13]。絨毛越高，腸道與營養(yǎng)物質(zhì)的接觸面積變大，有利于對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收；隱窩深度代表了腸上皮細(xì)胞的分裂速度，隱窩變淺，表明細(xì)胞的成熟率上升，分泌功能增強[14]。Biasato等[15]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加大麥蟲粉對肉公雞腸道形態(tài)和組織學(xué)結(jié)構(gòu)沒有顯著影響。Biasato等[16]也發(fā)現(xiàn)飼糧中添加大麥蟲粉對白羽肉母雞(Ross 708)腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)無影響，與添加50 g/kg大麥蟲粉組相比，150 g/kg大麥蟲粉組絨毛高度顯著降低，隱窩深度顯著升高，絨毛高度/隱窩深度顯著降低，對飼料轉(zhuǎn)化效率和腸道形態(tài)產(chǎn)生負(fù)面影響，因此，低水平添加量可能更合適。本試驗結(jié)果顯示，飼糧中添加大麥蟲粉對63日齡黃羽肉雞小腸絨毛高度和隱窩深度的影響差異均不顯著,與前人研究報道的結(jié)果一致[16]。Zadeh等[17]用大麥蟲幼蟲粉替代日本鵪鶉飼糧中的魚粉和大豆油，結(jié)果表明大麥蟲幼蟲粉顯著增加絨毛高度和隱窩深度，這可能與動物品種不同有關(guān)。

3.3 大麥蟲粉對黃羽肉雞腸道菌群組成的影響

動物腸道中擁有豐富多樣的微生物，對動物的健康和生產(chǎn)中起重要作用。動物腸道微生物多樣性及豐度受環(huán)境、飼糧、疾病、抗生素等影響。肉雞(Ross 308公雞)飼糧中添加大麥蟲粉顯著降低盲腸大腸桿菌和沙門氏菌含量，而糞便微生物群含量和盲腸和糞便消化液的pH未受影響[8]。盲腸微生物菌群評估顯示，飼喂蟲粉飼糧的肉雞盲腸微生物Beta多樣性發(fā)生了變化，蟲粉添加量為15%時對肉雞的盲腸微生物群產(chǎn)生負(fù)面影響[18]。作為蛋白質(zhì)替代品，被機體消化后的大麥蟲粉對腸道微生物菌群有積極的影響，通過增加和/或維持促進(jìn)菌群的健康以及揮發(fā)性脂肪酸的產(chǎn)生(于試驗48 h時，產(chǎn)生的乙酸和丙酸分別是陰性對照的1.7和2.6倍)[19]。用大麥蟲粉代替飼糧中魚粉后導(dǎo)致腸道細(xì)菌群落發(fā)生變化：Simpson優(yōu)勢度D指數(shù)增加了5倍，Shannon指數(shù)下降了近2倍，導(dǎo)致菌群S.aurata(占其所有OTU的62.2%)、D.labrax(占其所有OTU的60.0%)和O.mykiss(占其所有OTU的33.0%)比例增加[20]。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，1%大麥蟲粉組回腸中乳桿菌屬、擬桿菌屬和Alistipes屬比例上升，羅氏桿菌屬下降；1%大麥蟲粉組盲腸中擬桿菌屬和Alistipes屬比例上升，乳桿菌屬和羅氏桿菌屬下降，說明大麥蟲粉對回腸和盲腸腸道菌群都具有調(diào)節(jié)作用。

4 結(jié) 論

在飼料中添加1%大麥蟲粉能夠提高黃羽肉雞的生產(chǎn)性能。肉雞飼糧中添加1%大麥蟲粉增加腸道長度和調(diào)節(jié)腸道菌群組成，有利于消化道發(fā)育。