劉新勇，譚正準(zhǔn)，李 輝，黃 健，羅 華，曾令湖，程雋如，鐘華配，楊春艷，王曉麗，覃廣勝

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530005；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西壯族自治區(qū)水牛研究所，南寧 530001)

水牛可分為河流型和沼澤型兩種類(lèi)型，中國(guó)的本土水牛主要是作為役用的沼澤型水牛，摩拉和尼里-拉菲水牛則是從國(guó)外引進(jìn)的產(chǎn)奶性能優(yōu)良的河流型水牛，目前在南方地區(qū)以提高生產(chǎn)性能為目標(biāo)開(kāi)展了與本地水牛的雜交改良，對(duì)新形勢(shì)下南方奶業(yè)和現(xiàn)代牧業(yè)的發(fā)展具有重要意義。氣候變化能對(duì)動(dòng)物生理產(chǎn)生不利影響，導(dǎo)致生產(chǎn)和繁殖效率整體下降并造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，以及引起動(dòng)物健康和福利等問(wèn)題[1]。熱應(yīng)激是指當(dāng)動(dòng)物產(chǎn)生的熱負(fù)荷超出其散熱能力時(shí)機(jī)體所做出非特異性反應(yīng)的總和。夏季熱應(yīng)激能引起水牛生理功能的一系列變化，包括采食量下降、激素分泌變化，呼吸頻率、脈搏率、直腸溫度升高及出汗、氧化應(yīng)激增加等。由于水牛汗腺稀少，體表毛發(fā)稀疏，皮膚較厚且是黑色，容易吸收熱量，所以當(dāng)水牛暴露在炎熱的環(huán)境條件下時(shí)更易受到熱應(yīng)激影響[2]。目前普遍認(rèn)為水牛在生理上對(duì)熱應(yīng)激的適應(yīng)性不如奶牛[3]。Lakhani等[4]和Li等[5]對(duì)不同季節(jié)摩拉和尼里-拉菲水牛生理反應(yīng)和代謝相關(guān)激素以及氧化狀態(tài)進(jìn)行了研究，證實(shí)了熱應(yīng)激會(huì)對(duì)水牛生理產(chǎn)生不利影響。本研究旨在探討夏季熱應(yīng)激和秋季非應(yīng)激條件下摩拉和尼里-拉菲水牛血液生化指標(biāo)的變化，通過(guò)測(cè)定能夠反映機(jī)體健康狀況、內(nèi)分泌系統(tǒng)功能、抗氧化功能、正常生理代謝的生化指標(biāo)，對(duì)比兩種水牛熱應(yīng)激時(shí)體內(nèi)物質(zhì)代謝和某些組織器官機(jī)能狀態(tài)變化及其耐熱性能，為夏季水牛熱應(yīng)激的相關(guān)研究提供數(shù)據(jù)支持和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在廣西水牛研究所水牛種畜場(chǎng)進(jìn)行。選擇體況相近、體重275～300 kg、4～5歲、飼養(yǎng)管理一致的摩拉和尼里-拉菲母水牛各11 頭。試驗(yàn)期分為熱應(yīng)激期(2020年7月)和非應(yīng)激期(2020年11月)兩個(gè)階段，試驗(yàn)期和非試驗(yàn)期(2020年8月-2020年10月)試驗(yàn)牛均在同一牛欄飼養(yǎng)，牛欄有運(yùn)動(dòng)場(chǎng)和遮陽(yáng)棚且通風(fēng)良好，試驗(yàn)?？梢宰杂苫顒?dòng)且自由采食充足的飼料和飲水。飼糧營(yíng)養(yǎng)水平參照廣西水牛研究所水牛種畜場(chǎng)飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，飼糧主要由象草、玉米秸稈、啤酒糟、精料補(bǔ)充料等組成，試驗(yàn)期和非試驗(yàn)期均保持一致。

1.2 牛舍環(huán)境的溫濕指數(shù)測(cè)定

采用在線揚(yáng)塵監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(深圳市格林福澤環(huán)境科技有限公司)實(shí)時(shí)記錄牛舍環(huán)境數(shù)據(jù)，將8個(gè)探頭安裝于牛舍墻壁，高度與動(dòng)物背部接近，每1 h收集1次牛舍的溫度(T，℃)和相對(duì)濕度(RH，%)數(shù)據(jù)。保證探頭周?chē)行L(fēng)，防止陽(yáng)光照射和雨淋，并避免牛觸及。利用牛舍的溫度和相對(duì)濕度計(jì)算牛舍環(huán)境溫濕指數(shù)(THI)，THI=0.81×T+(0.99×T-14.3)×RH+46.3。以THI作為水牛熱應(yīng)激程度的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)THI≤72為無(wú)熱應(yīng)激；7288為重度熱應(yīng)激[6]。

1.3 血樣采集及測(cè)定指標(biāo)

每頭試驗(yàn)牛采血4次，每次間隔1周。采血當(dāng)天09:00(飼喂前)通過(guò)頸靜脈采血10 mL，室溫靜置2 h,待血液凝固后3 000 r/min離心10 min，分離血清分裝到EP管中，于-80 ℃保存待測(cè)。

一部分血清樣品送廣西國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院應(yīng)用日立7020全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)，試劑盒由上海朗頓生物科技有限公司提供,測(cè)定指標(biāo)包括：總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLOB)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶(GGT)、總膽固醇(CHOL)、尿素氮(BUN)、甘油三酯(TG)、葡萄糖(GLU)、三碘甲腺原氨酸(T3)、四碘甲腺原氨酸(T4)、鉀(K+)、鈉(Na+)、氯(Cl-)和鈣(Ca2+)離子含量/活性;另一部分血清樣品送江蘇晶美生物科技有限公司采用酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)檢測(cè)，試劑盒由江蘇晶美生物科技有限公司提供,測(cè)定指標(biāo)包括：胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-1)、牛皮質(zhì)醇(CORT)、牛瘦素(LEP)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、熱休克蛋白70(HSP70)和熱休克蛋白90(HSP90)的含量/活性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016初步整理后采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，以P<0.05表示差異顯著。試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié) 果

2.1 牛舍環(huán)境溫濕指數(shù)

由表1可知，熱應(yīng)激期牛舍溫度為31.60 ℃，相對(duì)濕度為80.13%，THI為85.25，水牛處于中度熱應(yīng)激；非應(yīng)激期牛舍溫度為21.11 ℃，相對(duì)濕度為88.18%，THI為69.10，水牛處于非應(yīng)激狀態(tài)。

表1 牛舍溫濕指數(shù)測(cè)定結(jié)果

2.2 熱應(yīng)激期和非應(yīng)激期的水牛部分血清生化指標(biāo)比較

由表2可知，摩拉水牛熱應(yīng)激期的CHOL含量顯著高于非應(yīng)激期(P<0.05)，ALT和AST活性均顯著低于非應(yīng)激期(P<0.05)；尼里-拉菲水牛熱應(yīng)激期的ALB、CHOL、GGT含量均顯著高于非應(yīng)激期(P<0.05)，GLOB含量顯著低于非應(yīng)激期(P<0.05)。熱應(yīng)激期摩拉水牛的ALT活性及TP、GLOB、CHOL、BUN、TG含量均顯著高于尼里-拉菲水牛(P<0.05)，ALB含量顯著低于尼里-拉菲水牛(P<0.05)；非應(yīng)激期摩拉水牛的ALT活性及BUN、TG、GLU含量均顯著高于尼里-拉菲水牛(P<0.05)。其余生化指標(biāo)在不同品種以及不同時(shí)期差異均不顯著(P>0.05)。

表2 水牛部分血清生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

2.3 熱應(yīng)激期和非應(yīng)激期的水牛血清激素含量比較

由表3可知，摩拉和尼里-拉菲水牛熱應(yīng)激期的IGF-1、CORT、LEP含量均顯著低于非應(yīng)激期(P<0.05)；尼里-拉菲水牛熱應(yīng)激期的T3、T4含量均顯著高于非應(yīng)激期(P<0.05)，T4含量顯著高于熱應(yīng)激期摩拉水牛(P<0.05)；其余激素指標(biāo)在不同品種以及不同時(shí)期差異均不顯著(P>0.05)。

表3 水牛血清激素含量測(cè)定結(jié)果

相同指標(biāo)，同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同大寫(xiě)字母表示兩個(gè)時(shí)期間差異顯著(P<0.05)，同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示兩個(gè)品種間差異顯著(P<0.05)，肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同

For the same index，in the same row，values with different capital letter superscripts mean significant difference between two periods (P<0.05),in the same column，values with different small letter superscripts mean significant difference between two breeds (P<0.05)；While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).The same as below

2.4 熱應(yīng)激期和非應(yīng)激期的水牛血清抗氧化指標(biāo)比較

由表4可知，摩拉和尼里-拉菲水牛熱應(yīng)激期的GSH-Px活性及T-AOC均顯著低于非應(yīng)激期(P<0.05)，MDA和HSP70含量均顯著高于非應(yīng)激期(P<0.05)；摩拉水牛熱應(yīng)激期的SOD活性顯著高于非應(yīng)激期(P<0.05)；其余抗氧化指標(biāo)在不同品種以及不同時(shí)期差異均不顯著(P>0.05)。

表4 水牛血清抗氧化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

2.5 熱應(yīng)激期和非應(yīng)激期的水牛血清離子含量比較

由表5可知，摩拉和尼里-拉菲水牛熱應(yīng)激期血清K+含量均顯著高于非應(yīng)激期(P<0.05)，Ca2+含量均顯著低于非應(yīng)激期(P<0.05)；摩拉水牛熱應(yīng)激期的Na+和Cl-含量均顯著高于非應(yīng)激期(P<0.05)；熱應(yīng)激期摩拉水牛的K+含量顯著低于尼里-拉菲水牛(P<0.05)；其余離子含量在不同品種以及不同時(shí)期差異均不顯著(P>0.05)。

表5 水牛血清離子含量測(cè)定結(jié)果

3 討 論

3.1 熱應(yīng)激對(duì)水牛部分血清生化指標(biāo)的影響

血清生化指標(biāo)可以反映動(dòng)物機(jī)體健康狀況、適應(yīng)性及生產(chǎn)性能，可作為量化評(píng)判個(gè)體或群體健康狀況的指標(biāo)[7]。血清 TP主要包括ALB和GLOB，BUN是蛋白質(zhì)的代謝產(chǎn)物，蛋白質(zhì)代謝良好時(shí)TP、ALB和BUN含量較低，而GLOB一定程度上可反映機(jī)體免疫力狀況[8]。本研究中，熱應(yīng)激期尼里-拉菲水牛血清ALB含量顯著高于其非應(yīng)激期，也高于熱應(yīng)激期摩拉水牛，而GLOB含量則相反，但兩種水牛在兩個(gè)時(shí)期的TP和BUN含量均無(wú)顯著差異。說(shuō)明熱應(yīng)激對(duì)尼里-拉菲水牛的免疫水平造成了一定影響，但熱應(yīng)激期摩拉和尼里-拉菲水牛的蛋白質(zhì)代謝狀況均良好。

ALT、AST和GGT活性均可反映動(dòng)物機(jī)體肝功能狀況，當(dāng)肝臟受損時(shí)，血清中ALT、AST和GGT濃度會(huì)升高[9]，且有研究表明GGT在反芻動(dòng)物中可作為評(píng)價(jià)肝功能損傷的敏感指標(biāo)[10]。CHOL可反映肝臟的類(lèi)脂質(zhì)代謝功能情況，在肝細(xì)胞嚴(yán)重受損時(shí)，血清中CHOL濃度顯著下降。本研究中，除ALT活性高于默克獸醫(yī)手冊(cè)[11]正常范圍(6.9～35.3 U/L)外，其他生化指標(biāo)含量均在水牛正常范圍以內(nèi)，但熱應(yīng)激期摩拉和尼里-拉菲水牛的CHOL含量均顯著高于非應(yīng)激期。說(shuō)明熱應(yīng)激雖未對(duì)摩拉和尼里-拉菲水牛的肝臟造成不良影響，但對(duì)兩種水牛的類(lèi)脂質(zhì)代謝功能造成了一定影響。宋小珍等[9]研究發(fā)現(xiàn)，錦江黃牛熱應(yīng)激期和非熱應(yīng)激期的CHOL濃度不存在顯著差異，與本研究結(jié)果不一致，可能是黃牛對(duì)熱應(yīng)激的耐受力更高，其類(lèi)脂質(zhì)代謝功能未受到影響?？紤]到膽固醇可作為甾體激素合成的原料，未來(lái)可結(jié)合熱應(yīng)激對(duì)水牛生殖激素影響的研究來(lái)進(jìn)一步探究CHOL能否作為水牛熱應(yīng)激敏感指標(biāo)。

TG是血脂的主要成分，主要功能是供給與儲(chǔ)存能量。本研究中尼里-拉菲水牛在兩個(gè)時(shí)期的BUN和TG含量均顯著低于摩拉水牛。由于試驗(yàn)牛均處于同一飼養(yǎng)條件，可能是摩拉和尼里-拉菲水牛對(duì)不同營(yíng)養(yǎng)成分的吸收代謝有一定差異導(dǎo)致的，也可能與尼里-拉菲水牛乳脂率(6.3%)低于摩拉水牛(7.6%)有關(guān)，摩拉和尼里-拉菲水牛營(yíng)養(yǎng)代謝方面的對(duì)比還需進(jìn)一步研究。

3.2 熱應(yīng)激對(duì)水牛血清激素含量的影響

IGF-1是一種在肝臟中產(chǎn)生的內(nèi)分泌激素，能促進(jìn)骨骼、肌肉和內(nèi)臟器官的生長(zhǎng)[12]。CORT是腎上腺皮質(zhì)合成分泌的一種類(lèi)固醇激素，具有動(dòng)員能源，促進(jìn)脂類(lèi)、蛋白質(zhì)分解和糖異生作用[13]。LEP是主要由白色脂肪組織合成和分泌的蛋白質(zhì)類(lèi)激素，能作用于下丘腦的代謝調(diào)節(jié)中樞，發(fā)揮抑制食欲、減少能量攝取、增加能量消耗、抑制脂肪合成的作用[14]。本研究中摩拉和尼里-拉菲水牛在熱應(yīng)激期血清IGF-1、CORT和LEP含量均顯著低于非應(yīng)激期，說(shuō)明熱應(yīng)激對(duì)水牛內(nèi)分泌系統(tǒng)造成一定影響，機(jī)體內(nèi)分泌系統(tǒng)通過(guò)自身調(diào)節(jié)降低了物質(zhì)與能量代謝以提高機(jī)體對(duì)熱應(yīng)激的適應(yīng)能力。研究表明，西門(mén)塔爾牛熱應(yīng)激期的IGF-1濃度顯著下降[15]，與本研究結(jié)果一致。而廖迎新等[16]研究發(fā)現(xiàn)，荷斯坦奶牛熱應(yīng)激期的CORT濃度顯著上升，可能是品種不同導(dǎo)致的。有關(guān)熱應(yīng)激水牛血液IGF-1、CORT、LEP水平的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，這3個(gè)指標(biāo)能否作為反映水牛熱應(yīng)激的敏感指標(biāo)還需進(jìn)一步的研究。

T3和T4能夠加速脂肪和糖的代謝，從而增加機(jī)體的產(chǎn)熱量。甲狀腺激素的合成和分泌受垂體分泌的促甲狀腺激素(TSH)的控制，其分泌過(guò)程與大腦皮層接受外界冷熱刺激有關(guān)。研究表明，熱應(yīng)激可對(duì)下丘腦-垂體-甲狀腺軸產(chǎn)生影響，使甲狀腺濾泡縮小并減少T3和T4分泌，進(jìn)而降低代謝率和減少產(chǎn)熱，以增加機(jī)體對(duì)炎熱環(huán)境的適應(yīng)[17]。但Mayahi等[18]研究發(fā)現(xiàn)，水牛在夏季血清T4含量更高。而Dixit等[19]研究表明，摩拉水牛T3和T4濃度及其比率在不同季節(jié)并沒(méi)有顯著差異。本研究結(jié)果表明摩拉水牛T3和T4濃度在兩個(gè)時(shí)期沒(méi)有顯著差異，而尼里-拉菲水牛熱應(yīng)激期的T3和T4濃度顯著高于非應(yīng)激期，說(shuō)明熱應(yīng)激期摩拉和尼里-拉菲水牛均具有良好的甲狀腺功能和抗熱應(yīng)激能力，但尼里-拉菲水牛的代謝和體溫調(diào)節(jié)能力更強(qiáng)。

3.3 熱應(yīng)激對(duì)水牛血清抗氧化指標(biāo)的影響

動(dòng)物機(jī)體在正常情況下抗氧化能力與不斷產(chǎn)生氧自由基的氧化能力之間保持著動(dòng)態(tài)平衡，不會(huì)造成組織損傷。但當(dāng)動(dòng)物受到熱應(yīng)激影響時(shí)，自由基生成異常增多導(dǎo)致組織氧化損傷，并影響機(jī)體內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定。動(dòng)物機(jī)體自身具有廣泛的抗氧化防御機(jī)制，體內(nèi)的抗氧化劑和抗氧化酶(如GSH-Px、SOD)都能清除脂質(zhì)過(guò)氧化物及過(guò)氧化物中的醛類(lèi)化合物(如MDA)，從而降低組織的損傷程度。研究表明，熱應(yīng)激期牛血清GSH-Px、SOD活性和T-AOC均顯著低于非應(yīng)激期，而血清MDA含量顯著上升[5,15]，說(shuō)明機(jī)體抗氧化能力減弱，抗氧化防御系統(tǒng)無(wú)法對(duì)抗過(guò)量的活性氧(ROS)負(fù)荷。本研究中摩拉和尼里-拉菲水牛在熱應(yīng)激期的GSH-Px和T-AOC活性均顯著低于非應(yīng)激期，MDA含量顯著高于非應(yīng)激期。但摩拉水牛熱應(yīng)激期的SOD活性顯著高于非應(yīng)激期，GSH-Px活性和T-AOC高于熱應(yīng)激期尼里-拉菲水牛。說(shuō)明熱應(yīng)激對(duì)摩拉和尼里-拉菲水牛的抗氧化能力均造成一定影響，GSH-Px活性、T-AOC及MDA含量發(fā)生了顯著的變化，但摩拉水牛比尼里-拉菲水牛具有更強(qiáng)的清除自由基能力。

HSP是反映動(dòng)物舒適度和氣候適應(yīng)性的重要壓力標(biāo)志，是一類(lèi)具有分子伴侶活性的應(yīng)激信號(hào)分子，具有恢復(fù)蛋白自然結(jié)構(gòu)、提高機(jī)體抗應(yīng)激能力的作用[20]。研究表明，奶牛和水牛夏季血清HSP70和HSP90含量都較高[21-22]，而Manjari等[23]認(rèn)為HSP70能夠作為水牛熱應(yīng)激的生理和細(xì)胞特征標(biāo)志物。本研究中，摩拉和尼里-拉菲水牛熱應(yīng)激期HSP70含量均顯著高于非應(yīng)激期，而熱應(yīng)激期HSP90含量與非應(yīng)激期之間沒(méi)有顯著差異。與劉深賀[24]研究中雜交水牛夏季血漿HSP70(421.28 pg/mL)和HSP90含量(3 348.48 pg/mL)均顯著高于冬季HSP70(174.11 pg/mL)和HSP90含量(947.21 pg/mL)的結(jié)果相比，本試驗(yàn)HSP70的結(jié)果與其相符且含量更高，而HSP90的結(jié)果與其不一致，說(shuō)明水牛血清HSP70比HSP90對(duì)熱應(yīng)激更敏感。

3.4 熱應(yīng)激對(duì)水牛血清離子含量的影響

血清離子在維持機(jī)體正常生理代謝和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面具有重要的作用，且對(duì)應(yīng)激反應(yīng)中激素的合成和分泌、能量代謝、蛋白質(zhì)合成、抗氧化以及免疫功能發(fā)揮都有重要作用[25]。本研究中，摩拉和尼里-拉菲水牛在熱應(yīng)激期血清K+含量均顯著高于非應(yīng)激期，摩拉水牛熱應(yīng)激期的Na+含量顯著高于非應(yīng)激期。這與廖迎新等[16]研究熱應(yīng)激對(duì)荷斯坦奶牛血液微量礦物元素影響的結(jié)果基本一致，其原因可能與熱應(yīng)激加劇新陳代謝，加強(qiáng)了礦物質(zhì)活動(dòng)有關(guān)。本研究中，摩拉水牛熱應(yīng)激期的Cl-含量顯著高于非應(yīng)激期，而摩拉和尼里-拉菲水牛熱應(yīng)激期的Ca2+含量均顯著低于非應(yīng)激期。其原因可能是熱應(yīng)激時(shí)水牛呼吸頻率加快，血液CO2濃度下降，造成呼吸性堿中毒，機(jī)體通過(guò)尿液排出K+、Na+等堿性離子來(lái)維持正常的酸堿平衡，導(dǎo)致血漿滲透壓降低并加強(qiáng)腎分泌碳酸氫鹽的能力，最終使血清中Cl-含量增加以及Ca2+含量下降。這與胡煜等[26]和黃德均等[27]研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激期牛血清Ca2+含量降低、血清Cl-含量升高的結(jié)果一致。說(shuō)明熱應(yīng)激影響了摩拉和尼里-拉菲水牛的機(jī)體電解質(zhì)平衡，K+和Ca2+分別呈顯著的上升與下降趨勢(shì)，而尼里-拉菲水牛可能具有更強(qiáng)的電解質(zhì)代償能力來(lái)維持機(jī)體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。

4 結(jié) 論

在本試驗(yàn)熱應(yīng)激條件下，摩拉和尼里-拉菲水牛的內(nèi)分泌激素水平和抗氧化能力下降，機(jī)體電解質(zhì)平衡也受到影響，尼里-拉菲水牛的免疫功能也有一定下降；摩拉水牛表現(xiàn)出更強(qiáng)的清除自由基能力，尼里-拉菲水牛表現(xiàn)出更好的代謝、體溫調(diào)節(jié)能力以及電解質(zhì)代償能力。