劉新勇，譚正準，李 輝，黃 健，羅 華，曾令湖，程雋如，鐘華配，楊春艷，王曉麗，覃廣勝

(1.廣西大學動物科學技術(shù)學院，南寧 530005；2.中國農(nóng)業(yè)科學院廣西壯族自治區(qū)水牛研究所，南寧 530001)

水?？煞譃楹恿餍秃驼訚尚蛢煞N類型，中國的本土水牛主要是作為役用的沼澤型水牛，摩拉和尼里-拉菲水牛則是從國外引進的產(chǎn)奶性能優(yōu)良的河流型水牛，目前在南方地區(qū)以提高生產(chǎn)性能為目標開展了與本地水牛的雜交改良，對新形勢下南方奶業(yè)和現(xiàn)代牧業(yè)的發(fā)展具有重要意義。氣候變化能對動物生理產(chǎn)生不利影響，導致生產(chǎn)和繁殖效率整體下降并造成巨大的經(jīng)濟損失，以及引起動物健康和福利等問題[1]。熱應激是指當動物產(chǎn)生的熱負荷超出其散熱能力時機體所做出非特異性反應的總和。夏季熱應激能引起水牛生理功能的一系列變化，包括采食量下降、激素分泌變化，呼吸頻率、脈搏率、直腸溫度升高及出汗、氧化應激增加等。由于水牛汗腺稀少，體表毛發(fā)稀疏，皮膚較厚且是黑色，容易吸收熱量，所以當水牛暴露在炎熱的環(huán)境條件下時更易受到熱應激影響[2]。目前普遍認為水牛在生理上對熱應激的適應性不如奶牛[3]。Lakhani等[4]和Li等[5]對不同季節(jié)摩拉和尼里-拉菲水牛生理反應和代謝相關(guān)激素以及氧化狀態(tài)進行了研究，證實了熱應激會對水牛生理產(chǎn)生不利影響。本研究旨在探討夏季熱應激和秋季非應激條件下摩拉和尼里-拉菲水牛血液生化指標的變化，通過測定能夠反映機體健康狀況、內(nèi)分泌系統(tǒng)功能、抗氧化功能、正常生理代謝的生化指標，對比兩種水牛熱應激時體內(nèi)物質(zhì)代謝和某些組織器官機能狀態(tài)變化及其耐熱性能，為夏季水牛熱應激的相關(guān)研究提供數(shù)據(jù)支持和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及飼養(yǎng)管理

試驗在廣西水牛研究所水牛種畜場進行。選擇體況相近、體重275～300 kg、4～5歲、飼養(yǎng)管理一致的摩拉和尼里-拉菲母水牛各11 頭。試驗期分為熱應激期(2020年7月)和非應激期(2020年11月)兩個階段，試驗期和非試驗期(2020年8月-2020年10月)試驗牛均在同一牛欄飼養(yǎng)，牛欄有運動場和遮陽棚且通風良好，試驗?？梢宰杂苫顒忧易杂刹墒吵渥愕娘暳虾惋嬎ｏ暭Z營養(yǎng)水平參照廣西水牛研究所水牛種畜場飼養(yǎng)標準，飼糧主要由象草、玉米秸稈、啤酒糟、精料補充料等組成，試驗期和非試驗期均保持一致。

1.2 牛舍環(huán)境的溫濕指數(shù)測定

采用在線揚塵監(jiān)測系統(tǒng)(深圳市格林福澤環(huán)境科技有限公司)實時記錄牛舍環(huán)境數(shù)據(jù)，將8個探頭安裝于牛舍墻壁，高度與動物背部接近，每1 h收集1次牛舍的溫度(T，℃)和相對濕度(RH，%)數(shù)據(jù)。保證探頭周圍有效通風，防止陽光照射和雨淋，并避免牛觸及。利用牛舍的溫度和相對濕度計算牛舍環(huán)境溫濕指數(shù)(THI)，THI=0.81×T+(0.99×T-14.3)×RH+46.3。以THI作為水牛熱應激程度的評定標準，當THI≤72為無熱應激；7288為重度熱應激[6]。

1.3 血樣采集及測定指標

每頭試驗牛采血4次，每次間隔1周。采血當天09:00(飼喂前)通過頸靜脈采血10 mL，室溫靜置2 h,待血液凝固后3 000 r/min離心10 min，分離血清分裝到EP管中，于-80 ℃保存待測。

一部分血清樣品送廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院應用日立7020全自動生化分析儀檢測，試劑盒由上海朗頓生物科技有限公司提供,測定指標包括：總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLOB)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶(GGT)、總膽固醇(CHOL)、尿素氮(BUN)、甘油三酯(TG)、葡萄糖(GLU)、三碘甲腺原氨酸(T3)、四碘甲腺原氨酸(T4)、鉀(K+)、鈉(Na+)、氯(Cl-)和鈣(Ca2+)離子含量/活性;另一部分血清樣品送江蘇晶美生物科技有限公司采用酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)檢測，試劑盒由江蘇晶美生物科技有限公司提供,測定指標包括：胰島素樣生長因子1(IGF-1)、牛皮質(zhì)醇(CORT)、牛瘦素(LEP)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、熱休克蛋白70(HSP70)和熱休克蛋白90(HSP90)的含量/活性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016初步整理后采用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析，以P<0.05表示差異顯著。試驗結(jié)果以平均值±標準差表示。

2 結(jié) 果

2.1 牛舍環(huán)境溫濕指數(shù)

由表1可知，熱應激期牛舍溫度為31.60 ℃，相對濕度為80.13%，THI為85.25，水牛處于中度熱應激；非應激期牛舍溫度為21.11 ℃，相對濕度為88.18%，THI為69.10，水牛處于非應激狀態(tài)。

表1 牛舍溫濕指數(shù)測定結(jié)果

2.2 熱應激期和非應激期的水牛部分血清生化指標比較

由表2可知，摩拉水牛熱應激期的CHOL含量顯著高于非應激期(P<0.05)，ALT和AST活性均顯著低于非應激期(P<0.05)；尼里-拉菲水牛熱應激期的ALB、CHOL、GGT含量均顯著高于非應激期(P<0.05)，GLOB含量顯著低于非應激期(P<0.05)。熱應激期摩拉水牛的ALT活性及TP、GLOB、CHOL、BUN、TG含量均顯著高于尼里-拉菲水牛(P<0.05)，ALB含量顯著低于尼里-拉菲水牛(P<0.05)；非應激期摩拉水牛的ALT活性及BUN、TG、GLU含量均顯著高于尼里-拉菲水牛(P<0.05)。其余生化指標在不同品種以及不同時期差異均不顯著(P>0.05)。

表2 水牛部分血清生化指標測定結(jié)果

2.3 熱應激期和非應激期的水牛血清激素含量比較

由表3可知，摩拉和尼里-拉菲水牛熱應激期的IGF-1、CORT、LEP含量均顯著低于非應激期(P<0.05)；尼里-拉菲水牛熱應激期的T3、T4含量均顯著高于非應激期(P<0.05)，T4含量顯著高于熱應激期摩拉水牛(P<0.05)；其余激素指標在不同品種以及不同時期差異均不顯著(P>0.05)。

表3 水牛血清激素含量測定結(jié)果

相同指標，同行數(shù)據(jù)肩標不同大寫字母表示兩個時期間差異顯著(P<0.05)，同列數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示兩個品種間差異顯著(P<0.05)，肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同

For the same index，in the same row，values with different capital letter superscripts mean significant difference between two periods (P<0.05),in the same column，values with different small letter superscripts mean significant difference between two breeds (P<0.05)；While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).The same as below

2.4 熱應激期和非應激期的水牛血清抗氧化指標比較

由表4可知，摩拉和尼里-拉菲水牛熱應激期的GSH-Px活性及T-AOC均顯著低于非應激期(P<0.05)，MDA和HSP70含量均顯著高于非應激期(P<0.05)；摩拉水牛熱應激期的SOD活性顯著高于非應激期(P<0.05)；其余抗氧化指標在不同品種以及不同時期差異均不顯著(P>0.05)。

表4 水牛血清抗氧化指標測定結(jié)果

2.5 熱應激期和非應激期的水牛血清離子含量比較

由表5可知，摩拉和尼里-拉菲水牛熱應激期血清K+含量均顯著高于非應激期(P<0.05)，Ca2+含量均顯著低于非應激期(P<0.05)；摩拉水牛熱應激期的Na+和Cl-含量均顯著高于非應激期(P<0.05)；熱應激期摩拉水牛的K+含量顯著低于尼里-拉菲水牛(P<0.05)；其余離子含量在不同品種以及不同時期差異均不顯著(P>0.05)。

表5 水牛血清離子含量測定結(jié)果

3 討 論

3.1 熱應激對水牛部分血清生化指標的影響

血清生化指標可以反映動物機體健康狀況、適應性及生產(chǎn)性能，可作為量化評判個體或群體健康狀況的指標[7]。血清 TP主要包括ALB和GLOB，BUN是蛋白質(zhì)的代謝產(chǎn)物，蛋白質(zhì)代謝良好時TP、ALB和BUN含量較低，而GLOB一定程度上可反映機體免疫力狀況[8]。本研究中，熱應激期尼里-拉菲水牛血清ALB含量顯著高于其非應激期，也高于熱應激期摩拉水牛，而GLOB含量則相反，但兩種水牛在兩個時期的TP和BUN含量均無顯著差異。說明熱應激對尼里-拉菲水牛的免疫水平造成了一定影響，但熱應激期摩拉和尼里-拉菲水牛的蛋白質(zhì)代謝狀況均良好。

ALT、AST和GGT活性均可反映動物機體肝功能狀況，當肝臟受損時，血清中ALT、AST和GGT濃度會升高[9]，且有研究表明GGT在反芻動物中可作為評價肝功能損傷的敏感指標[10]。CHOL可反映肝臟的類脂質(zhì)代謝功能情況，在肝細胞嚴重受損時，血清中CHOL濃度顯著下降。本研究中，除ALT活性高于默克獸醫(yī)手冊[11]正常范圍(6.9～35.3 U/L)外，其他生化指標含量均在水牛正常范圍以內(nèi)，但熱應激期摩拉和尼里-拉菲水牛的CHOL含量均顯著高于非應激期。說明熱應激雖未對摩拉和尼里-拉菲水牛的肝臟造成不良影響，但對兩種水牛的類脂質(zhì)代謝功能造成了一定影響。宋小珍等[9]研究發(fā)現(xiàn)，錦江黃牛熱應激期和非熱應激期的CHOL濃度不存在顯著差異，與本研究結(jié)果不一致，可能是黃牛對熱應激的耐受力更高，其類脂質(zhì)代謝功能未受到影響。考慮到膽固醇可作為甾體激素合成的原料，未來可結(jié)合熱應激對水牛生殖激素影響的研究來進一步探究CHOL能否作為水牛熱應激敏感指標。

TG是血脂的主要成分，主要功能是供給與儲存能量。本研究中尼里-拉菲水牛在兩個時期的BUN和TG含量均顯著低于摩拉水牛。由于試驗牛均處于同一飼養(yǎng)條件，可能是摩拉和尼里-拉菲水牛對不同營養(yǎng)成分的吸收代謝有一定差異導致的，也可能與尼里-拉菲水牛乳脂率(6.3%)低于摩拉水牛(7.6%)有關(guān)，摩拉和尼里-拉菲水牛營養(yǎng)代謝方面的對比還需進一步研究。

3.2 熱應激對水牛血清激素含量的影響

IGF-1是一種在肝臟中產(chǎn)生的內(nèi)分泌激素，能促進骨骼、肌肉和內(nèi)臟器官的生長[12]。CORT是腎上腺皮質(zhì)合成分泌的一種類固醇激素，具有動員能源，促進脂類、蛋白質(zhì)分解和糖異生作用[13]。LEP是主要由白色脂肪組織合成和分泌的蛋白質(zhì)類激素，能作用于下丘腦的代謝調(diào)節(jié)中樞，發(fā)揮抑制食欲、減少能量攝取、增加能量消耗、抑制脂肪合成的作用[14]。本研究中摩拉和尼里-拉菲水牛在熱應激期血清IGF-1、CORT和LEP含量均顯著低于非應激期，說明熱應激對水牛內(nèi)分泌系統(tǒng)造成一定影響，機體內(nèi)分泌系統(tǒng)通過自身調(diào)節(jié)降低了物質(zhì)與能量代謝以提高機體對熱應激的適應能力。研究表明，西門塔爾牛熱應激期的IGF-1濃度顯著下降[15]，與本研究結(jié)果一致。而廖迎新等[16]研究發(fā)現(xiàn)，荷斯坦奶牛熱應激期的CORT濃度顯著上升，可能是品種不同導致的。有關(guān)熱應激水牛血液IGF-1、CORT、LEP水平的研究鮮見報道，這3個指標能否作為反映水牛熱應激的敏感指標還需進一步的研究。

T3和T4能夠加速脂肪和糖的代謝，從而增加機體的產(chǎn)熱量。甲狀腺激素的合成和分泌受垂體分泌的促甲狀腺激素(TSH)的控制，其分泌過程與大腦皮層接受外界冷熱刺激有關(guān)。研究表明，熱應激可對下丘腦-垂體-甲狀腺軸產(chǎn)生影響，使甲狀腺濾泡縮小并減少T3和T4分泌，進而降低代謝率和減少產(chǎn)熱，以增加機體對炎熱環(huán)境的適應[17]。但Mayahi等[18]研究發(fā)現(xiàn)，水牛在夏季血清T4含量更高。而Dixit等[19]研究表明，摩拉水牛T3和T4濃度及其比率在不同季節(jié)并沒有顯著差異。本研究結(jié)果表明摩拉水牛T3和T4濃度在兩個時期沒有顯著差異，而尼里-拉菲水牛熱應激期的T3和T4濃度顯著高于非應激期，說明熱應激期摩拉和尼里-拉菲水牛均具有良好的甲狀腺功能和抗熱應激能力，但尼里-拉菲水牛的代謝和體溫調(diào)節(jié)能力更強。

3.3 熱應激對水牛血清抗氧化指標的影響

動物機體在正常情況下抗氧化能力與不斷產(chǎn)生氧自由基的氧化能力之間保持著動態(tài)平衡，不會造成組織損傷。但當動物受到熱應激影響時，自由基生成異常增多導致組織氧化損傷，并影響機體內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定。動物機體自身具有廣泛的抗氧化防御機制，體內(nèi)的抗氧化劑和抗氧化酶(如GSH-Px、SOD)都能清除脂質(zhì)過氧化物及過氧化物中的醛類化合物(如MDA)，從而降低組織的損傷程度。研究表明，熱應激期牛血清GSH-Px、SOD活性和T-AOC均顯著低于非應激期，而血清MDA含量顯著上升[5,15]，說明機體抗氧化能力減弱，抗氧化防御系統(tǒng)無法對抗過量的活性氧(ROS)負荷。本研究中摩拉和尼里-拉菲水牛在熱應激期的GSH-Px和T-AOC活性均顯著低于非應激期，MDA含量顯著高于非應激期。但摩拉水牛熱應激期的SOD活性顯著高于非應激期，GSH-Px活性和T-AOC高于熱應激期尼里-拉菲水牛。說明熱應激對摩拉和尼里-拉菲水牛的抗氧化能力均造成一定影響，GSH-Px活性、T-AOC及MDA含量發(fā)生了顯著的變化，但摩拉水牛比尼里-拉菲水牛具有更強的清除自由基能力。

HSP是反映動物舒適度和氣候適應性的重要壓力標志，是一類具有分子伴侶活性的應激信號分子，具有恢復蛋白自然結(jié)構(gòu)、提高機體抗應激能力的作用[20]。研究表明，奶牛和水牛夏季血清HSP70和HSP90含量都較高[21-22]，而Manjari等[23]認為HSP70能夠作為水牛熱應激的生理和細胞特征標志物。本研究中，摩拉和尼里-拉菲水牛熱應激期HSP70含量均顯著高于非應激期，而熱應激期HSP90含量與非應激期之間沒有顯著差異。與劉深賀[24]研究中雜交水牛夏季血漿HSP70(421.28 pg/mL)和HSP90含量(3 348.48 pg/mL)均顯著高于冬季HSP70(174.11 pg/mL)和HSP90含量(947.21 pg/mL)的結(jié)果相比，本試驗HSP70的結(jié)果與其相符且含量更高，而HSP90的結(jié)果與其不一致，說明水牛血清HSP70比HSP90對熱應激更敏感。

3.4 熱應激對水牛血清離子含量的影響

血清離子在維持機體正常生理代謝和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面具有重要的作用，且對應激反應中激素的合成和分泌、能量代謝、蛋白質(zhì)合成、抗氧化以及免疫功能發(fā)揮都有重要作用[25]。本研究中，摩拉和尼里-拉菲水牛在熱應激期血清K+含量均顯著高于非應激期，摩拉水牛熱應激期的Na+含量顯著高于非應激期。這與廖迎新等[16]研究熱應激對荷斯坦奶牛血液微量礦物元素影響的結(jié)果基本一致，其原因可能與熱應激加劇新陳代謝，加強了礦物質(zhì)活動有關(guān)。本研究中，摩拉水牛熱應激期的Cl-含量顯著高于非應激期，而摩拉和尼里-拉菲水牛熱應激期的Ca2+含量均顯著低于非應激期。其原因可能是熱應激時水牛呼吸頻率加快，血液CO2濃度下降，造成呼吸性堿中毒，機體通過尿液排出K+、Na+等堿性離子來維持正常的酸堿平衡，導致血漿滲透壓降低并加強腎分泌碳酸氫鹽的能力，最終使血清中Cl-含量增加以及Ca2+含量下降。這與胡煜等[26]和黃德均等[27]研究發(fā)現(xiàn)熱應激期牛血清Ca2+含量降低、血清Cl-含量升高的結(jié)果一致。說明熱應激影響了摩拉和尼里-拉菲水牛的機體電解質(zhì)平衡，K+和Ca2+分別呈顯著的上升與下降趨勢，而尼里-拉菲水牛可能具有更強的電解質(zhì)代償能力來維持機體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。

4 結(jié) 論

在本試驗熱應激條件下，摩拉和尼里-拉菲水牛的內(nèi)分泌激素水平和抗氧化能力下降，機體電解質(zhì)平衡也受到影響，尼里-拉菲水牛的免疫功能也有一定下降；摩拉水牛表現(xiàn)出更強的清除自由基能力，尼里-拉菲水牛表現(xiàn)出更好的代謝、體溫調(diào)節(jié)能力以及電解質(zhì)代償能力。