王兆麗，楊思宇，吳艷梅，宋曉曉，穆 祥，張 濤

(北京農學院動物科學技術學院,獸醫(yī)學(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室，北京 102206)

微血管內皮細胞(microvascular endothelial cells，MVECs)是動物體內的功能多樣性細胞[1]，是調控血液內中性粒細胞(neutrophils，Neu)向炎癥組織募集的樞紐性結構，Neu與MVECs的黏附及其跨內皮細胞遷移是Neu向炎癥組織募集的基礎[2]。研究MVECs與Neu黏附及其調控機制對闡明MVECs在相關疾病中的作用具有重要意義，可為有效發(fā)揮Neu的防御功能及控制其組織損傷作用提供試驗依據。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)感染仔豬常引起肺臟的彌漫性間質炎癥，混合感染或繼發(fā)感染細菌等病原微生物時，患豬的臨床癥狀和肺臟病變更顯著，易發(fā)生急性肺損傷而引起患豬死亡[3-4]。研究表明，Neu在急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用，遷移到肺臟組織的Neu可通過氧化和非氧化機制及釋放胞外誘捕網對病原體起到殺滅和清除作用[5]，而其過度積累和激活又是急性肺損傷的主要病理特征[6]。MVECs損傷是誘發(fā)急性肺損傷的病理基礎，這已在流感病毒[7]、禽流感病毒[8]和2019新型冠狀病毒[9]的致病機制中得到證明。也有研究顯示，PRRSV感染可顯著增加豬肺泡灌洗液中Neu的數量[10-11]。然而，MVECs在其中的作用鮮見報道。鑒于此，本試驗體外分離培養(yǎng)豬肺MVECs及豬外周血Neu，檢測PRRSV聯合脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激時，Neu與MVECs黏附的數量變化，旨在了解MVECs在PRRSV單獨和繼發(fā)細菌感染時肺臟募集Neu過程中的作用，以期為闡明PRRSV的致病機制提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 PRRSV毒株及試驗動物

PRRSV HN株由中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所惠贈，在Marc-145細胞上連續(xù)復壯3次后，收取病毒，測定其TCID50后，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。仔豬購自北京市SPF豬育種管理中心。

1.2 主要試劑及儀器

Ⅱ型膠原酶(LS004176)購自Worthington公司；DMEM高糖培養(yǎng)基(H2387)和胎牛血清(10099-141)均購自Gibco公司；D-Hank’s(H1040)、RPMI 1640培養(yǎng)基(31800)、豬外周血中性粒細胞分離液試劑盒(P4140)、脂多糖(L8880)和虎紅鈉鹽(G8540)均購自北京索萊寶科技有限公司；瑞士染色液(C0135)和免疫染色封閉液(P0102)均購自上海碧云天生物技術有限公司；E-選擇素抗體(bs-1273R)、P-選擇素抗體(bs-0561R)、CD34抗體(bs-0646R)、HRP標記羊抗兔IgG(bs-0295G-HRP)及DAB染色試劑盒(C02-04001)均購自北京博奧森生物技術有限公司。

倒置熒光數碼顯微鏡(IX71)購自Olympus公司；多功能酶標儀(Synergy 4)購自Biotek公司；二氧化碳培養(yǎng)箱(MCO-17AC)購自Sanyo公司。

1.3 豬外周血Neu的分離

臨床健康豬血采自北京市某屠宰場，加入35 U/L肝素溶液抗凝，參照姜代勛等[12]相關方法，于黏附試驗前1 d分離、提取豬外周血Neu，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸，調整細胞密度為5×106/mL，于37 ℃孵育、備用。

1.4 MVECs分離培養(yǎng)

參照Li等[13]方法分離培養(yǎng)MVECs，即仔豬按0.1 mL/kg BW注射速眠新Ⅱ注射液麻醉，無菌剖開胸腔取出肺臟，用預冷的D-Hank’s液洗去血污，剪取肺臟邊緣組織，撕去被膜并剪碎，置于37 ℃ 0.2% Ⅱ型膠原酶溶液消化約60 min，至吹打后無大塊肺臟組織，將消化液過孔徑75 μm細胞篩，濾液1 000 r/min離心5 min，將沉淀重懸于含1%雙抗、20%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，調整細胞濃度至5×105/mL后接種于培養(yǎng)板，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)2 h，洗去未貼壁細胞，更換完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至亞匯合狀態(tài)，用0.05%胰蛋白酶-0.005% EDTA溶液消化脫壁后傳代培養(yǎng)，并采用CD34免疫熒光染色法鑒定。

1.5 Neu與MVECs黏附試驗

Neu與MVECs黏附試驗分2次，分別檢測PRRSV處理和PRRSV-LPS聯合處理對其影響。將MVECs接種于24孔板，生長至亞匯合狀態(tài)，每孔更換為0.45 mL含2%胎牛血清的維持培養(yǎng)基，孵育過夜后，按照表1、2進行分組處理，每組3孔重復。

表1 PRRSV刺激對Neu黏附MVECs影響試驗的分組與處理

PRRSV處理試驗孵育培養(yǎng)18 h，或PRRSV-LPS聯合處理試驗繼續(xù)孵育培養(yǎng)6 h，吸棄MVECs培養(yǎng)基，每孔加入0.2 mL相應處理的Neu，孵育1 h，PBS溶液洗去未黏附細胞，4%多聚甲醛溶液室溫固定30 min，瑞氏染色后觀察，拍照分析。

表2 PRRSV-LPS聯合刺激對Neu黏附MVECs影響試驗的分組及處理

1.6 選擇素表達的免疫細胞化學染色

為了解MVECs表達選擇素的特點，試驗采用免疫細胞化學染色法檢測E-選擇素和P-選擇素的表達。將MVECs細胞接種于預置有圓形蓋玻片的培養(yǎng)板，加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，4%多聚甲醛溶液室溫固定30 min。試驗分為3組：陰性對照組、P-選擇素組和E-選擇素組，每組3個重復，陰性對照組將選擇素抗體替換為PBS溶液，常規(guī)方法進行免疫細胞化學染色，蘇木素復染，中性樹膠封片，顯微鏡觀察、拍照分析。

1.7 Neu與MVECs黏附中選擇素的作用

為進一步研究選擇素在PRRSV-LPS刺激Neu黏附MVECs過程中的作用，本試驗檢測了E-選擇素和P-選擇素的影響。將MVECs接種于96孔培養(yǎng)板孵育培養(yǎng)，生長至匯合后加入0.18 mL維持培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜，分組與各時間點處理見表3，每組3個重復，孵育1 h。吸棄MVECs培養(yǎng)基，每孔加入0.1 mL相應處理的Neu，再孵育1 h，PBS溶液洗去未黏附細胞，每孔加入0.25%虎紅溶液0.1 mL，室溫靜置10 min，PBS洗去游離虎紅，每孔加0.2 mL乙醇-PBS溶液(1∶1)，室溫靜置1 h，用酶標儀測定D570 nm值。

表3 選擇素對PRRSV-LPS致Neu黏附MVECs影響試驗的分組及處理

1.8 統計分析

Neu黏附試驗每組隨機選擇3～5個視野拍照，分別對黏附的Neu數量計數；選擇素在Neu黏附MVECs中的作用試驗，計數各重復孔虎紅染色后酶標儀測定的D570 nm值。 試驗數據均利用GraphPad Prism 8.0軟件進行單因素方差分析及后續(xù)Tukey檢驗。結果以平均值±標準差表示。P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 MVECs體外生長特征

體外分離培養(yǎng)的MVECs顯微鏡下折光性良好，呈不規(guī)則多角形，胞質豐富，一般有2個以上長突起，傳代培養(yǎng)約3～5 d生長至匯合狀態(tài)(圖1A)；CD34免疫熒光染色結果顯示，細胞培養(yǎng)物呈陽性著色，陽性細胞比率約為92%(圖1B)。

A，顯微形態(tài)；B，CD34免疫熒光陽性著色

2.2 PRRSV處理對Neu黏附MVECs的影響

由圖2可知，正常情況下，Neu與MVECs僅有少量黏附；PRRSV HN株處理Neu和MVECs其中1種或2種細胞時，黏附MVECs的Neu數量均有增加；由圖3可知，與正常對照組相比，Neu處理組與雙處理組的黏附細胞數量分別顯著和極顯著增加(P<0.05;P<0.01)，MVECs處理組無顯著差異(P>0.05)。

A，正常對照組；B，MVECs處理組；C，Neu處理組；D，雙處理組。圖3同

*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)。下同

2.3 PRRSV-LPS聯合刺激對Neu黏附MVECs的影響

由圖4可知，與LPS直接刺激相比，PRRSV HN株預先處理MVECs和/或Neu，然后再用LPS刺激時，Neu黏附數量均有不同程度增加；由圖5可知，雙處理組與LPS對照組有顯著差異(P<0.05)，而MVECs處理組和Neu處理組與LPS對照組均無顯著差異(P>0.05)。

A，LPS對照組，B，MVECs處理組，C，Neu處理組，D，雙處理組。圖5同

圖5 PRRSV-LPS聯合處理時黏附MVECs的Neu計數結果

2.4 MVECs表達選擇素特點

MVECs免疫細胞化學染色結果顯示，E-選擇素和P-選擇素均呈陽性著色，著色部位在細胞膜和細胞漿，陽性細胞率約為100%；陰性對照組以PBS替代選擇素抗體時，未見明顯陽性著色(圖6)。

A，E-選擇素組；B，P-選擇素組；C，陰性對照組

2.5 選擇素對PRRSV-LPS致Neu黏附MVECs的影響

由圖7可知，PRRSV HN株單獨處理和PRRSV-LPS共同處理時，Neu黏附數量顯著或極顯著增加(P<0.05；P<0.01)；而E-選擇素和P-選擇素抗體封閉后，Neu黏附數量均有一定下降，但仍高于正常對照組，方差分析顯示，E-選擇素封閉時，2種處理組的Neu黏附數量下降均有顯著差異(P<0.05)，而P-選擇素封閉時，均無顯著差異(P>0.05)。

A,正常對照組；B,PRRSV組；C，PRRSV-E組；D，PRRSV-P組；E，PRRSV-LPS組；F，PRRSV-LPS-E組；G，PRRSV-LPS-P組

3 討 論

Neu和巨噬細胞是參與急性肺損傷的主要效應細胞[14]，MVECs在Neu等向組織器官募集和遷移時起著“看門人”的角色。鑒于炎癥反應是PRRSV感染誘導急性肺損傷時的典型病理變化，本試驗旨在明確PRRSV及聯合LPS刺激時Neu與MVECs黏附的變化，結果發(fā)現，PRRSV HN株顯著增加Neu黏附于MVECs的數量，并提高后繼LPS刺激所致Neu與MVECs的黏附數量。PRRSV HN株對Neu黏附于MVECs的促進作用，為Neu在肺臟組織的大量募集奠定了基礎，這在一定程度上解釋了前述報道PRRSV感染豬肺泡灌洗液Neu數量增加的原因，此結果與流感病毒[15]、2019新型冠狀病毒[16]等感染時Neu在肺臟的募集相似。

由于PRRSV感染豬常繼發(fā)細菌感染，故本試驗研究了PRRSV HN株處理后，再以LPS刺激時Neu的黏附情況，結果顯示，LPS單獨刺激時Neu與MVECs的黏附顯著增加，與朱雯宇等[17]研究結果相似。值得注意的是，PRRSV處理后再用LPS刺激時，Neu的黏附數量顯著高于LPS單獨刺激時，這提示PRRSV繼發(fā)細菌感染時，Neu在豬肺臟的募集數量可能會多于單獨細菌感染。而據Labarque等[18]報道，無論有無PRRSV感染，LPS刺激時仔豬肺臟Neu的浸潤數量相似，但該研究未關注Neu與MVECs黏附，亦未深入研究感染不同時間點Neu黏附數量的動態(tài)變化。Labarque等[18]及van Gucht等[19]研究報道均認為，PRRSV-LPS共同刺激時，豬肺臟組織的炎性病變和損傷均更為嚴重。Neu作為非特異性免疫細胞，適度募集對抵御外來病原體具有一定作用，而過度募集或清除障礙則會導致組織損傷。PRRSV促進后繼LPS刺激時Neu黏附MVECs數量的結果也提示，這可能是PRRSV繼發(fā)細菌感染時患豬肺組織損傷等病理反應更為嚴重的機制之一。

本實驗室前期研究表明，MVECs感染PRRSV約72 h才能在細胞內檢測到病毒核酸的顯著擴增，感染約5 d時才出現致細胞病變效應[13]。本試驗側重于PRRSV感染后MVECs早期功能變化，選擇了感染時間為18 h。研究結果顯示，PRRSV單獨感染MVECs時，Neu黏附數量的增加無統計學顯著性，PRRSV作用于Neu或MVECs后再給予LPS刺激時，Neu黏附數量的增加與LPS單獨刺激亦無顯著差異，其原因可能與PRRSV HN株的作用時間有一定關系。另一方面，PRRSV只感染MVECs時，正常Neu的黏附數量亦有一定程度增加，這提示MVECs在其中有潛在的調控作用。

白細胞與血管內皮細胞的黏附主要由選擇素介導，其成員主要有L-、E-和P-選擇素3種[20]。L-選擇素主要表達于白細胞表面，血管內皮細胞主要表達另外2種選擇素[21]。本研究結果表明，E-選擇素和P-選擇素在豬肺MVECs均呈陽性表達，在PRRSV誘導的Neu黏附中均有一定作用，但E-選擇素的作用更為顯著，這與選擇素在Neu黏附豬主動脈內皮細胞中的作用特點相似[22]。Neu滲出是多種類型黏附分子參與調控的一系列過程，黏附后的激活和滲出主要由MVECs表達的整合素和VCAM-1、ICAM-1等介導。Liu等[23]研究認為，PRRSV誘導的Neu滲出有ICAM-1依賴和非ICAM-1依賴模式。所以，MVECs在PRRSV感染誘導的Neu跨內皮遷移中黏附后階段的作用，有待進一步深入研究。鑒于MVECs在病毒感染中的關鍵作用[24]，通過調控MVECs對選擇素的表達，在Neu跨內皮遷移的早期黏附階段予以干預，對抑制PRRSV感染誘導的炎性損傷應具有潛在的意義。

4 結 論

PRRSV HN株處理能顯著促進Neu黏附MVECs，亦能顯著提高后繼LPS刺激時Neu黏附數量；MVECs能表達E-選擇素和P-選擇素，尤以E-選擇素在MVECs介導PRRSV HN株誘導Neu黏附增加中具有重要作用。本研究為PRRSV感染促進Neu在豬肺組織的募集提供了佐證，表明MVECs在PRRSV感染中具有重要作用。