顏 忠,楊漢春

(中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100193)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的豬的一種急性、高度傳染性腸道疾病，以豬的嘔吐、水樣腹瀉、脫水和生長遲緩為主要特征[1]。PED首次出現(xiàn)在20世紀70年代初的英格蘭和比利時[2]，并于1977年在比利時首次分離出PEDV[3],1984年在中國首次出現(xiàn)，隨后一直處于散發(fā)狀態(tài)，自2010年底，中國大范圍暴發(fā)了PED疫情，造成了嚴重的經(jīng)濟損失，2013年春季PED開始傳入美國、加拿大和墨西哥等國家[4]。

研究表明，PEDV的變異主要發(fā)生在S基因，S基因?qū)τ诹私釶EDV田間分離株的遺傳相關性和流行病學狀況及促進疫苗研發(fā)至關重要[5-7]。目前，PEDV全球主要流行毒株分為GⅠ(經(jīng)典型)和GⅡ(變異型)2個基因型，其中GⅠ基因型包括GⅠa和GⅠb 2個基因亞型，GⅡ基因型包括GⅡa、GⅡb和GⅡc 3個基因亞型[8]。GⅠ基因型毒株S基因長度為4 152 bp，編碼1 383個氨基酸，而GⅡ基因型毒株S基因長度為4 161或4 158 bp，比GⅠ基因型毒株長9或6 bp。GⅠ與GⅡ基因型毒株主要差異在于S基因。對PEDV S蛋白序列比對分析發(fā)現(xiàn)，GⅠ與GⅡ基因型毒株S蛋白之間存在上百個氨基酸差異，主要集中于S1基因，而S2基因相對保守[9]。因此，對PEDVS1基因變異情況進行監(jiān)測與遺傳變異分析對于PED的防控具有重要的意義。

本研究于2018-2020年從中國11個省市318個規(guī)模化豬場共采集2 391份樣品，采用RT-PCR方法檢測PEDV核酸，選擇30個PEDV毒株進行S1全基因擴增與測序，與國內(nèi)外參考毒株進行遺傳變異分析，構(gòu)建遺傳進化樹，并對PEDV S1蛋白進行分析，預測其流行變異趨勢，以期為PEDV的防控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 2018年1月至2020年12月從中國北京、內(nèi)蒙古、河北、河南、山東、四川、湖北、廣西、安徽、江蘇及重慶318個母豬存欄規(guī)模>500頭的規(guī)模化豬場共采集2 391份樣本(包括腹瀉豬和非腹瀉豬的腸道、糞便、口腔液等)，通過RT-PCR方法檢測樣品PEDVS1基因，并對不同年度、省市、季節(jié)豬場和樣品PEDV核酸陽性率進行分析。不同年份及地點的豬場數(shù)量和樣品數(shù)量詳見表1。

表1 2018-2020年11省市檢測的豬場數(shù)量和樣品數(shù)量

續(xù)表

1.1.2 主要試劑及儀器 2×One-Step RT-PCR Master Mix、Trans5K Plus DNA Marker、Enzyme Mix均購自北京全式金生物技術有限公司；RNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量DNA提取試劑均購自天根生化科技(北京)有限公司。PCR儀購自Bio-Rad公司；超凈臺購自蘇州安泰空氣技術有限公司；離心機、單道移液器均購自賽默飛世爾(上海)儀器有限公司；移液器購自普蘭德(上海)貿(mào)易有限公司；凝膠成像系統(tǒng)和水平電泳儀電泳槽均購自北京六一生物科技有限公司；千分之一電子天平購自上海卓精電子科技有限公司；渦旋振蕩器、微量振蕩器均購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 腸道組織：取適量有典型病變的腸道組織，按1∶4加入滅菌的PBS或生理鹽水，置于研磨器(滅菌)中研磨，反復凍融3次，12 000 r/min離心5 min，取上清液進行病毒RNA提取。

口腔液等液體樣品：避免反復凍融，12 000 r/min離心5 min，取上清液進行病毒RNA提取。

糞便拭子：使用滅菌棉簽采集糞便拭子，立即置于0.5 mL含103U/mL雙抗(青霉素和鏈霉素)的PBS中，渦旋震蕩15 s，12 000 r/min離心5 min，取上清液進行病毒RNA提取。

1.2.2 引物設計與合成 根據(jù)GenBank中BJ-2011-1毒株S1基因保守序列(登錄號：JN825712)設計1對特異性引物，A-F:5′-GCGCTGTGATT-GACGGCACACT-3′；A-F:5′-GTAAGCATAGA-GTTGACTTCAG-3′，預期擴增產(chǎn)物大小約為2 800 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3 病毒RNA提取與擴增 按照RNA提取試劑盒說明書，采用離心柱法提取核酸，以提取的RNA為模板進行一步法RT-PCR反應。PCR反應體系20 μL：2×One-Step Reaction Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，RNA模板5.5 μL，Enzyme Mix 0.4 μL，DEPC水3.3 μL。PCR反應條件：45 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min；95 ℃預變性 5 min；95 ℃變性 30 s,50 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 3 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.2.4 PEDVS1基因克隆與測序 RT-PCR擴增產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后按照膠回收試劑盒說明書回收，與pEASY?-Blunt Simple Cloning載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，于37 ℃培養(yǎng)至長出單個菌落，挑取合適菌落擴大培養(yǎng)，吸取200 μL菌液涂于LB/Amp+平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜(12～16 h)，挑選菌落進行PCR鑒定，將陽性樣品送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.5 PEDVS1基因序列比對和分析 使用DNAStar軟件中的 MegAlign 程序?qū)y序結(jié)果進行編輯和遺傳進化分析。在 GenBank上下載部分參考毒株，具體信息見表2。使用 DNAStar 軟件中的 MegAlign 程序采用 ClustalW方法對參考序列與目標序列進行核苷酸和氨基酸序列的相似性比對及抗原表位分析，使用 Mega 7.0軟件并采用 Neighbor-Joining法繪制進化樹。

表2 PEDV參考毒株信息

2 結(jié) 果

2.1 2018-2020年11省市豬場PEDV核酸檢測結(jié)果

2018-2020年11省市豬場PEDV核酸檢測結(jié)果見表3。由表3可知，豬場PEDV核酸陽性率分為48.57%、10.96%和4.72%，呈現(xiàn)出逐年下降的趨勢，樣品PEDV核酸陽性率分別為28.97%、8.27%和7.50%,也呈現(xiàn)出逐年下降的趨勢。

表3 2018-2020年11省市豬場及樣品PEDV核酸檢測結(jié)果

2.2 2018-2020年11省市豬場不同季度PEDV核酸檢測結(jié)果

2018-2020年不同季度豬場和樣品PEDV核酸陽性率統(tǒng)計結(jié)果見表4。2018年4個季度豬場PEDV核酸陽性率分別為46.67%、10.53%、6.67%和38.89%；2019年4個季度豬場PEDV核酸陽性率分別為14.28%、5.89%、0和6.90%；2020年4個季度豬場PEDV核酸陽性率分別為3.57%、2.63%、2.41%和4.28%。2018年4個季度樣品PEDV核酸陽性率分別為40.59%、11.36%、5.30%和39.01%；2019年4個季度樣品PEDV核酸陽性率分別為10.99%、6.41%、0和3.91%；2020年4個季度樣品PEDV核酸陽性率分別為4.34%、3.37%、4.94%和12.12%。

表4 2018-2020年不同季度PEDV核酸檢測結(jié)果

2.3 PEDV S1基因RT-PCR擴增與測序

將提取的PEDV RNA樣品進行反轉(zhuǎn)錄,PCR擴增S1基因，結(jié)果顯示，目的條帶約2 800 bp,與預期大小一致,部分樣品PCR擴增結(jié)果見圖1。將PCR產(chǎn)物與pEASY?-Blunt Simple Cloning載體進行連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，采用PCR方法對重組質(zhì)粒進行鑒定，將陽性克隆菌株送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，共獲得30條序列，分別命名為CH-AHsz-2018、CH-BJcp-2018、CH-HBhs-2018、CH-HBwh-2018、CH-HNny-2018、CH-SCmy-2018、CH-SDdz-2018、CH-SDly-2018、CH-SDwf-2018、CH-SDyt-2018、CH-HBhs-2019、CH-SCbc-2019、CH-SCmy-2019、CH-SCqs-2019、CH-SCxp-2019、CH-SCyc-2019、CH-SDdz-2019、CH-GXxz-2020、CH-HBfc-2020、CH-HBgl-2020、CH-HBhh-2020、CH-HBhs-2020、CH-NMtl-2020、CH-NMzn-2020、CH-SCls-2020、CH-SDcx-2020、CH-SDdz-2020、CH-SDlq-2020、CH-SDls-2020和CH-SDwl-2020。

M，DL5000 DNA Marker；1，陽性對照；2，陰性對照；3～24，部分樣品

2.4 PEDV S1基因序列比對分析

利用DNAStar軟件對30株PEDV的S1基因進行相似性比對分析，結(jié)果顯示，本試驗獲得的30株毒株序列之間的核苷酸相似性為93.0%～99.5%，氨基酸相似性為91.7%～100%(圖2、3)，其中22株序列基因長度為2 376 bp，共編碼約792個氨基酸，8株序列基因長度為2 367 bp，共編碼約789個氨基酸；本試驗獲得的30株毒株序列與CV777、Vaccine CV777為代表的GⅠ基因型毒株核苷酸和氨基酸序列相似性分別為91.1%～95.2%和89.4%～95.4%；與以BJ2011-1、AJ1102、GER/L00862/2014為代表的GⅡ基因型毒株核苷酸和氨基酸序列相似性分別為93.4%～99.3%和92.1%～99.2%；與2017-2018年流行的CH-SCYA-2018、HLJ-2018-824b、Heb-ZJK-CH-2018Mar、CH-SD-WF01、GX-HZ-CH-2018Jan、HN-YY-CH-2018Mar、Hub-WH-CH-2018Mar、HuN-YY-2018-19c等GⅡ基因型毒株核苷酸和氨基酸序列相似性分別為93.2%～99.6%和91.2%～99.5%。

圖2 30株PEDV流行株S1基因核苷酸序列相似性分析

使用Mega 7.0軟件采用ClustalW方法將獲得的30個毒株與國內(nèi)外34株具有代表性的參考毒株S1基因核苷酸序列進行比對，構(gòu)建遺傳進化樹。由圖4可知，進化樹分為GⅠ基因型和GⅡ基因型。與國內(nèi)外34株參考毒株相比，本研究得到的30個毒株均為GⅡ基因型，其中17株毒株為GⅡa基因亞型、5株毒株為GⅡb亞型、8株毒株為GⅡc亞型。 這些毒株與2010年以后國內(nèi)流行的BJ2011-1、GD-A等GⅡ基因型毒株的親緣關系較近，與中國早期分離的CV777、Vaccine CV777、LZC等GⅠ基因型毒株的親緣關系較遠。

2.5 PEDV S1基因主要抗原位點分析

對30株PEDV毒株S1蛋白氨基酸序列進行分析，結(jié)果見圖5。由圖5可知，本研究中的22株PEDV流行毒株與2017-2018年流行的CH-SCYA-2018、HLJ-2018-824b、Heb-ZJK-CH-2018Mar、GX-HZ-CH-2018Jan、CH-SD-WF01、HN-YY-CH-2018Mar、Hub-WH-CH-2018Mar、HuN-YY-2018-19c等GⅡ基因型毒株S1氨基酸序列相比表現(xiàn)出幾處相同遺傳標記，在55-56位氨基酸之間存在4個氨基酸(GENQ)的插入，139-140位氨基酸之間存在1個氨基酸(N)的插入，159-160位氨基酸之間存在2個氨基酸(DG)的缺失；另外8株流行毒株S1基因編碼的氨基酸沒有相同的插入和缺失，表現(xiàn)出與經(jīng)典株和S-INDEL毒株相同的遺傳標記。

圖3 30株PEDV流行株S1基因編碼氨基酸序列相似性分析

圖4 2018-2020年PEDV流行株S1基因遺傳進化分析

-，氨基酸缺失

3 討 論

近年來，中國學者對不同地區(qū)PEDV的分子流行病學和遺傳變異分析進行了大量研究,張志等[10]2011-2014年對29個省市7 021個豬場采集的1 383份腹瀉樣品進行PEDV流行病學調(diào)查顯示，PEDV豬場陽性率為57.83%，樣品陽性率為67.82%；蔣新華等[11]對2017年從江西省11個地區(qū)采集的182份小腸組織和糞便樣品檢測結(jié)果顯示，PEDV陽性率為37.91%；嚴謹?shù)萚12]對2017-2019年從廣西地區(qū)收集的1 463份樣品的檢測結(jié)果顯示，PEDV陽性率為10.12%；袁翠霞等[13]對2017-2019年從貴州地區(qū)38個豬場292份疑似腹瀉樣品進行檢測發(fā)現(xiàn)，PEDV陽性率為44.2%。PEDV的高陽性率表示PEDV一直很活躍，變異毒株在國內(nèi)不斷循環(huán)[14]，對中國養(yǎng)豬業(yè)依然存在較大的危害，PEDV已成為中國非常重要的病原體，僅次于非洲豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒[15]，需引起高度重視。本研究對中國不同地區(qū)、不同季節(jié)豬群PEDV的感染狀況進行了監(jiān)測。結(jié)果顯示，2018-2020年，11省市豬場PEDV核酸陽性率分為48.57%、10.96%和4.72%，11省市樣品PEDV核酸陽性率分別為28.97%、8.27%和7.50%，豬場和樣品PEDV核酸陽性率呈現(xiàn)出逐年下降的趨勢，這可能與2018年8月非洲豬瘟病毒進入中國之后，豬場加強生物安全管理有關；季度監(jiān)測結(jié)果顯示，豬場一年四季均感染PEDV，無明顯的季節(jié)性，但一季度和四季度頻發(fā)，說明PEDV在春節(jié)和冬季較活躍。

PEDVS1基因是主要抗原基因，常用于PEDV分子流行病學監(jiān)測[16]，本研究擴增得到的30個毒株序列之間的核苷酸相似性為93.0%～99.5%，氨基酸相似性為91.7%～100%，均為GⅡ基因型，其中17株毒株為GⅡa基因亞型、5株毒株為GⅡb基因亞型、8株毒株為GⅡc基因亞型，表明2018-2020年GⅡa基因亞型毒株為中國流行的主要毒株類型。本研究發(fā)現(xiàn)，在同一年度同一個地區(qū)流行PEDV不同基因亞型毒株，在這些毒株廣泛流行的地區(qū)確定PEDV變異的來源至關重要，這些地區(qū)有可能成為PEDV遺傳變異的儲存庫，從而導致不同PEDV亞基因型之間的重組，這可能是已有經(jīng)典株疫苗不能完全保護的原因。對30株PEDV毒株S1蛋白氨基酸序列進行分析顯示，本研究中的22株PEDV流行毒株與2017-2018年流行的GⅡ基因型毒株S1氨基酸序列表現(xiàn)出幾處相同的遺傳標記，另外8株流行毒株S1基因編碼的氨基酸沒有相同的插入和缺失，表現(xiàn)出與經(jīng)典株和S-INDEL毒株相同的遺傳標記，Guo等[8]將其歸類為GⅡc基因亞型毒株，是GⅠa和GⅡa基因亞型的重組變異毒株氨基酸序列。

2010年10月，中國南方省份開始暴發(fā)PED疫情，免疫疫苗的豬群并未免于PEDV的感染，經(jīng)典毒株的疫苗未能提供足夠的保護作用[17-19]，泰國和韓國研究人員證實，所有可用的商業(yè)疫苗(GⅠ基因型)均不能針對當前流行的毒株(GⅡ基因型)提供足夠的免疫保護[20]，這種現(xiàn)象可能是由病毒的急劇變異引起的，疫苗和田間流行毒株之間的抗原性、遺傳性(各個S蛋白之間的氨基酸差異>10%)和遺傳進化樹存在差異(GⅠ與GⅡ)[21-24]。Guo等[8]分析發(fā)現(xiàn)，GⅡ基因型毒株中S1蛋白中和表位7個氨基酸的替換(L521H、S523G、V527I、T549S、G594S、A605E和L612F)可能導致傳統(tǒng)的GⅡ基因組的滅活疫苗和減毒疫苗不能有效保護GⅡ基因型毒株感染。因此，應使用田間廣泛流行的GⅡ基因型 PEDV流行毒株控制PED。來自田間的GⅡ基因型PEDV分離株的重組S1蛋白有效地保護了新生仔豬免受PEDV感染，其有可能被用作預防PED的亞單位疫苗[25]。在中國，疫苗免疫仍是控制PED發(fā)生和流行的最佳方法，是預防、控制和凈化PED的主要手段，未來開發(fā)高效的新型基因工程疫苗是今后疫苗研究的重點方向。本研究結(jié)果為監(jiān)測和分析中國PEDV的變異和演化提供了臨床數(shù)據(jù)支持，為PED防控和疫苗研制提供了參考。

4 結(jié) 論

本研究于2018年1月至2020年12月期間對中國11省市PEDV的分子流行病學進行監(jiān)測與分析，發(fā)現(xiàn)獲得的30株PEDV都屬于GⅡ基因型，表明GⅡ基因型PEDV是目前中國流行的主要基因型毒株。