陳凌波，張 鈺，方小偉，吉俊芝，方 春，楊玉瑩

(長江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，荊州 434025)

單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)，簡稱單增李斯特菌，是一種重要的人獸共患病原菌，該菌感染可以引發(fā)人和動(dòng)物的李斯特菌病(listeriosis)，表現(xiàn)為胃腸炎、敗血癥、腦膜腦炎和流產(chǎn)等，病死率約30%[1]。單增李斯特菌對(duì)環(huán)境的耐受力極強(qiáng)，該菌可以在高滲透壓、寬泛的溫度(0～45 ℃)和pH(4.5～9.0)等不利應(yīng)激條件下存活甚至生長[2]。雙元調(diào)控系統(tǒng)(two-component system，TCS)是細(xì)菌中重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，負(fù)責(zé)感受環(huán)境信號(hào)并將其轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)菌體內(nèi)，調(diào)控相關(guān)靶基因的表達(dá)使得細(xì)菌能夠?qū)Νh(huán)境變化信號(hào)作出響應(yīng)[3]。典型的TCS由組氨酸激酶(histidine kinase，HK)和響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白(response regulator，RR)兩部分組成。HK錨定在細(xì)胞膜上感受特定的環(huán)境信號(hào)刺激以激活自身激酶活性，活化的激酶水解ATP使得HK上特定組氨酸殘基發(fā)生磷酸化；磷酸化的HK將磷酸基團(tuán)傳遞給對(duì)應(yīng)的RR，RR接收結(jié)構(gòu)域上的天冬氨酸殘基被磷酸化激活后導(dǎo)致其輸出結(jié)構(gòu)域構(gòu)象改變，后者通過結(jié)合靶基因的啟動(dòng)子調(diào)控靶基因發(fā)揮作用[4]。細(xì)菌通常擁有多套TCS以應(yīng)對(duì)不同的信號(hào)刺激，根據(jù)單增李斯特菌基因組序列預(yù)測該菌基因組至少編碼16套TCS[5-6]。這些TCS在調(diào)控單增李斯特菌毒力、抗生素耐藥性以及抵抗環(huán)境應(yīng)激等方面發(fā)揮重要作用。Jiang等[7-8]發(fā)現(xiàn)VirSR介導(dǎo)單增李斯特菌生物被膜形成以及對(duì)多種抗生素的敏感性。LiaFSR系統(tǒng)則參與單增李斯特菌應(yīng)對(duì)溫度、酸堿度、滲透壓、氧化應(yīng)激以及抵抗抗生素和消毒劑的殺傷作用[9-10]。Pontinen等[9,11]敲除lisK基因，發(fā)現(xiàn)單增李斯特菌在低溫條件下生長速度減慢，但不影響該菌在高溫、高滲以及氧化應(yīng)激條件下的生長能力。Aslan等[12]敲除lisR基因顯著減弱單增李斯特菌對(duì)玻璃界面的黏附能力和對(duì)氨芐青霉素的耐受。唯一的孤兒反應(yīng)調(diào)節(jié)因子DegU則介導(dǎo)細(xì)菌的毒力、運(yùn)動(dòng)性以及生物被膜形成能力[13]。盡管除了DegU外，其他TCS都成對(duì)存在，但發(fā)揮作用過程并非完全一一對(duì)應(yīng)，Alistair等[14]發(fā)現(xiàn)，在缺磷條件下，枯草芽孢桿菌的PhoPR系統(tǒng)的HK(PhoR)可以激活YycFG系統(tǒng)的RR(YycF)，調(diào)控下游靶基因應(yīng)對(duì)磷饑餓。目前尚不清楚其他TCS間是否存在相互作用導(dǎo)致其表現(xiàn)出多種功能。本研究擬利用同源重組技術(shù)整體敲除lisRK基因簇，進(jìn)而闡明其對(duì)單增李斯特菌環(huán)境適應(yīng)性和致病性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體 單增李斯特菌參考菌株10403S(血清型為1/2a型)、穿梭質(zhì)粒pKSV7和回補(bǔ)質(zhì)粒pIMK2均由浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院方維煥教授饋贈(zèng)。腸上皮細(xì)胞Caco-2和胃腺癌細(xì)胞MGC803分別由浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院程昌勇博士和南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院劉羅根博士饋贈(zèng)。BALB/c小鼠購自長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要試劑 腦心浸液培養(yǎng)基BHI購自北京陸橋生物技術(shù)有限公司；LB培養(yǎng)基購自生工生物工程(上海)股份有限公司；核酸染料GoldView購自上海賽百盛公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒以及DNA Marker均購自武漢擎科生物技術(shù)有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ購自NEB公司；無縫克隆試劑盒購自北京艾德萊生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 缺失株與回補(bǔ)株的構(gòu)建 缺失株構(gòu)建方法參照文獻(xiàn)報(bào)道[15]，具體過程如下：根據(jù)參考菌株10403S基因組信息(登錄號(hào)：CP002002)，運(yùn)用Vector NTI軟件設(shè)計(jì)攜帶lisRK基因上、下游同源臂的重組質(zhì)粒pFL315，本研究所用的引物由武漢擎科生物技術(shù)有限公司合成(表1)。首先以10403S基因組為模板用pFL315-A/B和pFL315-C/D分別擴(kuò)增上、下游同源臂，PCR產(chǎn)物回收后用引物pFL315-A/D通過重疊延伸PCR獲得融合的同源臂；再利用無縫克隆試劑盒將純化的同源臂與BamHⅠ線性化的穿梭載體pKSV7連接形成重組質(zhì)粒pFL315；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞并涂布含100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板；挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，陽性克隆送武漢擎科生物科技有限公司測序,確認(rèn)插入的片段無誤。

表1 PCR引物信息

將重組質(zhì)粒pFL315電轉(zhuǎn)至單增李斯特菌10403S感受態(tài)細(xì)胞中，然后涂布含10 μg/mL氯霉素的BHI平板，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，待長出菌落后進(jìn)行PCR鑒定；陽性克隆轉(zhuǎn)接至含10 μg/mL的氯霉素BHI培養(yǎng)基中，于42 ℃培養(yǎng)箱中連續(xù)傳代，并通過旁側(cè)引物鑒定是否完成同源重組；將完成同源重組的克隆轉(zhuǎn)移至無抗BHI培養(yǎng)基，于30 ℃培養(yǎng)箱中連續(xù)傳代以消除重組后的質(zhì)粒，獲得缺失株ΔlisRK。

回補(bǔ)株構(gòu)建方法：用引物pFL317-fwd/rev擴(kuò)增lisRK基因片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)SalⅠ和SmaⅠ雙酶切后與酶切的pIMK2連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆分別用質(zhì)粒引物pIMK2-fwd/rev和特異性引物pFL317-fwd/rev進(jìn)行PCR鑒定，陽性的單克隆送測序，將回補(bǔ)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入缺失株ΔlisRK，構(gòu)建回補(bǔ)株CΔlisRK。

1.2.2 應(yīng)激生長曲線測定 分別挑取親本株10403S、缺失株ΔlisRK和回補(bǔ)株CΔlisRK單菌落于3 mL BHI培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h。分別取1 mL菌液，12 000 r/min離心收集菌體，用BHI培養(yǎng)基將菌體重懸，再用不同應(yīng)激培養(yǎng)基(pH 4.5、5% NaCl和10 mmol/L H2O2)分別將原菌液按1∶10連續(xù)倍比稀釋2次，至終濃度為原菌液的1%，然后取200 μL菌液接種于96孔板，每組3個(gè)平行，放置于37 ℃培養(yǎng)，每隔1 h使用酶標(biāo)儀測定D600 nm值，于平臺(tái)期停止測定。

1.2.3 酸應(yīng)激存活試驗(yàn) 分別挑取親本株10403S、缺失株ΔlisRK和回補(bǔ)株CΔlisRK單菌落于3 mL BHI培養(yǎng)基中，在37 ℃搖床中過夜培養(yǎng)。分別取1 mL菌液，12 000 r/min離心收集菌體，用PBS洗滌2次后再用1 mL PBS進(jìn)行重懸。 取50 μL菌液加入950 μL pH 2.5的BHI培養(yǎng)基中，渦旋混勻后置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h。通過平板計(jì)數(shù)確定處理前的菌數(shù)N0和應(yīng)激處理后存活的菌數(shù)N1，應(yīng)激存活率(SR)的計(jì)算公式為：SR=N1/N0×100%，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 細(xì)胞侵襲試驗(yàn) 分別挑取親本株10403S、缺失株ΔlisRK和回補(bǔ)株CΔlisRK單菌落于3 mL BHI培養(yǎng)基中，在37 ℃搖床中過夜培養(yǎng)。同時(shí)準(zhǔn)備生長狀態(tài)良好的腸上皮細(xì)胞Caco-2或胃腺癌細(xì)胞MGC803鋪12孔板，每組4個(gè)平行孔。次日去除舊培養(yǎng)基，細(xì)胞用無菌PBS清洗3次，加入1 mL無抗DMEM，收集過夜培養(yǎng)的細(xì)菌，經(jīng)PBS洗滌3次后，倍比稀釋至合適梯度，每孔加入50 μL菌液使感染復(fù)數(shù)(MOI)約為10∶1，混勻后置于37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，實(shí)際感染劑量N0通過平板計(jì)數(shù)確定。感染后30 min棄去培養(yǎng)液，用PBS洗3次后加入含50 μg/mL慶大霉素的DMEM培養(yǎng)基，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h，棄培養(yǎng)液后洗滌3次，每孔加入1 mL滅菌去離子水充分吹吸混勻，使得細(xì)胞破裂，釋放出細(xì)菌，倍比稀釋后通過平板計(jì)數(shù)確定侵入細(xì)胞的細(xì)菌數(shù)N1。侵襲率IR= N1/N0×100%，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 小鼠毒力試驗(yàn) 將4周齡BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組，每組6只，于IVC籠具中飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境。分別挑取親本株10403S、缺失株ΔlisRK和回補(bǔ)株CΔlisRK單菌落于3 mL BHI培養(yǎng)基中，在37 ℃搖床中過夜培養(yǎng)，離心收集菌體，用PBS洗滌3次后，再用PBS重懸，倍比稀釋至合適的梯度備用。上述各組菌液經(jīng)腹腔注射途徑感染小鼠，0.2 mL/只(約106CFU)，通過平板計(jì)數(shù)法確定實(shí)際感染劑量。感染48 h后將小鼠脫頸處死，無菌剖檢采集肝臟和脾臟，置于研缽中，加入1 mL PBS進(jìn)行充分研磨，勻漿液經(jīng)倍比稀釋后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，確定感染小鼠肝臟和脾臟中的細(xì)菌載量。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)結(jié)果以3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.0軟件做圖，利用非配對(duì)單因素方差分析(One-Way ANOVA)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 缺失株與回補(bǔ)株的構(gòu)建

本研究利用同源重組技術(shù)構(gòu)建缺失株ΔlisRK，首先以10403S基因組為模板，分別擴(kuò)增得到lisRK基因的上游和下游同源臂片段，大小分別為639 bp和640 bp(圖1)，與預(yù)期一致；再以純化的上游和下游同源臂為模板，通過融合PCR擴(kuò)增得到大小為1 279 bp的融合同源臂片段(圖1)。融合的同源臂與BamHⅠ線性化的pKSV7重組連接后獲得重組質(zhì)粒pFL315，PCR鑒定大小為1 279 bp(圖1)。重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至單增李斯特菌10403S感受態(tài)細(xì)胞中，在41 ℃條件下傳代10～12次后利用旁側(cè)引物進(jìn)行PCR篩選重組成功的克隆，PCR鑒定大小為1 591 bp(圖1)；重組成功的克隆接種至BHI培養(yǎng)基中，于30 ℃條件下傳代消除質(zhì)粒，再利用旁側(cè)引物和質(zhì)粒上cat基因引物進(jìn)行PCR鑒定，親本株擴(kuò)增的片段大小為3 720 bp，缺失株片段大小為1 591 bp(圖1)，表明成功篩選到缺失株ΔlisRK。

M1，DL2000 DNA Marker；1，上游同源臂；2，下游同源臂；3，融合的上、下游同源臂；4～6，重組質(zhì)粒pFL315；7～8，重組成功的克??；M2,DL5000 DNA Mark;9，親本株10403S；10，缺失株ΔlisRK

PCR擴(kuò)增得到lisRK基因片段，大小2 150 bp(圖2),與pIMK2載體連接后得到回補(bǔ)質(zhì)粒，用質(zhì)粒引物pIMK2-fwd/rev和特異性引物pFL317-fwd/rev進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到大小分別為3 010 bp和2 150 bp的片段，顯示成功構(gòu)建回補(bǔ)質(zhì)粒(圖2)。將回補(bǔ)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入缺失株ΔlisRK感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆進(jìn)行PCR鑒定，得到2 150 bp大小的目的片段，結(jié)果顯示回補(bǔ)株CΔlisRK構(gòu)建成功(圖2)。

M，DL5000 DNA Marker；1～2，lisRK基因片段；3～5，質(zhì)粒引物鑒定lisRK回補(bǔ)質(zhì)粒；6～8，特異性引物鑒定lisRK回補(bǔ)質(zhì)粒；9～13，回補(bǔ)株CΔlisRK

2.2 lisRK基因缺失對(duì)單增李斯特菌抗應(yīng)激能力的影響

本研究利用pH 4.5、含5% NaCl和10 mmol/L H2O2的BHI的培養(yǎng)基評(píng)估LisRK是否介導(dǎo)單增李斯特菌對(duì)酸、堿滲透壓以及氧化條件等應(yīng)激環(huán)境的抵抗能力。結(jié)果顯示，親本株10403S、缺失株ΔlisRK和回補(bǔ)株CΔlisRK在正常BHI培養(yǎng)基中生長并無差異(圖3A)；在pH 4.5的BHI培養(yǎng)基中缺失株ΔlisRK的生長能力顯著弱于親本株，回補(bǔ)株CΔlisRK與親本株的生長能力相當(dāng)(圖3B)；在含5% NaCl及10 mmol/L H2O2的BHI培養(yǎng)基中單增李斯特菌生長速度較正常條件下慢，但親本株與缺失株的生長能力亦無顯著性差異(圖3C和3D)。為進(jìn)一步驗(yàn)證LisRK介導(dǎo)單增李斯特菌的抗酸應(yīng)激作用，比較10403S和ΔlisRK在致死性酸性條件下存活率發(fā)現(xiàn)，在pH 2.5的BHI培養(yǎng)基中應(yīng)激處理1 h，缺失株ΔlisRK的存活率(0.57%)極顯著低于親本株10403S(2.07%)和回補(bǔ)株CΔlisRK(1.97%)(P<0.01)；回補(bǔ)株與親本株的存活率則并無顯著性差異(P>0.05)(圖4)。

A，pH 7.0；B，pH 4.5；C，5% NaCl；D，10 mmol/L H2O2

*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)；無*，差異不顯著(P>0.05)。下同

2.3 lisRK基因缺失對(duì)單增李斯特菌侵襲能力的影響

本研究利用檢測親本株、 缺失株與回補(bǔ)株對(duì)腸上皮細(xì)胞Caco-2和胃腺癌細(xì)胞MGC803的侵襲能力，結(jié)果顯示，細(xì)菌與細(xì)胞孵育0.5 h后，缺失株ΔlisRK對(duì)Caco-2細(xì)胞的侵襲率(2.04%)極顯著低于親本株10403S(7.72%)與回補(bǔ)株CΔlisRK(6.92%)(P<0.01)；回補(bǔ)株CΔlisRK對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附率則與親本株并無顯著性差異(P>0.05)(圖5A)。MGC803細(xì)胞侵襲試驗(yàn)結(jié)果表明，缺失株ΔlisRK對(duì)MGC803細(xì)胞的侵襲率(0.13%)極顯著或顯著低于親本株10403S(0.29%)和回補(bǔ)株CΔlisRK(0.21%)(P<0.01；P<0.05)(圖5B)。

圖5 親本株10403S、缺失株ΔlisRK與回補(bǔ)株CΔlisRK對(duì)Caco-2細(xì)胞(A)和MGC803細(xì)胞(B)的侵襲率

2.4 lisRK基因缺失對(duì)單增李斯特菌致病力的影響

本研究比較了感染親本株、缺失株與回補(bǔ)株的小鼠肝臟和脾臟中的細(xì)菌載量，結(jié)果顯示，腹腔注射后48 h，感染缺失株ΔlisRK的小鼠肝臟中載菌量(7.42×107CFU)低于親本株(2.17×108CFU)和回補(bǔ)株CΔlisRK(2.88×108CFU)；缺失株在脾臟中載菌量(1.87×107CFU)亦低于親本株(5.58×107CFU)和回補(bǔ)株CΔlisRK(4.34×107CFU)，但均無顯著性差異(P>0.05)(圖6)，提示lisRK缺失可能減弱單增李斯特菌的致病性。

ns，差異不顯著(P>0.05)

3 討 論

作為一種食源性病原菌，單增李斯特菌對(duì)不利環(huán)境的適應(yīng)性和抵抗能力是其成功建立感染的前提[16-17]。TCS是細(xì)菌中重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，單增李斯特菌擁有多套TCS以應(yīng)對(duì)各種胞外信號(hào)刺激[18]。本研究利用同源重組技術(shù)首次整體敲除了LisRK系統(tǒng)，應(yīng)激生長和存活試驗(yàn)表明缺失lisRK基因顯著降低了單增李斯特菌在酸性環(huán)境中的生存能力，但不影響其在高滲和氧化應(yīng)激條件下的生長能力。這與Cotter等[19]的發(fā)現(xiàn)一致，在LO28菌株中轉(zhuǎn)座子插入lisK基因?qū)е缕湓趐H 3.5條件下的存活率顯著降低，表明LisRK可以介導(dǎo)單增李斯特菌的抗酸應(yīng)激作用。但Pontinen等[9]卻發(fā)現(xiàn)在菌株EGDe中敲除lisK基因并不影響該菌的抗酸應(yīng)激能力，這可能與菌株特性相關(guān)。已有研究表明，EGDe的抗酸應(yīng)激能力較其他代表菌株弱[20-21]。本研究中細(xì)胞侵襲試驗(yàn)表明，缺失lisRK基因顯著降低了對(duì)人源胃腺癌細(xì)胞MGC803和腸上皮細(xì)胞Caco-2的侵襲率。Aslan等[12]通過原子力顯微鏡發(fā)現(xiàn)了類似的表型，在LO28菌株中激活LisRK系統(tǒng)可以顯著增強(qiáng)該菌對(duì)玻璃界面的黏附能力，敲除lisR基因則顯著減弱該菌的黏附能力。表明LisRK可以影響單增李斯特菌的黏附與侵襲能力。在LO28菌株中，4 μg/mL頭孢呋辛刺激導(dǎo)致inlA和inlB等主要黏附侵襲相關(guān)基因表達(dá)水平顯著下調(diào)，lisR基因缺失則導(dǎo)致LO28對(duì)頭孢呋辛敏感性顯著增加[22]，在單增李斯特菌中對(duì)宿主細(xì)胞的黏附侵襲作用主要由內(nèi)化素InlA、InlB以及黏附相關(guān)蛋白LAP等分子介導(dǎo)[23-24]，但尚不清楚LisRK是否通過直接調(diào)控黏附與侵襲基因的表達(dá)介導(dǎo)單增李斯特菌的黏附侵襲作用。本研究中小鼠毒力試驗(yàn)顯示，經(jīng)腹腔注射感染后48 h，缺失株ΔlisRK在感染小鼠肝臟和脾臟中的載菌量均低于親本株和回補(bǔ)株，但差異均不顯著，提示LisRK可能影響單增李斯特菌對(duì)小鼠的致病性。本研究與Cotter等[19]發(fā)現(xiàn)在LO28菌株中單獨(dú)缺失lisK基因顯著降低該菌對(duì)小鼠的致病力不完全一致?？赡芘c試驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體差異較大有關(guān)，或者僅選擇感染后48 h這一個(gè)時(shí)間點(diǎn)不能全面反映小鼠體內(nèi)細(xì)菌數(shù)量的動(dòng)態(tài)水平，盡管之前的研究顯示，單增李斯特菌感染后24、48以及72 h小鼠體內(nèi)載菌量與其致病性正相關(guān)[25]。也有可能是菌株間差異所致，同樣基因在不同菌株中的作用并非相同：Cotter等[19]發(fā)現(xiàn)，在LO28中敲除lisK基因能顯著降低該菌在3.5%乙醇中的存活率，然而Pontinen等[9]發(fā)現(xiàn)在EGDe中敲除lisK基因并不影響該菌在3.5%乙醇中的生長能力。 還可能與不同TCS間相互作用有關(guān)：Alistair等[14]發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的TCS并非完全一一對(duì)應(yīng)，不同TCS組分之間存在互作并交叉激活的情況；Su等[26]發(fā)現(xiàn)在沙門氏菌中，PhoP能被CheR甲基化，突變PhoR上甲基化位點(diǎn)導(dǎo)致其不能磷酸化激活而減弱該菌的毒力。此外，Brunhede等[27]發(fā)現(xiàn)單獨(dú)敲除lisR或lisK基因?qū)卧隼钏固卦谕寥乐羞m應(yīng)性的影響并非完全一致。因此，尚不能確定缺失完整LisRK系統(tǒng)與缺失LisK組分對(duì)單增李斯特菌的毒力影響不一致是否由于LisRK與其他TCS間互作所致。

4 結(jié) 論

本研究以參考菌株10403S為親本株構(gòu)建了雙元調(diào)控系統(tǒng)lisRK基因缺失株，證實(shí)LisRK缺失顯著降低單增李斯特菌的酸應(yīng)激存活能力，以及對(duì)胃腺癌細(xì)胞MGC803和腸上皮細(xì)胞Caco-2的侵襲率，具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。