朱家平， 肖 琦， 錢(qián)雯嫻， 趙霞玲， 張馮禧， 尹力鴻， 溫立斌， 索朗斯珠， 何孔旺

(1.西藏農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，西藏林芝 860000；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210014)

豬圓環(huán)病毒(PCV)為單鏈負(fù)股環(huán)狀且無(wú)囊膜的DNA病毒，屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，結(jié)構(gòu)為20面對(duì)稱(chēng)體，是現(xiàn)已知的最小的動(dòng)物病毒。豬圓環(huán)病毒可分為4個(gè)型：1974年由Tischer等首次分離得到的無(wú)致病性的豬圓環(huán)病毒1型(PCV-1)；Ellis等在加拿大西部豬群中分離得到的 PCV-2；2015年美國(guó)北卡羅來(lái)納州學(xué)者在豬群中發(fā)現(xiàn)的PCV-3；2019年在湖南病豬中發(fā)現(xiàn)的新的圓環(huán)病毒，暫定為豬圓環(huán)病毒4型(PCV-4)。其中，PCV-2能夠引起嚴(yán)重的豬圓環(huán)病毒病，損害機(jī)體免疫系統(tǒng)，增大混合感染的概率，且PCV-3與豬圓環(huán)病毒相關(guān)性疾病的發(fā)生聯(lián)系緊密。在我國(guó)，于2000年郎洪武等首次分離得到PCV-2；PCV-3于2017年首次被發(fā)現(xiàn)，之后在遼寧省、江西省、江蘇省均有報(bào)道。豬圓環(huán)病毒病在世界各個(gè)國(guó)家都有報(bào)道，我國(guó)也是感染較為嚴(yán)重的國(guó)家，且存在PCV-2與PCV-3混合感染的情況。但目前檢測(cè)PCV-2和PCV-3的PCR方法局限于單一PCR，雙重PCR同時(shí)檢測(cè)PCV-2和PCV-3的報(bào)道還很少。藏豬是主要分布于我國(guó)青藏高原的小型豬種，具有適應(yīng)性強(qiáng)、抗病耐粗的特點(diǎn)；目前很少有關(guān)于西藏地區(qū)藏豬圓環(huán)病毒的報(bào)道。因此，建立一種快捷、靈敏、可靠的雙重PCR方法檢測(cè)并區(qū)分PCV-2和PCV-3，對(duì)臨床診斷和防控豬圓環(huán)病毒病具有深遠(yuǎn)意義。本試驗(yàn)旨在建立一種具有較高靈敏度的、能夠同時(shí)檢測(cè)PCV-2與PCV-3的雙重PCR方法，并對(duì)西藏地區(qū)臨床健康藏豬進(jìn)行檢測(cè)，從而為西藏地區(qū)PCV的流行病學(xué)調(diào)查提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒株、菌株與臨床樣品

大腸桿菌Trans5α、PCV-2和PCV-3陽(yáng)性病料、PCV-1、豬瘟病毒(CSFV)、豬呼吸道疾病綜合征(PRRSV)、偽狂犬病病毒(PRV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)等常見(jiàn)豬源病原均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存。47份藏豬糞便樣品于2020年6月采集于西藏林芝周邊地區(qū)。

1.2 試驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn)

本試驗(yàn)于2020年7—10月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所、農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.3 主要試劑

Green Taq Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；DL-2000 DNA marker、pClone007 Simple Vector Kit、瓊脂糖購(gòu)自北京擎科生物科技有限公司(南京)；DNA提取試劑盒購(gòu)自廣州美基生物科技有限公司；膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Omega公司；引物合成和測(cè)序均由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成

用筆者所在實(shí)驗(yàn)室已有的引物序列檢測(cè) PCV-2 和PCV-3，PCV-2檢測(cè)引物為PCV-2-SF(5′-G G T T A G A C G G A T A T T G T A G T C C-3′)和 PCV-2-SR(5′-C G T T T C C G C A G A A G A A G A C A C-3′)，擴(kuò)增長(zhǎng)度為630 bp；PCV-3檢測(cè)引物為PCV-3-A2-U(5′-C A G C T G T G G G C C T C C T A A T G A A T-3′)和 PCV-3-A2-L(5′-C C C C C G T G G C T T G A A A T A C A G-3′)，擴(kuò)增長(zhǎng)度為932 bp。

1.5 臨床樣品處理與病毒DNA提取

取適量糞便裝入干凈的EP管中，向管中加入2倍體積的0.01 mol/L無(wú)菌PBS(pH值7.0)，制成懸浮液，反復(fù)凍融3次；將凍融的樣品于4 ℃下 10 000離心5 min，取上清于EP管中，用Magen生物公司的組織DNA抽提試劑盒，按說(shuō)明書(shū)中的步驟提取樣品核酸作為模板。

1.6 單一PCR擴(kuò)增

以提取的DNA為模板，用PCV-2-SF、PCV-2-SR、和PCV-3-A2-U、PCV-3-A2-L引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。2型最適PCR體系為25 μL：2 μL模板，1 μL的上游引物，1 μL的下游引物，2×mix 12.5 μL，無(wú)菌水8.5 μL；最適反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。3型最適PCR體系為25 μL：1 μL模板，1 μL的上游引物，1 μL 的下游引物，2×mix 12.5 μL，無(wú)菌水9.5 μL；最適反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，53.6 ℃退火30 s，72 ℃延伸65 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并觀(guān)察擴(kuò)增結(jié)果。

1.7 PCV-2和PCV-3陽(yáng)性質(zhì)粒的制備

用引物PCV-2-SF、PCV-2-SR、和PCV-3-A2-U、PCV-3-A2-L陽(yáng)性樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到相應(yīng)的特異性條帶，將目的條帶進(jìn)行切膠回收，用pClone007 Simple Vector Kit 進(jìn)行TA克隆，將克隆送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，并將含有目的片段的質(zhì)粒作為陽(yáng)性質(zhì)粒。

1.8 雙重PCR擴(kuò)增條件篩選

在單重PCR的基礎(chǔ)上，篩選雙重PCR的最適退火溫度、循環(huán)數(shù)、引物濃度，確定雙重PCR的最適反應(yīng)條件，并驗(yàn)證其特異性和敏感性。

1.9 雙重PCR的敏感性試驗(yàn)

計(jì)算PCV-2、PCV-3的初始質(zhì)粒濃度，并將其進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)靡呀⒑玫淖钸m單重PCR條件和雙重PCR條件對(duì)不同濃度的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行檢測(cè)，來(lái)確定雙重PCR的敏感性。

1.10 雙重PCR的特異性試驗(yàn)

用建立的方法對(duì)PCV-2、PCV-3和PCV-2與PCV-3混合物以及實(shí)驗(yàn)室保存的其他常見(jiàn)病原進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證此方法的特異性。

1.11 雙重PCR重復(fù)性試驗(yàn)

在摸索雙重PCR最適條件時(shí)，不同條件均做3組重復(fù)，降低試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偶然性，并用建立的方法對(duì)3份PCV-2陽(yáng)性樣品DNA、3份PCV-2陰性樣品DNA、3份PCV-3陽(yáng)性樣品DNA、3份PCV-3陰性樣品DNA等一些其他病原檢測(cè)1次/周，重復(fù)檢測(cè)3次，驗(yàn)證雙重PCR的重復(fù)性。

1.12 臨床檢測(cè)與統(tǒng)計(jì)分析

收集2020年6月西藏林芝市周邊地區(qū)藏豬糞便47份，用Magen生物公司的DNA抽提試劑盒按照說(shuō)明書(shū)對(duì)其進(jìn)行DNA提取，用單重PCR和建立的雙重PCR的方法對(duì)樣品中PCV-2和PCV-3進(jìn)行檢測(cè)，并用Rstudio 1.2.5033軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCV-2和PCV-3陽(yáng)性質(zhì)粒的制備

用PCV-2和PCV-3的引物對(duì)病料核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到630、932 bp特異性條帶，與預(yù)期相符。切膠回收后進(jìn)行TA克隆、質(zhì)粒提取，再次PCR驗(yàn)證均可獲得特異性條帶，表明成功構(gòu)建 PCV-2 和PCV-3陽(yáng)性質(zhì)粒(圖1)。

2.2 雙重PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化

2.2.1 雙重PCR退火溫度的優(yōu)化 以PCV-2和PCV-3單重PCR檢測(cè)方法為基礎(chǔ)，選取合適的模板濃度，設(shè)置4個(gè)溫度(53、54、55、56 ℃)作為退火溫度進(jìn)行雙重PCR的擴(kuò)增，用1%瓊脂糖凝膠電泳觀(guān)察擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙重PCR在54 ℃時(shí)PCV-2和PCV3的擴(kuò)增效果最好，故確定最適退火溫度為 54 ℃(圖2)。

2.2.2 雙重PCR循環(huán)數(shù)的優(yōu)化 以54 ℃為雙重PCR的退火溫度，選取合適的模板濃度，設(shè)置3個(gè)不同循環(huán)(30、35、40)對(duì)雙重PCR最適循環(huán)數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在循環(huán)數(shù)為40時(shí)條帶亮度較為合適，因此選用40個(gè)循環(huán)為PCR的最適循環(huán)數(shù)(圖3)。

2.2.3 雙重PCR引物濃度的優(yōu)化 設(shè)置0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 μL等5個(gè)引物量(上下游引物濃度均為1×10pmol/μL)對(duì)PCV-2/3單重PCR的最適引物量進(jìn)行摸索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCV-2和 PCV-3 均在引物量為0.5、1.0、1.5 μL時(shí)條帶已足夠亮(圖4、圖5)。以0.5、1.0、1.5 μL為雙重PCR的引物量，以棋盤(pán)滴定法找到雙重PCR中 PCV-2 與PCV-3初始最適引物體積比例為2.0、0.5 μL(圖6)。并按照該引物體積比例設(shè)置3組引物量(1.2 μL ∶0.3 μL；1.6 μL ∶0.4 μL；2.0 μL ∶0.5 μL)確定雙重PCR中PCV-2與PCV-3的最終最適引物體積比例為1.6 μL ∶0.4 μL(圖7)。

2.3 雙重PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果

將70.7 ng/μL PCV-2、62.5 ng/μL PCV-3的陽(yáng)性質(zhì)粒均稀釋成10拷貝數(shù)/μL，按比例混合稀釋為10拷貝數(shù)/μL，之后進(jìn)行倍比稀釋來(lái)進(jìn)行PCR的敏感性試驗(yàn)。經(jīng)敏感度測(cè)定發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化后的雙重PCR敏感度和其單一PCR的敏感度相同，均為10拷貝數(shù)/μL，說(shuō)明建立的雙重PCR檢測(cè)方法具有很高的敏感度(圖8、圖9、圖10)。

2.4 雙重PCR特異性試驗(yàn)

以?xún)?yōu)化后的雙重PCR對(duì)PCV-2、PCV-3、PCV-2+ PCV-3以及PCV-1、CSFV、PPV、PRV、PRRSV、PEDV進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，本試驗(yàn)建立的方法對(duì)PCV-2、PCV-3、PCV-2+PCV-3均能擴(kuò)增出目的條帶，對(duì)其余病原均無(wú)特異性目的條帶，雖PRV出現(xiàn)較弱非特異性條帶，但與目的條帶距離較大，并不影響對(duì)PCV-2與PCV-3的判定結(jié)果。表明建立的雙重PCR的方法具有較好的特異性(圖11)。

2.5 雙重PCR重復(fù)性試驗(yàn)

在摸索雙重PCR最適條件時(shí)，3組重復(fù)均大致相同，且利用建立的雙重PCR方法分別對(duì)PCV-2陽(yáng)性樣品DNA、PCV-2陰性樣品DNA、PCV-3陽(yáng)性樣品DNA、PCV-3陰性樣品DNA以及其他病原進(jìn)行檢測(cè)，3次重復(fù)結(jié)果一致，說(shuō)明建立的PCV-2、PCV3雙重PCR方法具有很好的重復(fù)性。

2.6 臨床檢測(cè)與統(tǒng)計(jì)分析

以單重PCR和建立的雙重PCR分別對(duì)采集的47份臨床樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)雙重PCR與單重PCR結(jié)果一致。利用RStudio對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析并做可視化處理，PCV-2、PCV-3的陽(yáng)性率分別為38.30%(18/47)、12.77%(6/47)，混合感染率為10.64%(5/47)，單患PCV-2率為27.7%(13/47)，單患PCV-3率為2.1%(1/47)，PCV-2和PCV3雙陰性率為59.6%(28/47)(圖12)。

3 討論與結(jié)論

自PCV-2和PCV-3報(bào)道以來(lái)，國(guó)內(nèi)外均有豬群感染的情況，且感染率居高不下，存在混合感染現(xiàn)象。PCV-2和PCV-3在臨床上均表現(xiàn)為繁殖障礙、豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)、豬皮炎腎病綜合征(PNDS)、能夠引起豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、仔豬先天性震顫、增生性壞死性肺炎(PNP)等，在臨床上無(wú)法明確區(qū)分PCV-2和PCV-3。另有報(bào)道在無(wú)臨床癥狀的豬和犬中檢測(cè)到PCV-3，且PCV-3能跨種間傳播，在牛、蜱、鼠中亦能檢測(cè)到，但PCV-2和PCV-3無(wú)交叉免疫保護(hù)，PCV-2的疫苗無(wú)法防止PCV-3的感染，豬圓環(huán)病毒不僅給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重?fù)p失，也可為其他動(dòng)物的健康帶來(lái)嚴(yán)重威脅，增加防控難度。因此，建立敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好的診斷方法對(duì)PCV-2和PCV-3臨床檢測(cè)與防控具有重要意義。

PCR為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的常用技術(shù)，肖琦等分別建立了PCV-2和PCV-3 PCR檢測(cè)技術(shù)，但單重PCR技術(shù)1次只能檢測(cè)1種病原。多重PCR方法于1988年提出，該方法在疾病混合感染方面具有快速、省時(shí)、省力的優(yōu)勢(shì)，既具有單項(xiàng)PCR的敏感性和特異性，又可節(jié)省試劑，1次檢測(cè)多個(gè)病原體或多個(gè)基因型，具有很高的實(shí)用性。季程遠(yuǎn)等建立的雙重PCR方法中PCV-2和PCV-3檢測(cè)敏感度分別為1×10、1×10拷貝數(shù)/μL，6.1×10、8.0×10拷貝數(shù)/μL。本研究通過(guò)對(duì)PCR不同條件的優(yōu)化和反復(fù)試驗(yàn)，最終建立了簡(jiǎn)單快速、靈敏穩(wěn)定、準(zhǔn)確可靠的PCV-2和PCV-3雙重PCR方法，其靈敏度和單重PCR相同均為1×10拷貝數(shù)/μL，且高于已報(bào)道的PCV-2、PCV-3雙重方法的敏感度。

目前，我國(guó)PCV-2和PCV-3在很多省份均有報(bào)道。PCV-2感染率為23.53%～81.40%(青海省為23.53%、云南省為36.05%、江蘇省為38.00%、吉林省為38.50%、京津冀為56.70%、廣西壯族自治區(qū)為65.10%、新疆維吾爾自治區(qū)為70.71%、四川省為74.48%、河南省為81.40%)；PCV-3感染率為11.10%～38.3%(廣西壯族自治區(qū)為11.10%、四川省為11.19%、江蘇省為12.67%、云南省為17.44%、青海省為18.38%、新疆維吾爾自治區(qū)為20.00%，河南省為30.23%，京津冀為38.30%)，混合感染率為 6.64%～30.23%(廣西壯族自治區(qū)為7.90%，京津冀為17.50%，青海省為7.35%，河南省為30.23%，四川省為6.64%，云南省為15.12%)。本研究建立的雙重PCR方法對(duì)臨床健康的藏豬糞便進(jìn)行豬圓環(huán)病毒檢測(cè)，結(jié)果PCV-2感染率為38.3%(18/47)，PCV-3感染率為12.8%(6/47)，混合感染率為10.6%(5/47)。從目前我國(guó)PCV-2和PCV-3的感染類(lèi)型來(lái)看，PCV-2、PCV-3 陽(yáng)性率大致為53%、20%，混合感染率為14.12%左右，可見(jiàn)PCV-2、PCV-3在我國(guó)已普遍流行，且PCV-3多與PCV-2以混合感染的形式存在。從PCV-2和PCV-3感染地區(qū)來(lái)看，中國(guó)北部地區(qū)PCV-2和PCV-3陽(yáng)性率較高，這可能與南北方氣候差異有關(guān)。本試驗(yàn)以西藏林芝周邊臨床健康豬為檢測(cè)對(duì)象，對(duì)其糞便進(jìn)行檢測(cè)。整體來(lái)看，西藏林芝地區(qū)PCV-2和PCV-3感染率相對(duì)較低，這可能與藏豬的散養(yǎng)模式、耐受能力和高原氣候有關(guān)，且PCV-3多與PCV-2混合感染，但也存在PCV-3單獨(dú)感染的現(xiàn)象，存在隱性感染的可能，因此西藏養(yǎng)殖戶(hù)應(yīng)加強(qiáng)對(duì)豬圓環(huán)病毒的防控意識(shí)。