楊艷北， 許 晶， 馬荊鄂， 馮育林， 孫 勇

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)博士后流動(dòng)站/正邦集團(tuán)有限公司博士后工作站，江西南昌 330000；2.南昌師范學(xué)院生物技術(shù)研究院/江西省地方雞種遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330000； 3.南昌師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江西南昌 330000)

沼澤紅假單胞菌是光合細(xì)菌的代表菌株之一，屬于益生菌的一種，廣泛作為動(dòng)物飼料添加劑和水質(zhì)凈化劑使用。在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，沼澤紅假單胞菌菌株種類雜，效果不穩(wěn)定，相似菌株間凈水功能差異大。因此，從功能模體水平上，探索沼澤紅假單胞菌相似菌株間功能差異的機(jī)理，對(duì)于沼澤紅假單胞菌相似菌株的實(shí)際應(yīng)用具有重要的參考價(jià)值。模體也譯為基序，是DNA或蛋白質(zhì)具有的局部保守序列區(qū)域，一般也被稱為功能模體或結(jié)構(gòu)模體，相當(dāng)于超二級(jí)結(jié)構(gòu)，它是蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位和功能單位，決定著蛋白質(zhì)的主要功能。蛋白質(zhì)具有結(jié)構(gòu)域和生物功能位點(diǎn)，功能相近的蛋白質(zhì)或同類蛋白質(zhì)家族成員表現(xiàn)出該功能所必需的模體，這個(gè)模體不僅反映蛋白質(zhì)的功能位點(diǎn)，而且也作為蛋白質(zhì)家族的識(shí)別信號(hào)。Prosite(https：//prosite.expasy.org/)是蛋白質(zhì)家族和結(jié)構(gòu)域的數(shù)據(jù)庫(kù)，在Prosite數(shù)據(jù)庫(kù)中，一些有重要生物學(xué)意義的氨基酸序列可以被概括成規(guī)則的表達(dá)式，稱作模式，被用于模體的識(shí)別，這些模式均具有實(shí)驗(yàn)上證實(shí)的結(jié)構(gòu)或功能。

Python是一種功能強(qiáng)大的多用途編程語(yǔ)言，可用于生物信息學(xué)分析，尤其Biopython為各式各樣的生物信息學(xué)問(wèn)題提供Python庫(kù)。Python有一套自身的語(yǔ)法，使它成為一套可以自行編譯、開發(fā)的完美語(yǔ)言。Python是一種強(qiáng)大的編程語(yǔ)言，適合腳本編寫。本研究以Prosite數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的用于識(shí)別蛋白質(zhì)組序列模體的模式文件為基礎(chǔ)，利用循環(huán)遍歷算法和Python特有的字典數(shù)據(jù)格式，編寫腳本test.py和difference analysis.py，篩選和分析沼澤紅假單胞菌CGA009和YSC3差異功能模體，探索沼澤紅假單胞菌相似菌株間功能差異的機(jī)理。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2021年在南昌師范學(xué)院生物技術(shù)研究院實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

試驗(yàn)中沼澤紅假單胞菌CGA009和YSC3蛋白質(zhì)組序列來(lái)自于美國(guó)國(guó)家生物信息中心(NCBI)中已登錄的序列，下載文件分別為GCF_000195775.1_ASM19577v1_protein.faa、GCF_013415845.1_ASM1341584v1_protein.faa。試驗(yàn)中用于識(shí)別蛋白質(zhì)組序列模體的模式文件來(lái)自于Prosite數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//prosite.expasy.org/)，下載文件為prosite. dat。

1.2 研究方法

第1步：在Windows操作系統(tǒng)下安裝Python 3.7.0編程軟件和geany-1.33文本編輯器。

第2步：打開蛋白質(zhì)組序列文件GCF_000195775.1_ASM19577v1_protein.faa，內(nèi)容復(fù)制到新的文本文件protein.txt，儲(chǔ)存格式為fasta。打開模體文件prosite.dat，內(nèi)容復(fù)制到新的文本文件prosite.txt。將上述3個(gè)文件置于同一個(gè)文件夾內(nèi)。創(chuàng)建Python運(yùn)行腳本，命名為test.py。

第3步：打開蛋白質(zhì)組序列文件GCF_013415845.1_ASM1341584v1_protein.faa，內(nèi)容復(fù)制到新的文本文件protein.txt，儲(chǔ)存格式為fasta。打開模體文件prosite.dat，內(nèi)容復(fù)制到新的文本文件prosite.txt。將上述3個(gè)文件置于同一個(gè)文件夾內(nèi)。創(chuàng)建Python運(yùn)行腳本，命名為test.py。

第4步：Python運(yùn)行腳本test.py具體代碼如下(注意代碼縮進(jìn)，“#”代表代碼的注釋)。

#導(dǎo)入re模塊

import re

#讀取功能模體,選取PATTERN模式,存儲(chǔ)到新文件中

f = open("prosite_new.txt","a+")

prosite = open("prosite.txt").read()

separator_1 = re.compile(′∥′)

prosite_group = separator_1.split(prosite)

for group in prosite_group:

if "PATTERN" in group:

f.write(str(group))

#讀取新文件中模體的登錄(AC)號(hào)，蛋白名稱和序列,存儲(chǔ)到字典prosite_dict

prosite_seq = []

name_motif = []

AC = []

with open(′prosite_new.txt′) as file_object:

for line in file_object:

if line.startswith(′DE′):

name_motif.append(line[5:-2])

if line.startswith(′AC′):

AC.append(line[5:-2])

if line.startswith(′PA′):

prosite_seq.append(line[5:-1])

prosite_seq_str = "".join(prosite_seq)

prosite_seq_motif = prosite_seq_str.split(".")

prosite_seq_motif.pop()

prosite_key_list = [(i, j) for i, j in zip(AC, name_motif)]

prosite_dict = {i : j for i, j in zip(prosite_key_list, prosite_seq_motif)}

#讀取蛋白質(zhì)序列，儲(chǔ)存到字典protein_dict

protein = open("protein.txt").read()

separator = re.compile(′>′)

protein_group = separator.split(protein)

protein_seq = []

name_protein = []

for group in protein_group:

group_new = group.split(" ")

name_protein.append(group_new[0])

protein_seq.append(group_new[1:])

for i in name_protein:

if i == "":

name_protein.remove(i)

protein_seq_new = []

for i in protein_seq:

j = "".join(i)

protein_seq_new.append(j)

protein_seq_new.pop(0)

protein_dict = {i : j for i, j in zip(name_protein, protein_seq_new)}

f1 = open("檢測(cè)結(jié)果.txt", "a+")

for prosite_dict_key, pattern in prosite_dict.items():

#將Prosite正則表達(dá)式轉(zhuǎn)換為Python正則表達(dá)式

pattern = pattern.replace(′{′, ′[^′)

pattern = pattern.replace(′}′, ′]′)

pattern = pattern.replace(′(′, ′{′)

pattern = pattern.replace(′)′, ′}′)

pattern = pattern.replace(′-′, '')

pattern = pattern.replace(′x′, ′.′)

pattern = pattern.replace(′>′, ′$′)

pattern = pattern.replace(′<′, ′^′)

pattern_motif = re.compile(pattern)

for protein_dict_key, protein_seq_group in protein_dict.items():

match_all = pattern_motif.findall(str(protein_seq_group))

match_iter = pattern_motif.finditer(str(protein_seq_group))

if match_all:

f1.write(" " + "**************************" + " " )

f1.write("Prosite的AC號(hào)和功能模體名稱： " +

str(prosite_dict_key) + " ")

f1.write("匹配模式： " + str(pattern) + " ")

f1.write("蛋白質(zhì)ID號(hào)和名稱： " + str(protein_dict_key) + " ")

f1.write("蛋白質(zhì)序列： " + str(protein_seq_group) + " ")

f1.write(" ")

for t in match_iter:

f1.write("蛋白質(zhì)中的匹配序列：" + str(t.group()) + " ")

f1.write("蛋白質(zhì)中的起始位置： " + str(t.start()) + " ")

f1.write("蛋白質(zhì)中的終止位置： " + str(t.end())+ " ")

f1.write(" " + "**************************" + " ")

第5步：將上述軟件運(yùn)行后，獲得的2個(gè)"檢查結(jié)果.txt"文件，分別命名為analysis _1.txt、analysis _2.txt。將上述2個(gè)文件置于同一個(gè)文件夾內(nèi)。創(chuàng)建Python運(yùn)行腳本，命名為difference analysis.py。

第6步：Python運(yùn)行腳本difference analysis.py具體代碼如下(注意代碼縮進(jìn)，"#"代表代碼的注釋)。

#創(chuàng)建文件

f_0_1 = open("1相同2結(jié)果.txt","a+")

f_0_2 = open("2相同1結(jié)果.txt","a+")

f_1_1 = open("1差異2結(jié)果.txt","a+")

f_1_2 = open("2差異1結(jié)果.txt","a+")

#讀取文件內(nèi)容

f_2 = open("analysis_1.txt").readlines()

f_3 = open("analysis_2.txt").readlines()

#篩選差異功能模體并儲(chǔ)存在新文件中

for line in f_2:

if "Prosite的AC號(hào)和功能模體名稱：" in line:

if line in f_3:

f_0_1.write(line)

else:

f_1_1.write(line)

for line in f_3:

if "Prosite的AC號(hào)和功能模體名稱：" in line:

if line in f_2:

f_0_2.write(line)

else:

f_1_2.write(line)

2 結(jié)果與分析

2.1 Python腳本運(yùn)行結(jié)果

Python運(yùn)行腳本test.py后，在2個(gè)不同的文件夾內(nèi)分別自動(dòng)創(chuàng)建“檢測(cè)結(jié)果.txt”文本文件，運(yùn)行結(jié)果見圖1(文件過(guò)大，只顯示部分運(yùn)行結(jié)果)。輸出結(jié)果包括：(1)Prosite的AC號(hào)和模體名稱；(2)匹配模式(Python正則表達(dá)式)；(3)蛋白質(zhì)ID號(hào)(NCBI)和名稱；(4)蛋白質(zhì)序列；(5)蛋白質(zhì)中的匹配序列；(6)蛋白質(zhì)中的起始位置；(7)蛋白質(zhì)中的終止位置。Python運(yùn)行腳本difference analysis.py后，自動(dòng)創(chuàng)建含有分析結(jié)果的新文件(1相同2結(jié)果.txt、2相同1結(jié)果.txt、1差異2結(jié)果.txt、2差異1結(jié)果.txt)，見圖2。輸出結(jié)果包括 Prosite的AC號(hào)和模體名稱。

2.2 沼澤紅假單胞菌CGA009和YSC3差異功能模體分析

沼澤紅假單胞菌CGA009與YSC3比較，獨(dú)有14種功能模體。沼澤紅假單胞菌YSC3與CGA009比較，獨(dú)有5種功能模體見表1。

表1 沼澤紅假單胞菌CGA009和YSC3差異功能模體

3 討論與結(jié)論

本研究編寫的Python腳本不僅適用于沼澤紅假單胞菌的研究，也廣泛適用于細(xì)菌、真菌、動(dòng)物、植物等所有物種，用于篩選相似物種間的差異功能模體，探索相似物種間功能差異的機(jī)理。

沼澤紅假單胞菌CGA009與YSC3比較，獨(dú)有14種功能模體。核糖核苷酸還原酶是DNA 合成和修復(fù)的關(guān)鍵酶和限速酶，對(duì)細(xì)胞的增殖和分化起著調(diào)控作用，在幾乎所有生物生長(zhǎng)和繁殖的生命活動(dòng)中起著非常重要的作用。DNA聚合酶是催化DNA精確復(fù)制的關(guān)鍵酶。異檸檬酸裂解酶是乙醛酸支路代謝中的關(guān)鍵酶，催化異檸檬酸轉(zhuǎn)化為琥珀酸和乙醛酸，乙醛酸支路是三羧酸循環(huán)的替代支路?？缒ねǖ赖鞍资菣M跨質(zhì)膜的親水性通道，允許適當(dāng)大小的離子順濃度梯度通過(guò)，包括離子通道、孔蛋白、水孔蛋白等。胰蛋白酶抑制劑是對(duì)胰蛋白酶具有抑制作用的一類物質(zhì)，在動(dòng)物、植物和微生物中都有發(fā)現(xiàn)，在微生物中，胰蛋白酶抑制劑主要來(lái)源于酵母菌、鏈霉菌屬等。胰蛋白酶抑制劑屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族，其分子的活性部位是賴氨酸，主要與胰蛋白酶等酶的絲氨酸結(jié)合，使其失活，起到抑制作用。SASP蛋白與雙鏈DNA結(jié)合后，導(dǎo)致DNA構(gòu)象變化，保護(hù)DNA骨架結(jié)構(gòu)免受化學(xué)試劑或酶的裂解，使DNA對(duì)紫外線具有高抗性。位點(diǎn)特異性重組在原核生物DNA重排中起著重要作用。位點(diǎn)特異性重組中，DNA節(jié)段的相對(duì)位置發(fā)生移動(dòng)，從而使DNA序列發(fā)生重排。脯氨酰內(nèi)肽酶廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)。脯氨酸內(nèi)肽酶是一類能夠特異性水解多肽鏈中脯氨酸殘基羧基端的內(nèi)切酶，是絲氨酸蛋白酶家族成員之一，其能有效降解小于30個(gè)含有脯氨酸殘基的多肽鏈，脯氨酸內(nèi)肽酶能特異性地水解許多含脯氨酸的多肽類神經(jīng)遞質(zhì)和激素。甘氨酰自由基酶共享以甘氨酸為中心的保守區(qū)域，參與多種功能，例如核苷酸、丙酮酸和甲苯的代謝等。乙二醛酶Ⅰ(又稱乳酰谷胱甘肽裂解酶)催化乙二醛途徑的第一步，即催化甲基乙二醛和谷胱甘肽轉(zhuǎn)化為- 乳酰谷胱甘肽，然后再由乙二醛酶Ⅱ?qū)⒌孜? 乳酰谷胱甘肽轉(zhuǎn)化為乳酸。乙二醛酶Ⅰ是普遍存在的一種酶，序列很保守。甲基乙二醛破壞細(xì)胞平衡，具有毒性，乙二醛酶系統(tǒng)能夠清除過(guò)量的甲基乙二醛，維持細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)平衡。核糖體蛋白參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成。NADH脫氫酶參與呼吸鏈反應(yīng)。吡咯烷酮羧酸肽酶(又稱焦谷氨酰胺基肽酶)是從蛋白質(zhì)的-末端去除焦谷胺酸的酶，存在于細(xì)菌和古細(xì)菌中。沼澤紅假單胞菌CGA009獨(dú)有的14種功能模體，功能主要集中在：(1)DNA 復(fù)制、合成、修復(fù)、重排和保護(hù)；(2)蛋白質(zhì)合成；(3)呼吸鏈的電子轉(zhuǎn)移；(4)細(xì)胞的增殖和分化；(5)生長(zhǎng)和繁殖；(6)代謝途徑的補(bǔ)充；(7)離子運(yùn)輸；(8)清除毒性物質(zhì)甲基乙二醛。

沼澤紅假單胞菌YSC3與CGA009比較，獨(dú)有5種功能模體。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向序列是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白上的非常保守的靶向序列。類血紅素結(jié)構(gòu)域能與多種分子和蛋白質(zhì)結(jié)合。多銅氧化酶含有多個(gè)銅結(jié)合中心，催化有機(jī)底物使其氧化，參與微生物對(duì)重金屬銅的抗性，降解多種生物胺的活性。DNA甲基化酶識(shí)別DNA的特定序列，并使該序列中的胞嘧啶甲基化，保護(hù)細(xì)胞自身的DNA不被限制性內(nèi)切酶破壞。視蛋白是一種膜蛋白，有7個(gè)跨膜區(qū)，屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族。視蛋白廣泛分布于動(dòng)物和微生物中，是一種重要的感光物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)生物節(jié)律和光周期等多種功能。沼澤紅假單胞菌YSC3獨(dú)有的5種功能模體，功能主要集中在：(1)對(duì)重金屬銅的抗性；(2)降解生物胺；(3)調(diào)節(jié)生物節(jié)律和光周期。

沼澤紅假單胞菌CGA009對(duì)紫外線和化學(xué)試劑具有抵抗能力，DNA骨架結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，生長(zhǎng)和繁殖性能更強(qiáng)。沼澤紅假單胞菌YSC3，對(duì)光照反應(yīng)更加敏感，對(duì)重金屬銅具有抵抗能力，能夠降解生物胺，生存能力更強(qiáng)。本研究編寫的Python腳本，用于篩選相似物種間差異功能模體，探索相似物種間功能差異的機(jī)理，該腳本適用于所有物種。