葛金濤， 王江英， 湯雪燕， 騰年軍， 朱朋波， 孫明偉， 趙統(tǒng)利， 邵小斌

(1.連云港市農(nóng)業(yè)科學院，江蘇連云港 222000； 2.南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院，江蘇南京 210095)

百合是百合科百合屬多年生草本球根植物，因其花姿雅致、葉片翠綠、莖稈挺直，常被作為鮮切花生產(chǎn)銷售，目前已成為我國四大鮮切花之一，尤其在北方地區(qū)通過日光溫室生產(chǎn)切花百合用于年宵花銷售，具有較高的經(jīng)濟價值。在切花百合的生產(chǎn)過程中，部分品種由于缺鈣會導致葉燒病的發(fā)生，其癥狀表現(xiàn)為在百合生長至30～40 cm，花蕾出現(xiàn)前，頂部6～10張新葉離葉尖2 cm處出現(xiàn)灰白色病斑，后期逐漸向葉尖擴展，最后變成焦枯狀，有學者推測細胞膜的不穩(wěn)定是導致葉燒病發(fā)生的原因。

細胞膜的主要成分是磷脂，磷脂構成的磷脂雙分子層不僅是分隔細胞質與外界環(huán)境的屏障，還能夠感受外界刺激，產(chǎn)生信號傳遞物質。磷脂酶(phospholipase)是生物體內負責磷脂代謝和生物合成的一類酶。磷脂酶根據(jù)其催化反應的對象分為5類，分別是磷脂酶A1(PLA1)、磷脂酶A2(PLA2)、溶血磷脂酶(PLB)、磷脂酶C(PLC)和磷脂酶D(PLD)，在植物中主要為PLA1、PLA2、PLC和PLD這4類。磷脂酶幾乎參與植物體所有的生命階段，尤其在響應外界環(huán)境刺激中起著重要的作用。因此，研究其作用機制已成為近年來生物學重要且發(fā)展最迅速的領域之一。目前，磷脂酶基因已在許多植物中得到克隆和鑒定，但在百合中尚未開展相關研究。本研究利用Illumina測序對百合正常葉片和葉燒病葉片進行轉錄組測序分析，并通過數(shù)據(jù)篩選挖掘磷脂酶基因家族的基因信息，旨在為磷脂酶基因的功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗采用百合品種Tarrango的18 cm周徑種球種植于連云港市農(nóng)業(yè)科學院東辛農(nóng)場試驗基地日光溫室中，待百合長至50 cm左右，花苞從葉片中顯露時，摘取百合植株同一部位正常葉片(TarCK)和葉燒病葉片(TarULN)，放置于干冰保溫盒中保存后送樣。

1.2 Illumina測序與序列組裝

高通量測序委托蘇州金唯智生物科技有限公司完成。使用二代測序數(shù)據(jù)質量統(tǒng)計軟件Cutadapt(version 1.9.1)對測序原始數(shù)據(jù)(Pass Filter Data)去除接頭以及低質量序列等，后續(xù)信息分析用的Clean Data。采用組裝軟件Trinity對樣品數(shù)據(jù)從頭組裝，組裝結果通過序列聚類做進一步序列拼接和去冗余處理，得到長的非冗余unigene序列。

1.3 序列分析與功能注釋

Unigene 序列通過Blast比對到蛋白質數(shù)據(jù)庫NR、Uniprot、KEGG和COG，選擇與給定unigene 序列同源性最高的蛋白，分別獲得unigene 序列在4個數(shù)據(jù)庫中的注釋信息。

1.4 磷脂酶基因家族的篩選與數(shù)據(jù)分析

以磷脂酶(phospholipase)作為關鍵詞，在獲得的所有 unigene序列注釋信息中搜索和篩選，得到磷脂酶基因家族候選基因。對所獲候選基因在百合正常葉片(TarCK)和葉燒病葉片(TarULN)中的表達進行差異分析，同時按所獲得的注釋信息對候選基因進行分類，并預測候選基因參與的代謝途徑。對獲得磷脂酶基因序列以500 bp為單位做序列長度統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 磷脂酶基因注釋分析統(tǒng)計

在本次高通量測序過程中，共有274條Unigene序列被注釋為磷脂酶基因(表1)。其中COG蛋白質數(shù)據(jù)庫中得到注釋為磷脂酶基因的unigene序列最多，為201條，其次為Uniprot和NR數(shù)據(jù)庫中，分別為170條和126條，KEGG注釋的unigene序列最少，為62條，在4個蛋白質數(shù)據(jù)庫中都注釋為磷脂酶基因的unigene序列有34條(圖1)，并且注釋的磷脂酶基因類型一致，其中分泌磷脂酶基因4條，序列長度在500～1 000 bp之間，基因9條，基因24條(表2)。

表1 磷脂酶基因注釋分析統(tǒng)計 條

表2 在4個蛋白庫都得到注釋的磷脂酶基因

2.2 各蛋白數(shù)據(jù)庫中磷脂酶基因的種類和數(shù)量分析

由圖2可知，COG數(shù)據(jù)庫中注釋的磷脂酶基因最多，尤其是基因較多，經(jīng)分析是COG數(shù)據(jù)庫中注釋為溶血磷脂酶基因(基因)的39個基因，在NR數(shù)據(jù)庫中注釋為咖啡酰莽草酯酶基因(caffeoylshikimate esterase)。有3個基因在COG數(shù)據(jù)庫中注釋為基因，而在NR數(shù)據(jù)庫中注釋為基因。通過比對NCBI數(shù)據(jù)庫中的基因與基因發(fā)現(xiàn)，基因與基因具有很高的相似度，通過MEGA 6.06構建同源進化樹分析，基因與部分基因的同源性高于基因之間的同源性(圖3)。在KEGG數(shù)據(jù)庫中有12個基因注釋為lysophospholipaseⅡ(溶血磷脂酶基因LYPLA2)，在Uniprot數(shù)據(jù)庫中注釋為acyl-protein thioesterase(?；鞍琢蛑窤PT)，利用MEGA 6.06構建百合與NCBI數(shù)據(jù)庫中登錄的APT基因的同源進化樹，發(fā)現(xiàn)百合基因與非洲油棕、棗椰樹和野芭蕉的基因同源性較高(圖4)，通過DNAMAN6.0軟件多序列對比分析百合基因與非洲油棕、棗椰樹和野芭蕉的基因同源性均高于83%。同時百合基因與NCBI中深圳擬蘭、鐵皮石斛和豇豆植物登錄的基因同源性較高(圖5)，同源性均在73%以上。

通過比對4個蛋白數(shù)據(jù)庫中注釋基因發(fā)現(xiàn)，同基因一樣與磷脂酶基因具有較高同源性的基因還有LYSOPL2、acylglycerol lipase、acyl-protein thioesterase、peroxiredoxin6，1-Cys peroxiredoxin和acriflavine resistance protein B(表3)。

表3 百合轉錄組測序中與磷脂酶基因具有較高同源性的基因

上述基因與磷脂酶類基因均具有較高的同源性，其中屬于MGAT蛋白類似基因，包含1個水解酶或者乙酰基轉移酶結構域和1個溶血磷脂酶結構域。一般屬于多功能酶，同時具有乙?；D移酶活性和水解酶活性。過氧化還原蛋白6 (peroxredoxin 6，Prdx6)是一種具有GSH過氧化物酶和磷脂酶A2活性的雙功能蛋白。

2.3 代謝通路分析

對上述在4個蛋白庫都得到注釋的磷脂酶基因進行代謝通路分析(圖6)，基因參與了甘油磷脂代謝調控合成1-acyl-sn-glycero-3-phosphochine，參與醚脂類代謝調控合成1-alkyl-sn-gIycero-3-phosphocholine (lyso PAF)和1-(1-alkenyl)-sn-glycero-3-phospho ethanolamine (lysoplasmalogen)，在百合葉燒病發(fā)生過程中，基因表達量上調。溶血磷脂酶基因基因參與了甘油磷脂代謝調控調控合成 sn-glycero-3-phosphocholine?；蛟诟视土字x調控中調控合成1，2-diacyl-sn-glycerol，在醚脂類代謝調控中調控合成2-acyl-1-(lalkenyl)-sn-glycerol，在百合葉燒病發(fā)生過程中，基因表達量上調?；騾⑴c了甘油磷脂代謝調控調控合成1，2-diacyl-sn-glycerol-3P，在醚脂類代謝中調控合成2-acyl-1-(lalkenyl)-sn-glycero-3-phosphate(plasmenic acid)。

3 討論與結論

磷脂酶是催化磷脂水解釋放游離脂肪酸的一類復雜而重要的酶，在植物體內分布廣泛。其中PLAs根據(jù)序列同源性和進化關系一般分為3類：磷脂酶A1(PLA1)、patatin like磷脂酶(pPLA)和低分子量分泌磷脂酶A2(sPLA2)。也有學者將PLAs分為4類： 水解磷脂酰膽堿(PC)的PLA1、 偏愛磷脂酸(PA)的PLA1(PA-PLA1)、sPLA2和pPLA。在本次試驗中百合的基因檢測出基因(以為主)、和。在COG中有31條基因注釋為的基因，而在NR數(shù)據(jù)庫中31條基因均注釋為-，同時在Uniprot數(shù)據(jù)中31條基因同時注釋為patatin-like protein和patatin-related phospholipase A。這表明磷脂酶A(patatin-related phospholipase A，pPLA)與動物(鈣離子非依賴型磷脂酶A2)為同源蛋白質，催化磷脂分子中sn-1和sn-2?；ユI的水解，與Holk等的研究結果一致。

PLB是一種非常重要的代謝酶類，廣泛存在于動植物及微生物體內，在植物中尚未見報道，具有水解酶、溶血磷脂酶和轉?；富钚浴Ｋ饷负腿苎字富钚允悄軌蛩饬字腿苎字?Sn-1和Sn-2位酯鍵，生成相應的甘油酰磷脂和脂肪酸，該酶在磷脂的分解代謝中具有非常重要的作用。Kegg數(shù)據(jù)庫中，PLB基因家族分為12條基因注釋為lysophospholipaseⅡ(LYPLA2 K06130)和 2條基因注釋為pldB(K01048)，即溶血磷脂酶基因的特異性較低，在注釋時通常不能與其他脂酶基因區(qū)別，如咖啡酰莽草酯酶(caffeoylshikimate esterase)和單甘油酯脂肪酶(monoglyceride lipase)，其原因是上述3類基因都具有溶血磷脂酶結構域，因此它們的基因序列相似度較高，基因與基因不能區(qū)分是因為多個基因兼具溶血磷脂酶活性和酰基蛋白硫脂酶活性。

PLC在植物內起到膜脂重構和胞內信號傳導的作用，根據(jù)底物親和力和細胞功能的差異分為磷脂酰肌醇特異性PLC(PI-PLC)和磷脂酰膽堿-PLC(PC-PLC)，PI-PLC水解磷酸肌醇，產(chǎn)生肌醇1，4，5-三磷酸(IP3)和二酰甘油(DAG)，可能是第2信使。IP3可以快速合成hexakisphosphate (IP6)并觸發(fā)Ca內流，而DAG可以被DAG kinase (DGK)磷酸化并轉化為磷脂酸(PAs)。與PI-PLC不同，PC-PLC也稱為非特異性PLC (NPC)，優(yōu)先水解常見的膜磷脂，如PC、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰絲氨酸(PS)。在本次試驗中，磷脂酶C分為 PLCβ(K05858)和PLCζ(k05857)和plc(k01114)3類。phosphatidylinositol-specific phospholipase C1(PI-PLC)、non-specific phospholipase C1(NPC)和 non-hemolytic phospholipase C(非溶血性磷脂酶C)PLC-N與phospholipase C，phosphocholine-specific 一樣。

磷脂酶D是一類能夠水解磷脂質生成磷脂酸和羥基化合物的酶，其催化部位為磷脂質的磷酸二酯鍵。在百合中磷脂酶D分為磷脂酰肌醇-聚糖特異性磷脂酶D(phosphatidylinositol-glycan-specific phospholipase D)、糖基磷脂酰肌醇-磷脂酶D(glycosylphosphatidylinositol phospholipase D)GPI-PLD(EC：3.1.4.50)；PLD3_4(EC：3.1.4.4)和PLD1_2(EC：3.1.4.4)，其中PLD1_2又分為5類PLDα1、PLDζ1、PLDγ1、PLDβ1、PLDδ1。磷脂酶D基因結構特異性強，26條基因在4個數(shù)據(jù)庫都得到注釋。

植物體內存在的磷脂酶主要為PLA1、PLA2、PLC 和 PLD，在NCBI數(shù)據(jù)庫中已檢測到多種植物的基因序列。在本次轉錄組測序中，雖然有多個基因對到4個蛋白質數(shù)據(jù)庫中，但都沒有注釋到任何代謝通路上。測序獲得的基因與其他植物的溶血磷脂酶基因具有較高同源性，其功能分析需要進一步驗證。百合磷脂酶候選unigene 的獲得為進一步開展百合磷脂酶基因的克隆及功能鑒定奠定了基礎，同時能為后續(xù)百合磷脂酶相關代謝途徑及分子機制解析提供數(shù)據(jù)支持。