王興強(qiáng)， 盧雪旎， 沈 曄， 曹 梅， 韋壽永， 李慶國， 茆丹婷， 秦傳新

(1.江蘇海洋大學(xué)海洋科學(xué)與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇連云港 222005； 2.連云港旺島旅游開發(fā)有限公司，江蘇連云港 222000；3. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，廣東廣州 510300)

溫度、鹽度和溶解氧均是甲殼類生活環(huán)境中重要的環(huán)境因子。脊尾白蝦()具有耐低溫、低鹽和低氧等特點(diǎn)，可以在溫度2～35 ℃和鹽度4～35的環(huán)境條件下生存，時(shí)刻關(guān)注這些環(huán)境因子的變化在白蝦養(yǎng)殖中非常重要。低溫脅迫可使凡納濱對蝦()血淋巴溶菌和抗菌能力顯著降低，而低鹽和低氧脅迫會降低其抗氧化能力和免疫酶活性。斑節(jié)對蝦()體內(nèi)酚氧化酶活性在低溫脅迫下顯著下降，而C型凝集素表達(dá)量在低鹽脅迫下顯著上升。低氧脅迫時(shí)日本沼蝦()需要消耗大量糖原和磷酸精氨酸來維持能量需要，而高溫時(shí)其幼體也會產(chǎn)生明顯的應(yīng)激反應(yīng)。環(huán)境脅迫后的物種均可通過高通量轉(zhuǎn)錄組測序，經(jīng)生物信息學(xué)分析來發(fā)掘其響應(yīng)環(huán)境變化的調(diào)控基因。運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，孫政等發(fā)現(xiàn)，脊尾白蝦體內(nèi)各種免疫相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)以響應(yīng)各種病原刺激。梅園通過尼羅羅非魚()轉(zhuǎn)錄組測序，在溫度脅迫產(chǎn)生的差異表達(dá)基因中發(fā)現(xiàn)一種共有結(jié)構(gòu)域。本研究通過Illumina測序得到脊尾白蝦低溫、低鹽和低氧脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，統(tǒng)一組裝，然后對不同脅迫條件下的差異表達(dá)基因進(jìn)行注釋和富集分析，以期闡明脊尾白蝦在環(huán)境脅迫下的生理調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 低鹽試驗(yàn)

試驗(yàn)所用脊尾白蝦購自連云港南極路水產(chǎn)品市場，在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)7 d以適應(yīng)環(huán)境，暫養(yǎng)期間水體溫度24～26 ℃、鹽度31、pH值8.25以及水中溶解氧含量為7.6～8.1 mg/L。在低鹽試驗(yàn)開始之際，隨機(jī)挑選出120尾脊尾白蝦[平均濕體質(zhì)量(4.12±0.56) g]用于試驗(yàn)，設(shè)低鹽脅迫(鹽度0.2)、自然海水(鹽度31)2個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，共6個(gè)水族箱(水體約30 L)，每個(gè)水族箱分別投放脊尾白蝦20尾，然后對水體進(jìn)行人工增氧。在進(jìn)行低鹽脅迫之后，水族箱中的白蝦約在5.5 h之后蝦體顏色變化大致可描述為從尾部逐漸變白，在6 h之后蝦體整體呈現(xiàn)側(cè)臥狀，在這種狀態(tài)下根據(jù)經(jīng)驗(yàn)預(yù)測被低鹽脅迫的脊尾白蝦已處于昏厥狀態(tài)。因此為了保證脊尾白蝦的取樣效果，對于低鹽脅迫組的脊尾白蝦，當(dāng)其整體處于側(cè)臥狀態(tài)下5 min左右時(shí)開始進(jìn)行取樣操作，分別在低鹽脅迫組與自然海水組的每個(gè)水族箱中隨機(jī)選取脊尾白蝦5尾，并使用液氮將整蝦快速冷凍，轉(zhuǎn)錄組測序備用。

1.2 低溫試驗(yàn)

脊尾白蝦來源和暫養(yǎng)同“1.1”節(jié)，試驗(yàn)開始時(shí)隨機(jī)挑選180尾脊尾白蝦，平均濕體質(zhì)量(1.27±0.15) g，設(shè)低溫脅迫(0 ℃)、自然水溫(25 ℃)2個(gè)溫度梯度處理，2個(gè)處理各設(shè)置3個(gè)重復(fù)，總計(jì)水族箱6個(gè)(水體30 L左右)，其中每個(gè)水族箱分別放置脊尾白蝦30尾，人工增氧，低溫驟變處理4 h。對照組、低溫脅迫組同時(shí)整蝦取樣，速凍于液氮中，轉(zhuǎn)錄組測序備用。

1.3 低氧試驗(yàn)

脊尾白蝦來源和暫養(yǎng)同“1.1”節(jié)，試驗(yàn)開始時(shí)隨機(jī)挑選60尾脊尾白蝦，平均濕體質(zhì)量(3.15±0.26) g，設(shè)低氧脅迫、自然溶解氧[溶解氧(7.59±0.66) mg/L]2個(gè)溶解氧梯度處理，2個(gè)處理各設(shè)置3個(gè)重復(fù)，總計(jì)水族箱6個(gè)(水體30 L左右)，每個(gè)水族箱分別放置脊尾白蝦10尾。用2 mm厚液體石蠟封閉低氧脅迫組水族箱，脅迫約4 h后白蝦處于昏厥狀態(tài)，溶解氧降低到(1.13±0.26) mg/L，整蝦取樣，速凍于液氮中，對照組同樣取樣保存，轉(zhuǎn)錄組測序備用。

1.4 RNA提取與文庫構(gòu)建

用液氮將凍存的樣品進(jìn)行研磨，采取常規(guī)Trizol試劑法來提取總RNA，同時(shí)對它的純度、濃度和完整性進(jìn)行檢測。樣品達(dá)到要求后，富集mRNA并以其為模板合成雙鏈cDNA鏈，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，構(gòu)建測序文庫。

1.5 轉(zhuǎn)錄組測序與生物信息學(xué)分析

將樣品數(shù)據(jù)送至上海元莘生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行高通量測序，評估原始測序數(shù)據(jù)和文庫構(gòu)建質(zhì)量，通過去除接頭序列、剪切低質(zhì)量讀段、舍棄N率(測序中識別不出的堿基率)達(dá)到10%讀數(shù)及長度小于25 bp片段的數(shù)據(jù)，最終得到高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)(Clean data)。通過Trinity對所有高質(zhì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行從頭組裝，最終得到轉(zhuǎn)錄本和unigene。緊接著進(jìn)行功能注釋，運(yùn)用BlastX分別與NR、STRING、Swiss-Prot和KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，對基因的生物學(xué)功能進(jìn)行進(jìn)一步的探究。通過RSEM軟件對基因的表達(dá)量進(jìn)行評估，通過FPKM表示基因的表達(dá)水平，并運(yùn)用edgeR軟件進(jìn)行基因的差異表達(dá)分析，主要富集到的功能和通路通過差異表達(dá)基因的GO富集分析和KEGG富集分析得到。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析

經(jīng)過濾后得到高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)，低鹽、低溫和溶解氧處理組和對照組均產(chǎn)出>35M條高質(zhì)量序列，堿基數(shù)均>4 Gb，GC含量均>43%。測序質(zhì)量的好壞是用質(zhì)量值(Q，quality value)來評估的，Q30表示堿基測序出錯的概率為0.001，值越高出錯率越低。本次測序樣品的Q30堿基百分比均大于92%(表1)。

表1 不同處理數(shù)據(jù)評估統(tǒng)計(jì)

使用Trinity對高質(zhì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行序列組裝，將Contigs合并分組生成Graph后得到轉(zhuǎn)錄本，最終組裝得到轉(zhuǎn)錄本436 023條和unigene 305 682條，轉(zhuǎn)錄本和unigene的N50分別為814 bp和552 bp，其中序列長度為200～400 bp的unigene最多，占總數(shù)的67.79%，長度在1 kb以上的占8.11%(表2)。

表2 組裝結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.2 unigene功能注釋

unigene序列是通過BLAST在NR、Swiss-Prot、GO、COG、KEGG各大數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對的，大部分unigene(56 898條)注釋到NR數(shù)據(jù)庫，31 695條注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫， 28919 條注釋到GO數(shù)據(jù)庫。

COG功能分類結(jié)果見圖1，主要注釋到翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物生成(translation，ribosomal structure and biogenesis)，翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)與伴侶蛋白(posttranslational modification，protein turnover，chaperones)，僅通用功能預(yù)測(general function prediction only)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制(signal transduction mechanisms)等功能中。

2.3 差異表達(dá)基因分析

差異表達(dá)基因中FDR<0.05并且log|FC|≥1的為差異顯著。低溫脅迫產(chǎn)生的差異表達(dá)基因中，具有顯著性表達(dá)差異的有264條，包括215條上調(diào)基因和49條下調(diào)基因，其中159條得到注釋。低鹽脅迫產(chǎn)生差異表達(dá)顯著的基因僅有1條，為顯著下調(diào)的α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)，低氧脅迫沒有產(chǎn)生差異表達(dá)顯著的基因。

2.3.1 GO注釋 低溫脅迫產(chǎn)生的264條顯著差異表達(dá)基因中，共有66條受到功能分類，GO注釋結(jié)果見圖2，其中，結(jié)構(gòu)分子活性中富集到52個(gè)上調(diào)基因。

2.3.2 GO富集分析 使用Goatools軟件對低溫脅迫產(chǎn)生的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能顯著性富集分析，為控制計(jì)算的假陽性率，對值進(jìn)行校正，當(dāng)校正后的<0.05時(shí)，GO功能顯著富集。<0.001的有表皮結(jié)構(gòu)組成(structural constituent of cuticle)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)活性(lipid transporter activity)和結(jié)構(gòu)分子活性(structural molecule activity)等分子功能，其中表皮結(jié)構(gòu)組成的顯著性較高，所富集到的差異表達(dá)基因也較多，為51條。<0.01的有肽基二肽酶活性(peptidyl dipeptidase activity)和有機(jī)物運(yùn)輸(organic substance transport)等，<0.05的有單生物體運(yùn)輸(single organism transport)、單有機(jī)體定位(single organism localization)和底物特異性轉(zhuǎn)運(yùn)體活性(substrate specific transporter activity)等。同時(shí)對得到的功能節(jié)點(diǎn)標(biāo)出編號和功能，以值進(jìn)行顯著性排序，最顯著的10個(gè)節(jié)點(diǎn)信息見表3。

表3 GO富集(低溫脅迫)

2.3.3 KEGG注釋 使用KOBAS進(jìn)行KEGG通路富集分析，經(jīng)過校正的值以0.05為閾值，定義差異表達(dá)基因中顯著富集的KEGG通路。低溫脅迫產(chǎn)生的差異表達(dá)基因顯著富集到腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)、美國錐蟲病(american trypanosomiasis)、阿米巴原蟲病(amoebiasis)、腎素分泌(renin secretion)、肥厚性心肌病(hypertrophic cardiomyopathy)、氨基糖和核苷酸糖代謝(amino and nucleotide sugar metabolism)、霍亂弧菌感染(vibrio cholerae)和補(bǔ)體與凝血級聯(lián)(complement cascades with clotting)等通路中(表4)。

表4 KEGG富集部分結(jié)果(低溫脅迫)

差異表達(dá)的基因在該通路的比例與所有注釋基因在該通路的比例的比值越大，校正后的值越小，通路越具有參考價(jià)值。由腎素-血管緊張素系統(tǒng)信號通路(圖3)可以看出，綠色邊框有3個(gè)，表示3個(gè)下調(diào)基因。由表5展示信息發(fā)現(xiàn)，3個(gè)下調(diào)基因均為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme，簡稱ACE)基因，差異倍數(shù)對數(shù)值logFC分別為 -8.80、-6.65和-7.81。

表5 腎素-血管緊張素系統(tǒng)信號通路包含序列

3 討論與結(jié)論

王余菊獲取日本蟳()鰓組織轉(zhuǎn)錄組69.22 Gb高質(zhì)量測序讀數(shù)，Q30達(dá)93.46%以上，組裝得到90 973條轉(zhuǎn)錄本和52 972條unigene，N50值為2 450、1 775 bp，注釋率37.84%。董麗君等對凡納濱對蝦進(jìn)行高通量測序，獲得50 921條unigene。N50為1 589 bp，注釋率37.28%。李喜蓮等進(jìn)行紅螯螯蝦()轉(zhuǎn)錄組測序，獲得147 915 744條高質(zhì)量讀數(shù)，Q30達(dá)94.76%，組裝得到67 369條unigene，N50長度為 1 376 bp，注釋率30.83%。本次測序各樣品均產(chǎn)出>35×10條序列數(shù)，堿基數(shù)均>4 Gb，GC含量均>43%，Q30堿基百分比均>92%，因而測序堿基識別出錯率很低，測序質(zhì)量較好。組裝得到轉(zhuǎn)錄本436 023條和unigene 305 682 條，轉(zhuǎn)錄本和unigene的N50分別是814、552 bp。N50較短可能是本次測序數(shù)據(jù)量龐大，且200～400 bp長度范圍占比較多所導(dǎo)致。56 898條unigene注釋到NR數(shù)據(jù)庫，31 695條注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫，28 919條注釋到GO數(shù)據(jù)庫，注釋率低的原因可能是在數(shù)據(jù)庫中近源物種基因注釋信息較少。

-葡萄糖苷酶又稱為葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(EC.3.2.1.20)，是糖苷水解酶家族的一員，水解碳水化合物中的-糖苷鍵生成葡萄糖。-葡萄糖苷酶具有雙重作用，即水解和轉(zhuǎn)糖苷，可以對-葡萄糖苷酶的活性進(jìn)行抑制，從而降低生物體內(nèi)葡萄糖的生成速率，同時(shí)可以對生物體內(nèi)的脂肪水平進(jìn)行調(diào)節(jié)。低鹽脅迫僅產(chǎn)生1個(gè)顯著下調(diào)的基因，為α-葡萄糖苷酶。低鹽脅迫下α-葡萄糖苷酶表達(dá)量顯著降低，可能導(dǎo)致脊尾白蝦機(jī)體難以維持正常的能量需求。

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)是重要的血壓和水電解質(zhì)平衡調(diào)節(jié)系統(tǒng)，而血管緊張素轉(zhuǎn)移酶(ACE)是RAS中的一種重要的酶，又稱為肽酰二肽水解酶，ACE分為ACE 1(原稱ACE)和ACE 2，都是膜相關(guān)的鋅肽家族成員，可以使肽鏈的C-末端二肽殘基水解。血管緊張素Ⅱ受體1型(AT 1R)響應(yīng)循環(huán)中的肽類激素血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)的系統(tǒng)性變化，ACE負(fù)責(zé)將Ang Ⅰ轉(zhuǎn)換為AngⅡ，并通過調(diào)節(jié)血壓和電解質(zhì)穩(wěn)態(tài)來使緩激肽失活。Ang Ⅱ在RAS中起到關(guān)鍵作用，能增強(qiáng)血管平滑肌張力，升高血壓，還會造成組織損傷。AT 1R和ACE的特異性抑制劑對心血管系統(tǒng)有重要影響，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEⅠ)具有使血壓下降的作用。ACE 2水解AngⅡ生成血管緊張素 1-7[Ang(1-7)]，有舒張血管和抗炎的作用，抵消ACE、AngⅡ和AT 1R對腦神經(jīng)元的損傷作用。低溫脅迫產(chǎn)生的差異表達(dá)基因中，具有顯著性表達(dá)差異的有264條，包括215條上調(diào)基因和49條下調(diào)基因，159條得到注釋，其中66條受到GO功能注釋，結(jié)構(gòu)分子活性中富集到52個(gè)上調(diào)基因，推測與低溫脅迫相關(guān)。GO富集分析發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下最顯著的功能節(jié)點(diǎn)是脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)活性和肽基二肽酶活性，而肽基二肽酶活性中包含的基因?yàn)锳CE。同樣，KEGG通路富集分析顯示，差異表達(dá)基因顯著富集到RAS中，且該通路富集顯著性最高，具有參考價(jià)值。由信號通路圖可以看出，該通路共包含3個(gè)表達(dá)下調(diào)的基因，均為ACE，推測低溫通過抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的表達(dá)，降低了血管緊張素Ⅱ的生成，從而降低血管平滑肌張力，抑制血壓的升高和組織損傷；同時(shí)動員脂肪和蛋白質(zhì)等能源物質(zhì)，以響應(yīng)低溫脅迫。