王錢(qián)保， 姜潤(rùn)深， 黎壽豐， 黃華云， 李春苗， 黃正洋， 郭 興， 趙振華

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，江蘇揚(yáng)州 225003；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，安徽合肥 230000)

近年來(lái)，為分析密閉式雞舍多環(huán)境因子對(duì)雞生產(chǎn)性能的影響，專(zhuān)家們紛紛提出了基于雞舍環(huán)境因子與生產(chǎn)性能相互影響的參數(shù)回歸模型，其中，對(duì)于光照因素影響雞性成熟的研究成為時(shí)下熱點(diǎn)。光周期的變化衍生不同的內(nèi)在生物節(jié)律，兩者同步性對(duì)雞性成熟產(chǎn)生影響。有研究指出，隨光照模式的正向適度增加，雞群生長(zhǎng)和性器官發(fā)育均正向上升。潘棟研究表明，雞體性成熟啟動(dòng)受光照時(shí)間和強(qiáng)度影響的同時(shí)，還與其是否符合雞某一特定生長(zhǎng)周期的晝夜生理節(jié)律相關(guān)。優(yōu)質(zhì)肉雞的性成熟是一個(gè)體內(nèi)多循環(huán)多通路協(xié)同合作的過(guò)程，目前對(duì)于參與觸發(fā)性成熟啟動(dòng)的物質(zhì)和相關(guān)機(jī)制仍處于不斷完善之中，經(jīng)驗(yàn)證可能有多種物質(zhì)和信號(hào)通路參與其中。近年，隨著雞基因組測(cè)序的不斷深化及高通量測(cè)序、分析技術(shù)快速發(fā)展，RNA-seq分析優(yōu)質(zhì)肉雞在不同光照模式下性成熟期差異基因mRNA表達(dá)水平變化及其調(diào)控機(jī)制成為可能。因此，本研究在前期研究基礎(chǔ)上，擬通過(guò) RNA-seq 技術(shù)方法，揭示光照對(duì)優(yōu)質(zhì)肉雞性成熟的分子調(diào)控機(jī)理，從而改善優(yōu)質(zhì)肉雞生產(chǎn)繁殖性能，全面推動(dòng)優(yōu)質(zhì)肉雞產(chǎn)業(yè)優(yōu)化升級(jí)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及分組

2019年4月2日，挑選健康的來(lái)自江蘇省家禽科學(xué)研究所自主培育的品系F系0日齡母雞540羽，該品系群體生長(zhǎng)整齊度高、性能優(yōu)良。按每組180羽雞隨機(jī)分成3組(對(duì)照組CK、試驗(yàn)組T1和T2)，放于江蘇省家禽科學(xué)研究所邵伯基地試驗(yàn)禽場(chǎng)內(nèi)的3間密閉式雞舍地面平養(yǎng)。各組雞均在同一飼養(yǎng)條件統(tǒng)一執(zhí)行優(yōu)質(zhì)肉雞營(yíng)養(yǎng)需求和一般免疫程序，全期自由采食和飲水。

1.2 試驗(yàn)方法

3組雞試驗(yàn)在0～84日齡設(shè)計(jì)3種不同的光照模式，光照方案詳見(jiàn)表1。由表1可知，試驗(yàn)周期為12周。于12周齡末時(shí)，每組采集3羽平均體質(zhì)量雞下丘腦組織樣本放入無(wú)酶凍存管，編號(hào)后迅速放入液氮中保存，用于提取組織RNA進(jìn)行RNA-Seq分析。Ⅰ組樣品編號(hào)為CK-1、CK-2、CK-3，Ⅱ組樣品編號(hào)為T(mén)1-1、T1-2、T1-3，Ⅲ組樣品編號(hào)為T(mén)2-1、T2-2、T2-3。

表1 3 組優(yōu)質(zhì)肉雞光照方案

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

1.3.1 RNA樣本制備 采用Trizol法分別提取9個(gè)樣品的下丘腦組織RNA，分別采用Nanodrop、Qubit2.0、Aglient 2100方法檢測(cè)RNA樣品的純度、濃度和完整性等，以保證使用合格的樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。通過(guò)常規(guī)試劑盒去除rRNA，將mRNA富集。進(jìn)一步將富集得到的mRNA反轉(zhuǎn)錄形成雙鏈cDNA，修復(fù)cDNA雙末端后加上接頭，PCR擴(kuò)增構(gòu)建上機(jī)文庫(kù)。

1.3.2 文庫(kù)制備 通過(guò)帶有Oligo(dT)的磁珠富集具有polyA尾巴的真核mRNA后，采用超聲波把mRNA打斷，以片段化的mRNA為模版，隨機(jī)寡核苷酸為引物，在M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶體系中合成cDNA第一條鏈，隨后用RNaseH降解RNA鏈，并在DNA polymeraseⅠ體系下，以dNTPs為原料合成cDNA第二條鏈。純化后的雙鏈cDNA經(jīng)過(guò)末端修復(fù)，加A尾并連接測(cè)序接頭，采用AMPure XP beads篩選200 bp左右的cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并再次使用AMPure XP beads純化PCR產(chǎn)物，最終獲得文庫(kù)。

1.3.3 文庫(kù)質(zhì)檢和Illumina測(cè)序 為保證測(cè)序質(zhì)量利用瓊脂糖凝膠電泳分析樣品RNA完整性及是否存在DNA污染；利用Nano Photometer spectrophotometer檢測(cè)RNA純度；利用Qubit2.0 Fluorometer進(jìn)行RNA濃度精確定量利用Agilent 2100 bioanalyzer精確檢測(cè)RNA完整性。為保證數(shù)據(jù)質(zhì)量，要在信息分析前對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)過(guò)濾，過(guò)濾低質(zhì)量數(shù)據(jù)以減少無(wú)效數(shù)據(jù)所帶來(lái)的分析干擾，得到clean reads。文庫(kù)質(zhì)檢合格后，交由基迪奧生物公司使用HiSeq2000測(cè)序儀(Illumina)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

利用DESeq 2軟件對(duì)基因表達(dá)水平進(jìn)行分析，得到reads count數(shù)據(jù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化(normalization)，根據(jù)模型進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)概率(pvalue)計(jì)算，最后進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)校正，得到FDR值(錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率)，最終得到組間的差異分析結(jié)果。使用R語(yǔ)言中的goseq包(12)將mRNA差異表達(dá)基因序列與GO(gene ontology)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，獲得GO功能注釋?zhuān)粚RNA差異表達(dá)基因與KEGG(kyotoencyclopedia of genes and genomes)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTX比對(duì)獲得mRNA差異表達(dá)基因相對(duì)應(yīng)的Pathway注釋信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)控與數(shù)據(jù)總體分析

本研究對(duì)3組雞下丘腦轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，由表2可知，測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與序列比對(duì)分析結(jié)果，9個(gè)樣品均獲得了54×10條 reads以上，總堿基數(shù)5 Gb左右，Q20在98%以上，Q30在95%以上，說(shuō)明RNA-seq測(cè)序結(jié)果可靠，可用于后續(xù)分析。樣品比對(duì)到參考基因組上的reads均達(dá)總reads數(shù)約90%，比對(duì)率均較高。由表3可知，與所選雞的參考基因組序列比較，共發(fā)掘新基因684個(gè)，其中，10個(gè)基因得到功能注釋。

表2 3組測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與序列比對(duì)分析

表3 3組基因檢測(cè)情況

2.2 樣本關(guān)系分析

使用皮爾遜相關(guān)系數(shù)對(duì)樣品進(jìn)行相關(guān)性分析，由圖1可知，試驗(yàn)組組間3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的決定系數(shù)()均大于0.95，對(duì)照組組間的決定系數(shù)()均在0.91以上，表明樣品組成相似性高，分析結(jié)果相關(guān)性較強(qiáng)。

2.3 差異基因整體分析

基于差異分析結(jié)果，篩選FDR<0.05 且 log|FC|>1 的基因?yàn)轱@著差異基因，由圖2可知，各比較組顯著差異基因整體統(tǒng)計(jì)，對(duì)照組與試驗(yàn)組T1、T2及試驗(yàn)組T1與T2間的mRNA顯著差異表達(dá)基因數(shù)量均不超過(guò)21個(gè)，但對(duì)照組與試驗(yàn)組T2的mRNA顯著差異表達(dá)基因數(shù)量超過(guò)189個(gè)，相比于對(duì)照組，試驗(yàn)T2組有111個(gè)基因上調(diào)表達(dá)、78個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。差異表達(dá)基因聚類(lèi)分析結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，大多數(shù)基因聚集在同一大類(lèi)上，提示這些差異表達(dá)的基因具有特定的功能相關(guān)性。

2.4 差異基因GO功能富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析

分別對(duì)3組雞組織的上調(diào)差異基因、下調(diào)差異基因進(jìn)行GO分析和KEGG信號(hào)通路富集分析，對(duì)照組和試驗(yàn)組T1、T2分別富集到36個(gè)和45個(gè)顯著GO條目。由圖4可知，其中，富集較多的GO功能是正負(fù)調(diào)控的生物過(guò)程、信號(hào)傳遞、細(xì)胞分解過(guò)程、新陳代謝過(guò)程、脂質(zhì)代謝相關(guān)過(guò)程和免疫相關(guān)過(guò)程。其中，信號(hào)傳導(dǎo)、機(jī)體新陳代謝及細(xì)胞過(guò)程在機(jī)體性成熟過(guò)程富集到了多個(gè)上調(diào)或下調(diào)基因，由表4可知，其中表達(dá)最為顯著的有抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的褪黑素受體基因()、興奮性神經(jīng)遞質(zhì)瘦素受體基因()、影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最主要的神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺受體基因()等。

表4 優(yōu)質(zhì)肉雞差異基因GO功能富集情況

由圖5可知，KEGG信號(hào)通路富集分析發(fā)現(xiàn)有5條顯著富集的KEGG信號(hào)通路，分別為機(jī)體新陳代謝、組織代謝、細(xì)胞分解過(guò)程、內(nèi)環(huán)境信息表達(dá)、基因表達(dá)過(guò)程通路。這些通路相互作用、相互影響，共同參與了機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育、性成熟等生命周期活動(dòng)。

3 討論

近年，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)不斷深化，家禽測(cè)序體量和質(zhì)量都有巨大提升。本研究測(cè)序獲得的原始序列均超過(guò)54×10條，總堿基數(shù)6 Gb左右，Q20堿基在98%以上，Q30堿基在95%以上，測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較高。與所選雞的參考基因組序列進(jìn)行對(duì)比，共發(fā)掘新基因684個(gè)，其中，10個(gè)基因得到功能注釋。試驗(yàn)組組別間的3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的決定系數(shù)()均大于0.95，對(duì)照組組別間的決定系數(shù)()均在0.91以上，表明樣品組成相似性高，后續(xù)分析結(jié)果相關(guān)性較強(qiáng)。

光照作為調(diào)節(jié)家禽行為活動(dòng)中性成熟的一項(xiàng)重要節(jié)律模式，其是通過(guò)視網(wǎng)膜雙感受器共同感知以達(dá)到對(duì)光周期的控制，促進(jìn)機(jī)體形成特定的生物節(jié)律，從而平穩(wěn)有序地調(diào)控家禽性成熟活動(dòng)。研究報(bào)道，家禽視網(wǎng)膜感受光照的刺激后，產(chǎn)生光信號(hào)經(jīng)“視網(wǎng)膜-下丘腦神經(jīng)束”傳遞至視交叉上核轉(zhuǎn)化為神經(jīng)沖動(dòng)，此過(guò)程通過(guò)來(lái)自性腺軸調(diào)控的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，引起家禽體內(nèi)促黃體素(LH)和促卵泡素(FSH)等一批性腺激素產(chǎn)生變化，最后影響家禽的性成熟等行為活動(dòng)。家禽生產(chǎn)中，養(yǎng)殖者重點(diǎn)關(guān)注光照變化致使優(yōu)質(zhì)肉雞體質(zhì)量和脂肪沉積等是否合格，而易忽視其對(duì)性腺發(fā)育的影響，現(xiàn)有研究已經(jīng)表明，優(yōu)質(zhì)肉雞不同生長(zhǎng)階段的生理特點(diǎn)差異較大，對(duì)光照時(shí)間長(zhǎng)短反應(yīng)不同，須在不同的生長(zhǎng)階段采用不同的光照節(jié)律，否則便會(huì)引起優(yōu)質(zhì)肉雞性早熟或開(kāi)產(chǎn)延遲等情況。

本研究差異表達(dá)基因?qū)Ρ确治鼋Y(jié)果表明，對(duì)照組與試驗(yàn)組T2的mRNA顯著差異表達(dá)基因數(shù)量超過(guò)189個(gè)，表明了對(duì)照組與試驗(yàn)組T2由于不同的光照模式影響，導(dǎo)致了機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育在基因?qū)用娌町愝^大。在表達(dá)差異最顯著的基因中，與內(nèi)外環(huán)境的節(jié)律調(diào)動(dòng)過(guò)程和體內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的基因表達(dá)最為活躍。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)褪黑素在動(dòng)物性成熟、激素分泌等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。褪黑素作為一種內(nèi)分泌胺類(lèi)激素，其分泌受光照影響呈現(xiàn)出晝低夜高的節(jié)律性，能夠抑制性激素分泌，如可以抑制HPG軸的水平，通過(guò)抑制促性腺激素釋放激素(GnRH)的釋放來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體的生殖功能，而下丘腦是促性腺激素釋放激素(GnRH)分泌的整合單位，是促黃體生成素和促卵泡生成素適時(shí)釋放的信號(hào)。此外作為抗性腺作用的主要靶器官，在性成熟過(guò)程中同樣發(fā)揮著巨大作用。因此，在肉種雞生產(chǎn)中，可以考慮通過(guò)補(bǔ)充外源性褪黑素適宜地延遲不同品種、不同育種目標(biāo)肉種雞性成熟時(shí)機(jī)，以達(dá)到最大化生產(chǎn)目的。瘦素作為影響家禽生殖系統(tǒng)的一個(gè)重要信號(hào)，待性器官發(fā)育到一定階段后，在體內(nèi)釋放隨后進(jìn)入血液的含量不斷增加，促進(jìn)了促性腺激素的分泌，導(dǎo)致了性腺類(lèi)固醇激素的持續(xù)上升，進(jìn)而影響開(kāi)啟性成熟的啟動(dòng)周期。多巴胺通過(guò)興奮多巴胺受體抑制垂體中血管活性腸肽(VIP)和催乳素(PRL)等多種相關(guān)激素的分泌，具有強(qiáng)烈抑制促性腺激素釋放以及刺激促生長(zhǎng)激素分泌的作用，從而對(duì)雞的性成熟啟動(dòng)起到積極的調(diào)控作用。GO和KEGG功能測(cè)序分析結(jié)果表明，3組雞富集到了多條顯著GO條目，KEGG信號(hào)通路富集分析提示，信號(hào)傳遞、新陳代謝和細(xì)胞過(guò)程等在機(jī)體性成熟過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。量多而繁復(fù)的復(fù)雜通路多與機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、性成熟啟動(dòng)密切相關(guān)，連接通路的這些上調(diào)或下調(diào)基因和多種性腺激素相互協(xié)作、相互制約，所產(chǎn)生的多種生理、藥理反應(yīng)可作用于雞體內(nèi)多個(gè)循環(huán)系統(tǒng)，其中，包括內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)，進(jìn)而也會(huì)影響雞的晝夜節(jié)律、性成熟啟動(dòng)以及生殖行為，呈現(xiàn)后續(xù)的一系列機(jī)體應(yīng)答反應(yīng)。

4 結(jié)論

優(yōu)質(zhì)肉雞不同生長(zhǎng)階段的光照模式對(duì)其性成熟的影響較大，主要是通過(guò)上調(diào)或下調(diào)與信號(hào)傳遞和機(jī)體新陳代謝等信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響優(yōu)質(zhì)肉雞性成熟發(fā)育，最終實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)性能的綜合調(diào)控。