王 暉， 高妍夏， 孫志超， 王 敬， 李季生， 李 娜， 黃 露， 賈漫麗， 謝 巖

(承德醫(yī)學(xué)院蠶業(yè)研究所/河北省高校特產(chǎn)蠶桑應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，河北承德 067000)

家蠶是一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，同時也是鱗翅目的模式物種。許多古籍記載、現(xiàn)代分子生物學(xué)研究均表明，家蠶起源于我國，并逐漸擴(kuò)散到亞洲、歐洲等地，經(jīng)過不斷地馴化、育種，形成許多品種、品系。不同品種的家蠶體色、個體大小、蠶繭顏色等均存在一定的差異。

分子標(biāo)記在DNA水平表現(xiàn)為多態(tài)性，在動物遺傳方面發(fā)揮著重要作用。常用的分子標(biāo)記有擴(kuò)增片段長度多態(tài)性 (amplified fragment length polymorphism，AFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(random amplified polymorphic DNA，RAPD)、簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)、單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)、插入缺失(insertion-deletion，Indel)等。SNP是DNA水平的單個核苷酸的改變而產(chǎn)生的多態(tài)性；Indel則是DNA水平插入或刪除從1 bp至數(shù)百bp長度的片段而形成的基因多態(tài)性。劉偉等挖掘梯棱羊肚菌全基因組的SNP/Indel位點，選擇單胞菌株群體，初步構(gòu)建Indel標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜。SNP和Indel位點可以鑒定國內(nèi)不同優(yōu)良地方雞種基因的同源性。對于家蠶品種分子水平的鑒定，前期已經(jīng)有了一定的研究報道。通過RAPD、SSR分子標(biāo)記初步判定一些家蠶品種之間的多態(tài)性和親緣關(guān)系。針對家蠶抗血液型膿病新品種混亂的情況，錢荷英等開發(fā)了50個SNP分子標(biāo)記，初步判斷這些SNP分子標(biāo)記可作為鑒定抗病品種的分子標(biāo)記。本研究對河北省常用家蠶品種的中腸、脂肪體組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，挖掘基因中的SNP/Indel位點，并對其分布規(guī)律進(jìn)行分析，以期進(jìn)一步豐富家蠶的SNP/Indel位點數(shù)據(jù)庫，為家蠶優(yōu)良品種選育、親緣關(guān)系鑒定等提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

家蠶白色繭品種東肥(DF，下同)、米色繭品種彩4(C4，下同)幼蟲于2019年6月飼養(yǎng)于承德醫(yī)學(xué)院蠶業(yè)所養(yǎng)蠶室，環(huán)境條件：溫度(25±2) ℃，濕度60%～70%，自然光周期。7月份時，解剖5齡成熟期生長一致家蠶蠶體，分離收集DF、C4的中腸(MG，下同)與脂肪體組織(FB，下同)，每個樣本3個生物學(xué)重復(fù)，液氮速凍，轉(zhuǎn)錄組測序工作由北京諾禾致源生物科技有限公司完成。

1.2 試驗方法

使用RNA提取試劑盒提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳、Nano Photometer 分光光度計檢測RNA的純度，Agilent 2100 生物分析儀檢測RNA的完整性。高通量測序儀測得的圖像數(shù)據(jù)經(jīng) CASAVA 堿基識別轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)(reads)，去除低質(zhì)量reads后獲得clean data。使用 GATK(3.7)軟件對樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行變異位點分析，并用 SnpEff(4.3q)軟件對變異位點進(jìn)行注釋。通過 clusterProfiler(3.4.4)軟件實現(xiàn)差異表達(dá)基因的 GO富集分析，分析KEGG 通路中差異表達(dá)基因的統(tǒng)計富集。使用Origin 2021b軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果

由表1可知，2個品種家蠶的脂肪體、中腸經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測序后共組裝得到17 915條unigene序列，總長度為20 545 285 bp，C4的中腸GC含量范圍為50.81%～51.29%，其他組織樣品的GC含量范圍為47.39%～49.81%；Q20均大于97%，Q30均大于92%，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可以用于后續(xù)分析。

表1 2個家蠶品種脂肪體、中腸轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量統(tǒng)計

2.2 SNP位點檢測

在2個品種家蠶中，脂肪體組織的SNP位點數(shù)目都小于中腸。C4脂肪體平均檢索到69 756個SNP位點，中腸平均檢索到99 490個SNP位點；DF脂肪體平均檢索到64 676個SNP位點，中腸平均檢索到99 910個SNP位點(圖1-A)。C4脂肪體、中腸每個unigene上的平均SNP數(shù)量分別為5.84、7.69個；DF脂肪體、中腸每個unigene上的平均SNP數(shù)量分別為5.31、7.31個。

C4脂肪體SNP位點數(shù)量高于DF脂肪體；但是C4中腸SNP位點數(shù)量低于DF中腸。所有組織樣品的SNP位點類型，轉(zhuǎn)換平均數(shù)目均高于顛換。C4脂肪體轉(zhuǎn)換、顛換平均數(shù)目分別為45 302、24 454個；中腸轉(zhuǎn)換、顛換平均數(shù)目分別為64 003、35 486個。DF脂肪體轉(zhuǎn)換、顛換平均數(shù)目分別為41 494、23 182個；中腸轉(zhuǎn)換、顛換平均數(shù)目分別為62 920、36 990個。A/G、C/T 2種轉(zhuǎn)換類型在所有SNP類型中所占比例最高，顛換類型中則是A/T占比最高(圖1-B)。

2.3 Indel位點分布特征

在2個品種家蠶中，脂肪體組織的Indel位點數(shù)目都小于中腸。C4脂肪體、中腸每個unigene上的平均Indel數(shù)量分別為0.34、0.50個；DF脂肪體、中腸每個unigene上的平均Indel數(shù)量分別為0.33、0.56個(圖2)。在C4脂肪體平均檢測到4 081個Indel位點，包括2 373個插入突變和1 708個缺失突變。堿基插入和缺失突變的范圍分別為1～24、1～67 bp，其中單核苷酸插入、缺失分別占所有Indel位點數(shù)目的35.78%、21.95%。C4中腸平均檢測到6 452個Indel位點，包括3 797個插入突變和2 655個缺失突變。堿基插入和缺失突變的范圍分別為 1～60、1～179 bp，其中單核苷酸插入、缺失分別占所有Indel位點數(shù)目的36.66%、22.41%。在DF脂肪體平均檢測到 4 082個Indel位點，包括2 427個插入突變和1 655個缺失突變。堿基插入和缺失突變的范圍分別為1～21、1～108 bp，其中單核苷酸插入、缺失分別占所有Indel位點數(shù)目的38.99%、21.64%。DF中腸平均檢測到7 601個Indel位點，包括4 566個插入突變和3 035個缺失突變。堿基插入和缺失突變的范圍分別為1～33、1～129 bp，其中單核苷酸插入、缺失分別占所有Indel位點數(shù)目的39.71%、21.43%(圖3-A、圖3-B)。

2.4 SNP/Indel位點在基因組上的分布

SNP/Indel位點在家蠶基因組上分布于8個區(qū)域，在下游區(qū)分布的位點數(shù)最多，占比為28.15%～30.11%；其次是外顯子、基因間隔區(qū)、上游區(qū)，占比依次分別為25.80%～31.62%、23.18%～27.29%、12.11%～13.60%；占比最少的是供體剪接位點、受體剪接位點，幾乎可忽略不計(圖4)。

2.5 GO功能注釋

通過對含有SNP/Indel位點的基因進(jìn)行GO功能注釋，可分為三大類，即生物學(xué)過程、分子功能、細(xì)胞組分。富集在生物學(xué)過程的通路主要有代謝過程、細(xì)胞過程、有機(jī)物代謝過程、主要代謝過程等(圖5-A)。富集在分子功能的通路主要有膜、細(xì)胞、細(xì)胞組分、細(xì)胞內(nèi)等(圖5-B)。富集在細(xì)胞組分的通路主要有腺嘌呤核苷酸結(jié)合、活躍的跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性、肌動蛋白結(jié)合等(圖5-C)。

2.6 KEGG 功能注釋

含有SNP/Indel位點的基因進(jìn)行KEGG功能注釋后，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)基因主要富集在核糖體、RNA轉(zhuǎn)運、氧化磷酸化、剪接體、內(nèi)吞作用、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工等與物質(zhì)代謝、能量代謝緊密相關(guān)的代謝通路(圖6)，這也與上述GO注釋的結(jié)果相一致。

3 討論與結(jié)論

本研究通過2個品種家蠶的中腸和脂肪體的轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，2個家蠶品種的脂肪體均檢索到6萬多個SNP位點，4 000多個Indel位點；中腸則存在9萬多個SNP位點，6 000多個Indel位點。余東亮等比較家蠶品種P50與C108后部絲腺的SNP/Indel位點，共發(fā)現(xiàn)1 584個SNP位點，2 776個Indel位點，結(jié)合本研究結(jié)果，推測SNP/Indel位點的多少主要與組織類型、品種有關(guān)。C4中腸SNP、Indel的出現(xiàn)頻率分別為1/207、1/3 184 bp，脂肪體SNP、Indel出現(xiàn)頻率分別為1/295、1/5 034 bp；DF中腸SNP、Indel的出現(xiàn)頻率分別為1/206、1/2 703 bp，脂肪體SNP、Indel出現(xiàn)頻率分別為1/318、1/5 033 bp。東海帶魚肝臟轉(zhuǎn)錄組序列平均每76.8 bp出現(xiàn)1個SNP；人參果則是約103 bp出現(xiàn)1個SNP位點。波紋唇魚肝胰臟、食道、前腸、后腸和直腸轉(zhuǎn)錄組unigene中SNP的發(fā)生頻率為1/490 bp；椰心葉甲嚙小峰轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中平均每1 000 bp出現(xiàn)1個SNP位點；可見SNP位點的出現(xiàn)頻率在不同物種之間差異較大。家蠶中腸和脂肪體SNP位點則以C/T、A/G等2種類型為主，其余4種類型數(shù)量相近，這與其他物種的研究報道一致。SNP的轉(zhuǎn)換與顛換類型之比為1.69～1.89之間，遠(yuǎn)大于理論值0.5，這種現(xiàn)象被稱為轉(zhuǎn)換偏差，其在許多物種中廣泛存在，這可能與物種適應(yīng)進(jìn)化有關(guān)。

從家蠶中腸、脂肪體轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選到了SNP/Indel位點信息，通過對包含有SNP/Indel位點的uningene進(jìn)行GO、KEGG功能注釋，可以初步分析家蠶品種、個體、組織之間的差異代謝途徑和通路，從而可能將SNP/Indel位點與表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)，開發(fā)出特定的分子標(biāo)記，將來進(jìn)一步為開展分子標(biāo)記輔助家蠶育種研究、品種鑒定、親緣關(guān)系分析等奠定基礎(chǔ)。