許發(fā)亞, 何 琪, 李細(xì)艷, 涂 皎, 肖雁冰

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬婦幼保健院 婦產(chǎn)科, 貴州 遵義, 563000)

組織工程概念核心是建立細(xì)胞與支架材料的復(fù)合體，并用于病損部位的組織修復(fù)、結(jié)構(gòu)重建和功能恢復(fù)[1]。組織工程的順利實(shí)施及應(yīng)用需要具有以下3個(gè)方面的條件: ① 合適的種子細(xì)胞; ② 支持細(xì)胞黏附和生長的支架材料; ③ 誘導(dǎo)、調(diào)控組織增殖分化的生物活性因子[2]。支架材料作為種子細(xì)胞的人工細(xì)胞外基質(zhì)，擔(dān)負(fù)了種子細(xì)胞生長、繁殖及形成新組織的重要責(zé)任，而理想的支架材料應(yīng)具有以下優(yōu)點(diǎn): ① 低免疫原性，在體內(nèi)無排斥反應(yīng); ② 良好的生物相容性，在體內(nèi)無炎癥反應(yīng)和毒性反應(yīng); ③ 分泌細(xì)胞生長因子，為種子細(xì)胞生長繁殖提供保障; ④ 有三維立體空間結(jié)構(gòu)，表面的微結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞的黏附和生長; ⑤ 可塑性，能夠適用于不同的周圍環(huán)境，保持特定的彈性[3]。人脫細(xì)胞羊膜支架是經(jīng)過特定處理后得到的一種具有良好空間結(jié)構(gòu)的天然支架材料[4], 因其具有良好的生物相容性、低免疫原性、三維立體空間結(jié)構(gòu)及取材容易等優(yōu)良特性而被廣大學(xué)者所關(guān)注，成為組織工程的研究熱點(diǎn)。本研究結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)對人脫細(xì)胞羊膜支架在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 人脫細(xì)胞羊膜特性

人羊膜是位于胎盤最外層接觸羊水的一層膜性組織，無神經(jīng)及血管，具有豐富的細(xì)胞外基質(zhì)，其大致分為具有人羊膜上皮細(xì)胞的上皮層、有大量膠原蛋白的基底膜層、致密層、纖維母細(xì)胞層以及海綿層。在應(yīng)用物理、化學(xué)或生物酶制劑進(jìn)行脫細(xì)胞處理時(shí)，可去除羊膜的上皮細(xì)胞組分，為后續(xù)種植上的種子細(xì)胞提供更大的三維立體空間結(jié)構(gòu)。人脫細(xì)胞羊膜作為一種天然的支架材料，擁有第Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ型膠原[5], 同時(shí)也具有纖維粘連蛋白、層粘連蛋白、整合素、彈性蛋白等多種蛋白，上述成分決定了人脫細(xì)胞羊膜具有一定的彈性及機(jī)械強(qiáng)度[6]。人脫細(xì)胞羊膜還具有堿性成纖維細(xì)胞因子、透明質(zhì)酸、轉(zhuǎn)化生長因子等多種有效成分[7], 也可以促進(jìn)器官或者組織的修復(fù)。人新鮮羊膜本身就具有低免疫原性，在對其進(jìn)行脫細(xì)胞處理的同時(shí)也會將其致免疫性的細(xì)胞成分一并脫下，更進(jìn)一步降低其免疫原性[8]。將人脫細(xì)胞羊膜與牙周膜干細(xì)胞(PDLSCs)[9]、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(AMSCs)[10-11]、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)[12-13]、人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(hAMSCs)[14]等多種間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)后，均顯示人脫細(xì)胞羊膜對多種間充質(zhì)干細(xì)胞有良好的生物相容性，并可分泌多種促進(jìn)細(xì)胞和(或)組織增殖修復(fù)的生物活性因子。楊德宇等[11]對人脫細(xì)胞羊膜進(jìn)行的力學(xué)拉伸實(shí)驗(yàn)證明了其具有良好的彈性、抗拉伸及抗變形的能力，能夠滿足大部分組織和(或)器官對生物支架的可塑性要求?；谏鲜鋈嗣摷?xì)胞羊膜的良好特點(diǎn)，其可作為組織工程中一種新型的生物支架材料。

2 人脫細(xì)胞羊膜支架在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

近年來，基于人脫細(xì)胞羊膜的優(yōu)良特性，其用于軟組織修復(fù)、骨損傷重建、皮膚再生、預(yù)防粘連等的研究越來越多。人脫細(xì)胞羊膜本身具有的促進(jìn)組織和(或)器官修復(fù)的間充質(zhì)干細(xì)胞及生長活性因子含量相對較少，故目前常用作生物支架負(fù)載聯(lián)合其他間充質(zhì)干細(xì)胞協(xié)同對組織和(或)進(jìn)行修復(fù)，并表現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。

2.1 軟組織修復(fù)

2.1.1 關(guān)節(jié)軟骨組織工程: 關(guān)節(jié)軟骨主要分布于長骨末端，是一種無神經(jīng)、無血管的致密結(jié)締組織，主要發(fā)揮在運(yùn)動(dòng)過程中的減震作用，損傷后治療不及時(shí)將會罹患上骨關(guān)節(jié)炎、長期慢性疼痛以及導(dǎo)致殘疾的概率升高[15]。關(guān)節(jié)軟骨具有缺乏氧氣、缺少血液供應(yīng)的特殊生理結(jié)構(gòu)，這就導(dǎo)致其營養(yǎng)物質(zhì)的來源十分有限，自我修復(fù)的能力較差[16]。目前，臨床上重度軟骨損傷的治療方式仍以物理治療聯(lián)合手術(shù)為主，但治療效果因人而異，且對家庭經(jīng)濟(jì)情況要求較高。優(yōu)良的細(xì)胞支架為種子細(xì)胞提供適宜的存活環(huán)境，可增強(qiáng)其增殖分化能力并提高細(xì)胞利用率。賈海棟等[17]設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)將人脫細(xì)胞羊膜負(fù)載BMSCs后植入家兔軟骨損傷患處，證實(shí)二者除了具有較好的生物相容性外，且促進(jìn)軟骨組織修復(fù)的效果優(yōu)于單獨(dú)使用支架或細(xì)胞治療，考慮人脫細(xì)胞羊膜對關(guān)節(jié)腔內(nèi)的干細(xì)胞有一定的募集作用，并且可以促進(jìn)BMSCs在此處的增殖與分化，因此可以促進(jìn)軟骨組織的修復(fù)。ZHANG J等[18]也將人脫細(xì)胞羊膜聯(lián)合hAMSCs植入兔軟骨損傷處，結(jié)果也證實(shí)了聯(lián)合使用細(xì)胞及支架組較單獨(dú)使用細(xì)胞組的治療效果更顯著。因此，人脫細(xì)胞羊膜能夠增加細(xì)胞的黏附和增殖分化，在周圍環(huán)境不理想的情況下為干細(xì)胞的治療效果提供環(huán)境支持，為組織工程在相對特殊生理結(jié)構(gòu)的組織治療中提供了新的思路。

2.1.2 心臟組織工程: 心肌梗死是目前發(fā)病率及病死率較高的一種疾病[19]。目前心肌梗死的治療局限性在于只能改善發(fā)病后的情況，并不能恢復(fù)梗死的心肌細(xì)胞的功能，而唯一的治療方式則是心臟移植，這就意味著需要面臨供體不足和移植后強(qiáng)大的排斥反應(yīng)的情況，顯然這并不是一種很理想的治療方式。為了解決這一困難, BLUME G G等[20]將人脫細(xì)胞羊膜用可吸收縫合線置于心肌梗死大鼠左心室壁，并在30 d后對大鼠進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)大鼠左心室射血分?jǐn)?shù)有顯著恢復(fù)，心肌細(xì)胞及血管組織在病損處再生。人脫細(xì)胞羊膜支架能夠恢復(fù)心肌細(xì)胞生理功能，可以為運(yùn)輸其他治療因子提供機(jī)械支持，為心血管疾病治療提供了新的治療手段。

2.1.3 氣管尿道重建: 氣管狹窄是氣管插管或氣管切開術(shù)后引起的嚴(yán)重并發(fā)癥[21], 后期形成的瘢痕及纖維化在行手術(shù)治療切除后會造成較大面積的氣管缺損，當(dāng)缺損長度超過斷端吻合極限的時(shí)候，則需要考慮人工合成氣管來代替。理想的氣管替代物需要擁有良好的生物相容性以及適當(dāng)?shù)慕到饴剩詈每梢源龠M(jìn)細(xì)胞黏附和增殖分化[22]。BAGGIO SIMEONI P R等[23]利用人脫細(xì)胞羊膜負(fù)載人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUMSCs)置于兔氣管缺損模型處, 2個(gè)月后觀察發(fā)現(xiàn)氣管缺損處修復(fù)效果較對照組顯著提高。尿道的先天畸形、手術(shù)創(chuàng)傷、外傷等可能會導(dǎo)致尿道狹窄，長度較大的尿道狹窄段切除后無法進(jìn)行斷端吻合術(shù)，而傳統(tǒng)尿道修復(fù)材料如自體小腸黏膜下層、口腔黏膜、頰黏膜等，因供體組織材料不足且術(shù)后供體部位極易發(fā)生神經(jīng)損傷、瘢痕、攣縮等并發(fā)癥，這種犧牲自我組織替代新組織的方法并不是臨床治療所鼓勵(lì)的。ZHANG D L等[24]利用人脫細(xì)胞羊膜負(fù)載皮膚上皮細(xì)胞用于兔尿道缺損修補(bǔ)，術(shù)后發(fā)現(xiàn)新尿道上皮黏膜光滑平整，新生血管豐富，而且新尿道尿流速率與正常尿道相同，功能性較正常尿道無明顯差異，據(jù)此認(rèn)為采用人脫細(xì)胞羊膜替代組織材料修復(fù)尿道缺損這一方法是可行的。張鑫等[25]對犬尿道造成3 cm的缺損，而后利用人脫細(xì)胞羊膜負(fù)載BMSCs和血管內(nèi)皮祖細(xì)胞后縫合于尿道缺損處，術(shù)后新生尿道的管壁光滑、無狹窄，未見明顯瘢痕形成，排尿也正常，證明采用脫細(xì)胞羊膜支架對尿道缺損有良好的修復(fù)效果，或可作為一種新的尿道替代材料用于修復(fù)尿道缺損。

2.2 骨缺損組織工程

在骨損傷中，原始骨組織的愈合及新生骨的形成和成熟是一個(gè)相當(dāng)漫長的過程，目前的骨缺損修補(bǔ)技術(shù)已有很多，包括自體骨移植、異體骨移植、異種骨移植、骨延長術(shù)和骨膜誘導(dǎo)術(shù)等[26], 但這些方法的主要缺點(diǎn)是供體骨來源有限、患者疼痛加重、生物材料療效不確定、愈合周期過長、治療費(fèi)用高等。骨膜具有多種間充質(zhì)干細(xì)胞及成骨細(xì)胞，手術(shù)后去除部分骨膜會嚴(yán)重影響骨組織的正?；謴?fù)，而目前構(gòu)建組織工程骨膜也是治療骨缺損的一種重要的治療方式。肖正俊等[27]采用人脫細(xì)胞羊膜與BMSCs構(gòu)建組織工程骨膜，在進(jìn)行誘導(dǎo)分化后在電鏡下觀察有大量成骨組織生成，可置于骨缺損處誘導(dǎo)成骨組織的生長。TANG K等[7]研究表明人脫細(xì)胞羊膜增加了骨形成和骨重塑，并且可以影響B(tài)MSCs、破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞等的募集和活化，從而促進(jìn)骨再生，考慮與細(xì)胞募集和骨重塑有關(guān)的趨化性細(xì)胞受體因子-4(CXCR-4)、單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-1)、OC和組織蛋白酶K(CatK)的基因表達(dá)在植入的缺損處增強(qiáng)而治療骨缺損有關(guān)。人脫細(xì)胞羊膜具有與骨膜相同的特點(diǎn)，可以提供給缺損骨組織營養(yǎng)物質(zhì)，生成機(jī)械屏障，同時(shí)能刺激細(xì)胞的募集和活化，刺激成骨細(xì)胞的生成，從而促進(jìn)骨組織的修復(fù)。

2.3 皮膚再生

皮膚被認(rèn)為是人體最重要的器官之一，具有重要的功能，不僅可以抵御各種外界的有害物質(zhì)的侵入，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，而且可以調(diào)節(jié)機(jī)體溫度[28]。竺亞斌等[29]將人脫細(xì)胞羊膜覆蓋在背部皮膚全層損傷大鼠模型上，外側(cè)用無菌紗布包裹, 3周后使用人脫細(xì)胞羊膜的大鼠皮膚已基本愈合，且愈合程度顯著優(yōu)于普通治療組，考慮人脫細(xì)胞羊膜對皮膚損傷具有較好的治療效果。重度燒傷患者主要的治療方式是植皮[30]，其中包括自體皮膚移植和異體皮膚移植，但無論是哪種方法，患者都是要承受巨大的經(jīng)濟(jì)壓力和痛苦。KITALA D等[31]采用人脫細(xì)胞羊膜治療1例重度燒傷患者, 12 d后該患者痊愈出院，相較于同期進(jìn)行異體皮膚移植患者的住院周期顯著縮短，患者術(shù)后亦無排斥現(xiàn)象，也沒有疼痛、過敏以及傷口感染的情況。對于皮膚創(chuàng)口而言，人脫細(xì)胞羊膜支架不僅屬于種子細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)，同樣也可作為傷口的敷料用于減少感染和治療。

糖尿病患者因自身疾病的原因，產(chǎn)生的傷口很長時(shí)間不能恢復(fù)，后期極易發(fā)生感染、壞死等可能，糖尿病傷口已嚴(yán)重影響到患者的日常生活及心理狀況[32]。除了首要控制血糖以外，傷口的手術(shù)清創(chuàng)和外用移植物也是糖尿病傷口的治療方式之一。XIAO S E等[33]將已分離出的AMSCs外泌體種植于人脫細(xì)胞羊膜支架上，然后置于糖尿病動(dòng)物模型的傷口處，結(jié)果表明AMSCs外泌體聯(lián)合人脫細(xì)胞羊膜支架可以調(diào)節(jié)傷口部位的炎性免疫因子、促進(jìn)周圍血管增殖和促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生來加速傷口的愈合，人脫細(xì)胞羊膜支架聯(lián)合干細(xì)胞外泌體在此方面展現(xiàn)出了巨大的治療潛力。下肢靜脈性潰瘍是深靜脈瓣關(guān)閉不全導(dǎo)致靜脈回流障礙，靜脈壓升高導(dǎo)致下肢皮膚破損，易在同一區(qū)域反復(fù)發(fā)作，并會導(dǎo)致破潰感染、長期慢性疼痛、下肢皮膚色素沉著、硬化甚至惡變的可能。WU Z P等[34]在臨床上經(jīng)過患者知情同意后將人脫細(xì)胞羊膜直接放在患者靜脈潰瘍處用無菌紗布包裹，結(jié)果表明僅2周時(shí)間潰瘍面積顯著縮小，患者疼痛感顯著好轉(zhuǎn)，潰瘍周圍炎性滲出物及新生肉芽腫也顯著減少，且治療完成后患者未出現(xiàn)炎癥及過敏反應(yīng)，治療費(fèi)用也遠(yuǎn)低于普通治療方案。

在皮膚再生的治療中，人脫細(xì)胞羊膜具有豐富的膠原，可以促進(jìn)皮膚上皮細(xì)胞的再生，也可以作為生物支架為種子細(xì)胞提供生長繁殖的細(xì)胞外基質(zhì)，還可以作為抗菌消炎的機(jī)械屏障，在治療過程中使用方法簡便、易于移植，無任何不良反應(yīng)，也不用擔(dān)心其降解率的問題。

2.4 預(yù)防粘連

肌腱粘連會導(dǎo)致肢體運(yùn)動(dòng)受限，嚴(yán)重影響患者后期的生活質(zhì)量，臨床上多運(yùn)用加強(qiáng)手術(shù)縫合方式、加用防粘連物質(zhì)及其他人工合成材料等減輕術(shù)后肌腱粘連情況[35], 但效果都不盡如人意，且人工合成生物材料存在排斥反應(yīng)大、低降解率等缺點(diǎn)。白江博等[36]考慮用低免疫原性的人脫細(xì)胞羊膜降低移植后的排斥反應(yīng)，因良好的降解率也無需二次手術(shù)，在對肌腱損傷的動(dòng)物模型中運(yùn)用人新鮮羊膜及人脫細(xì)胞羊膜后表明二者均可預(yù)防肌腱粘連，結(jié)果證明因人新鮮羊膜有間充質(zhì)干細(xì)胞，較人脫細(xì)胞羊膜有更好的預(yù)防肌腱粘連的效果。馮勇等[37]通過比較人脫細(xì)胞羊膜、藥物及生長因子對預(yù)防肌腱粘連的作用，認(rèn)為人脫細(xì)胞羊膜除了在治療肌腱損傷方面可以起到屏障作用，在早期預(yù)防肌腱粘連方面也有不錯(cuò)的療效，因其具有活性的細(xì)胞已被去除，后期加之使用具有分化能力的干細(xì)胞，將是預(yù)防肌腱粘連的新方向。

運(yùn)用干細(xì)胞治療宮腔粘連是許多學(xué)者共同研究的目標(biāo)，但干細(xì)胞不能在受損的宮腔部位長期存活，使之不能達(dá)到應(yīng)有的治療效果[38]。常用的宮腔支架主要是宮內(nèi)節(jié)育器、球囊支架以及透明質(zhì)酸等[39], 但因其具有壓迫內(nèi)膜、引起感染、在宮腔內(nèi)存活時(shí)間短、對干細(xì)胞的生長無促進(jìn)作用等問題，并非是理想的宮腔支架材料。HAN X等[40]將AMSCs聯(lián)合人脫細(xì)胞羊膜支架放入宮腔粘連大鼠模型宮腔內(nèi)，術(shù)后觀察大鼠子宮血管生成因子上升, CD34免疫組化及免疫熒光表達(dá)均上升，考慮聯(lián)合移植物是通過促進(jìn)血管生成增加子宮內(nèi)膜血流量，從而修復(fù)失去功能的內(nèi)膜基底層。CHEN X等[41]將人脫細(xì)胞羊膜支架放入大鼠宮腔粘連的模型中，結(jié)果顯示該支架通過抑制結(jié)締組織生長因子和下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-2抑制劑的表達(dá)而發(fā)揮抑制子宮內(nèi)膜纖維化的作用。人脫細(xì)胞羊膜良好的可塑性及機(jī)械彈性將成為未來治療宮腔疾病的新型常用支架材料。

3 總結(jié)與展望

人脫細(xì)胞羊膜支架具有獨(dú)特優(yōu)點(diǎn): ① 人脫細(xì)胞羊膜支架是一種天然支架，取材簡便且無倫理爭議，無細(xì)胞毒性，具有多種生物活性因子，更有利于種子細(xì)胞的黏附及生長繁殖，能在受損部位有較長的存在時(shí)間。② 人脫細(xì)胞羊膜可由使用者隨意選取所需要的大小，放入別的支架所不能置入的部位。③ 人新鮮羊膜具有低免疫原性，在經(jīng)過脫細(xì)胞處理后免疫成分再次被脫去，使之免疫原性更低，在動(dòng)物或人體上幾乎無排斥反應(yīng)，這都是其他生物支架所不能比擬的。

就臨床安全性而言，特別是作為傷口敷料這一方面，人脫細(xì)胞羊膜已被國家批準(zhǔn)用于治療臨床的燒傷及創(chuàng)面缺損治療(國械注準(zhǔn)20153462192)，其安全性尚無明顯的爭議。此外，人脫細(xì)胞羊膜來源廣泛，制備及儲存條件相對簡便，治療費(fèi)用也大大降低，在軟組織修復(fù)、骨組織再生、皮膚再生及預(yù)防組織粘連等方面具有廣闊的應(yīng)用前景，是組織工程學(xué)的理想候選支架材料。