楊 波，王司航，張 鑫，蔚慧欣，劉 娜，張左兵，3，4*

（1.山西杏花村竹葉青產(chǎn)業(yè)有限責(zé)任公司 中國露酒植物提取與健康山西省重點實驗室，山西 呂梁 032205；2.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；3.山西大學(xué) 化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點實驗室，山西 太原 030006；4.山西大學(xué)杏花村學(xué)院（山西釀造產(chǎn)業(yè)研究院（籌）），山西 太原 030006）

我國白酒、黃酒、露酒等傳統(tǒng)飲用酒類自古以來備受廣大人民的喜愛，尤其是在各種儀式、節(jié)日、社交聚會、商業(yè)場合和特殊活動中。在長期的飲酒實踐過程中，人們發(fā)現(xiàn)過度飲用會造成多種健康問題。21世紀(jì)初，我國部分省份流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)：酒精性肝臟疾病在飲酒人群中平均發(fā)病率在0.50%～8.55%之間，其中，在40～49歲人群中高達(dá)11.6%[1]。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們在利用酒作為媒介進(jìn)行情感交流的同時，健康飲酒的意識也日益增強(qiáng)。目前，利用動物模型進(jìn)行的飲酒健康相關(guān)研究大多都是以單一的乙醇為材料展開的[8-12]。然而，我國傳統(tǒng)飲用酒類成分復(fù)雜，乙醇雖是主要成分，但不是唯一成分[2]。因此，只通過研究乙醇對健康的影響而評價飲酒健康問題是不客觀全面的。以白酒為例，水和乙醇雖然占98%～99%，但占比僅為1～2%的微量成分十分復(fù)雜，對酒質(zhì)的影響巨大，主要包括酯類、雜醇類、有機(jī)酸、醛類等[2]。這些微量成分之間可通過復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)進(jìn)一步生成更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，從而影響陳釀過程、酒的風(fēng)味等[3]。這些微量成分及其衍生物對健康是否造成影響值得關(guān)注。露酒的成分則更為復(fù)雜，以竹葉青為例，配制的草本有12種，王志娟等[4]采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）技術(shù)從竹葉青中檢測到65種揮發(fā)性化合物，其中30余種來自配制用的藥材。這些成分中既有對人體有益的功能活性成分，如D-檸檬烯、莰烯、β-蒎烯、丁香酚、乙酸龍腦酯、α-檀香醇等；也有一些功能尚未確定的物質(zhì)，如1-甲基-4-（1-異丙基）-1,4-環(huán)己二烯、3,4-二甲基-3-環(huán)己烯-1-甲醛和二去氫菖蒲烯等[5]。自“中國白酒3C計劃”[6]和“中國白酒169計劃”[7]啟動以來，白酒中有益健康的成分雖然不斷被報道，但對這些物質(zhì)的功效研究還很不足，特別是對白酒等傳統(tǒng)飲用酒類衍生出的露酒的研究非常不足，關(guān)于保健成分功效分析的報道有待于加強(qiáng)。

1 酒類功效研究模型動物

盡管體外（in vitro）細(xì)胞模型在很多化合物的功能研究中發(fā)揮了重要的作用，但是考慮到機(jī)體的復(fù)雜性，體外研究并不能完全反映體內(nèi)情況，因此，體內(nèi)（in vivo）模型在化合物的功能研究中仍然不可或缺。由于倫理原因，酒類有效成分的體內(nèi)研究多是利用人以外的其他物種來進(jìn)行的[8]。其中，嚙齒類應(yīng)用最為廣泛，Lieber-DeCarli模型和Tsukamoto-French模型是常見的模型[9]。但這類模型存在著明顯的不足[10]：利用Lieber-DeCarli模型的酒精慢性暴露實驗中，即便在飲水中添加酒精長達(dá)9個月，也只能讓小鼠肝臟產(chǎn)生脂肪變性，而不會產(chǎn)生纖維化變化。因為在這個模型中，小鼠血液的乙醇濃度不足以誘發(fā)脂肪變性以外的肝損傷[11]。此外，在飲用水中添加酒精，有些小鼠會產(chǎn)生拒飲情況，導(dǎo)致造模失敗。在Tsukamoto-French模型中，小鼠被植入胃管，通過灌胃雖可使血液中乙醇濃度增加，但如果沒有其他因子（如日糧變化，添加化學(xué)制劑）的協(xié)同作用，產(chǎn)生更嚴(yán)重的肝臟疾病，如肝臟纖維變性和肝硬化的概率也依然較小。而且這種模型需要特定的設(shè)備、熟練的技術(shù)及相對較高的成本[8]，因此，廣泛應(yīng)用于酒類功效研究的難度較大。

近年來，新興模式物種斑馬魚逐漸被引入酒精研究中[11-17]。目前，斑馬魚被美國國立衛(wèi)生研究院（national institutes of health，NIH）列為繼小鼠后第二優(yōu)先資助的脊椎動物。國際基因組參考聯(lián)盟（genome reference consortium，GRC）更是將斑馬魚基因組后續(xù)完善工作列為人類、小鼠基因組之后的重點工作。以斑馬魚為實驗動物，酒精可以直接添加到養(yǎng)殖水中，克服了嚙齒類模型中拒飲的不足，并且可以通過取特定組織進(jìn)行研磨，使用相應(yīng)的試劑盒、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）或氣相色譜（gas chromatography，GC）的方法分析斑馬魚對有效成分的吸收與代謝情況。因此，斑馬魚是一種不可多得的酒類功效研究理想模型。目前，斑馬魚已經(jīng)被用于乙醇暴露后的代謝、肝臟疾病和神經(jīng)、行為等研究中[12，15，17-18]，本實驗室也建立了斑馬魚暴露于竹葉青酒的暴露模型。

2 斑馬魚具有較為保守的酒精代謝通路

對于哺乳動物而言，進(jìn)入其機(jī)體的酒精約10%通過呼吸、汗液和尿液排出體外，約90%的酒精則通過氧化而被消耗，氧化反應(yīng)主要發(fā)生在肝臟細(xì)胞中[19]。位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）將酒精代謝為乙醛，乙醛在線粒體內(nèi)被乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）代謝為乙酸，進(jìn)而以乙酸鹽的形式排出體外[20]。細(xì)胞色素P450家族2亞族E成員1（cytochrome P450 family 2 subfamily E member 1，CYP2E1）也可將乙醇氧化為乙醛，尤其是在酒精過量時的乙醇代謝中起著重要作用[19-20]。當(dāng)體內(nèi)酒精濃度低時，乙醇的代謝主要依賴于ADH，但由于此酶是本底表達(dá)，極易達(dá)到飽和，因此當(dāng)乙醇濃度高，特別是長期過程中，微粒體內(nèi)的CYP2E1就是重要的乙醇代謝酶，能夠被誘導(dǎo)表達(dá)到正常水平的10～20倍[19]。在斑馬魚中，已先后發(fā)現(xiàn)了編碼ADH的直系同源基因adh5a[21]、adh8a和adh8b[22]。ADH1抑制劑4-甲基吡唑（4-methylpyrazole，4-MP）可增加斑馬魚胚胎對乙醇的耐受[18]。雖然在斑馬魚中沒有找到cyp2e1同源基因，但是斑馬魚含有41個cyp2基因，其中cyp2y3和cyp2p6與人的cyp2e1最為接近，蛋白水平相似性達(dá)43%[18，23]。研究還發(fā)現(xiàn)，1%乙醇處理斑馬魚18 d后，肝臟cyp2y3的信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）水平上調(diào)9倍，且CYP2E1抑制劑氯美噻唑（chlormethiazole，CMZ）可顯著增強(qiáng)斑馬魚的耐受，提示斑馬魚存在類似CYP2E1的乙醇代謝路徑[18，24]。斑馬魚基因組測序完成后，研究人員發(fā)現(xiàn)斑馬魚中存在大量aldh家族基因[25]。在哺乳動物代謝乙醛過程中起重要作用的aldh1和aldh2基因的同源基因，在斑馬魚中分別存在4個（aldh1a2、aldh1a3、aldh1l1和aldh1l2）和3個同源基因[25]。ALDH2抑制劑氰胺（cyanamide，CYA）可降低斑馬魚幼魚對乙醇的耐受[18]，提示ALDH在斑馬魚的乙醛代謝中也發(fā)揮著重要作用。由此可見，在斑馬魚中存在與哺乳動物相同或相似的乙醇代謝通路，這是利用斑馬魚作為模型研究酒類功效的基礎(chǔ)。

3 斑馬魚特別適用于高通量篩選和分子機(jī)制解析

除了上述優(yōu)越條件外，斑馬魚具有體積小、飼養(yǎng)成本低、基因組已知且易于編輯、世代間隔時間短、單次產(chǎn)卵量大、易于獲得胚胎以及早期發(fā)育過程中具有光學(xué)透明性、存在突變的透明品系等諸多優(yōu)點，便于開展深入研究[18]。斑馬魚胚胎和幼魚尤其適用于基于表型的大規(guī)模小分子篩選，因為斑馬魚可以有效吸收周圍水環(huán)境中的復(fù)合物等小分子，可將它們放于96孔板，直接吸收小分子，配合近年來發(fā)展起來的人工智能新技術(shù)，使復(fù)雜的大規(guī)模的篩選過程變得簡單易行[26-27]。此外，斑馬魚的基因操作技術(shù)日臻完善，基于Tol2轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)結(jié)合熒光標(biāo)記技術(shù)，已經(jīng)廣泛用于斑馬魚轉(zhuǎn)基因品系的建立[28]。斑馬魚胚胎透明且存在成體透明品系的特征，使得其十分適用于活體標(biāo)記細(xì)胞和分子的實時研究[29]。一旦明確了酒類中功效物質(zhì)的靶分子，可望構(gòu)建熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因品系并建立快速篩選模型，開展大規(guī)模的篩選工作[30]，這在嚙齒類等動物模型中很難做到。近年來基于規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）系統(tǒng)的基因定點突變、敲除和敲入技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于斑馬魚[31-32]。通過對候選靶基因的編輯，可進(jìn)一步深入探討酒類功效分子的作用機(jī)制。由此可見，斑馬魚胚胎及成體既可以進(jìn)行大規(guī)模的功效分子篩選，還可以深入進(jìn)行功效分子的作用機(jī)理研究。

4 斑馬魚用于酒精性肝臟損傷的研究

肝臟是機(jī)體代謝酒精的主要場所，攝入過量酒精常會造成酒精性肝臟疾病的發(fā)生，如酒精性脂肪肝、肝炎、肝硬化甚至肝癌[33]。重度酗酒者中，60%～100%的人在初期會發(fā)生肝臟脂肪變性，其中10%～35%的人會繼發(fā)不同程度的纖維化，10%～15%的人還會發(fā)生肝硬化，1%～2%的人甚至?xí)M(jìn)一步發(fā)展成肝癌[34-35]。在我國，酒精已經(jīng)成為繼病毒性肝炎后，引起肝臟損傷的第二大病因[1]。因此，酒精性肝臟疾病已成為醫(yī)學(xué)研究的重要內(nèi)容。

斑馬魚肝臟擁有在哺乳動物肝臟中已發(fā)現(xiàn)的主要細(xì)胞類型，而且在肝臟基因突變后，表現(xiàn)出與哺乳動物類似的病理特征[36]，經(jīng)環(huán)境污染物刺激后，病理特征與哺乳動物也類似[36]。目前，斑馬魚已經(jīng)被用于研究包括酒精性肝臟疾病在內(nèi)的多種肝臟疾病[36-37]。孵化4 d的斑馬魚幼魚，暴露于體積分?jǐn)?shù)2%的乙醇24 h后，即可引起肝臟異常腫大、脂肪變性和纖維化[38]。斑馬魚成魚暴露于體積分?jǐn)?shù)1%乙醇中3個月，在第一個月，斑馬魚的肝臟出現(xiàn)脂滴聚集，肝臟氣球樣變性、酒精性透明小體，顯示出肝臟脂肪變性和脂肪性肝炎病變；隨著暴露時間的增加，肝臟逐漸出現(xiàn)纖維化，如肝臟細(xì)胞外基質(zhì)中膠原沉積、肝細(xì)胞出現(xiàn)多形性細(xì)胞核，并形成小結(jié)等[11]。斑馬魚成魚暴露于體積分?jǐn)?shù)0.5%乙醇4周，會造成肝臟脂肪變性，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脊和糖原顆粒數(shù)量增加、脂滴及脂質(zhì)顆粒，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的去乙?；?（sirtuin 1，Sirt-1）和肝臟促炎性因子白細(xì)胞介素1β（interleukin 1 beta，IL1β）表達(dá)顯著增加，抗炎的脂聯(lián)素（adiponectin）分子及其受體脂聯(lián)素受體2（adiponectin receptor 2，Adipor2）表達(dá)也顯著增加[12]，表現(xiàn)出酒精性肝臟疾病相似的病理特征[12，36-37]，因此，斑馬魚是一種不可多得的研究酒類對肝臟影響的模式動物。

5 斑馬魚用于酒精引起焦慮的研究

酒精對人類焦慮的影響機(jī)制一直是研究人員關(guān)注的重點之一。飲用低濃度的酒精會使人愉悅、放松，起到緩解壓力或焦慮的作用，但長期飲用則會形成對酒精的依賴，一旦戒酒時，會增加壓力和焦慮[39]。由于壓力、焦慮與酒精依賴之間關(guān)系復(fù)雜，潛在的分子和細(xì)胞機(jī)制到目前為止尚未明了[40]。近年來，作為一種適合進(jìn)行高通量篩選的脊椎動物模型生物，斑馬魚行為分析已被用于研究學(xué)習(xí)、記憶、恐懼和焦慮以及社會行為等方面[41]。多個斑馬魚行為評價模型被用于分析酒精對動物焦慮行為影響的研究，如新型魚缸潛水測試（novel tank diving test）和光/暗選擇試驗（light/dark choice assay）[41]。利用這兩個模型，研究人員發(fā)現(xiàn)急性乙醇暴露可產(chǎn)生顯著的劑量依賴性焦慮作用，慢性間歇性乙醇暴露戒斷后，焦慮癥不能康復(fù)，這與人類飲酒實際情況較為一致[15]?，F(xiàn)代分析技術(shù)可以解析飲用酒類的化學(xué)成分，利用斑馬魚行為分析模型的便捷性和直觀性，可以進(jìn)行高通量的篩選，從而分析目標(biāo)成分的功效。此外，還可以用于酒類新工藝、新產(chǎn)品特性的檢驗等試驗。

6 結(jié)論

綜上所述，斑馬魚是一個具有多種實踐優(yōu)勢的模式生物，在酒精暴露對代謝、肝臟疾病和神經(jīng)行為等影響的研究中已展現(xiàn)出諸多得天獨厚的特性，并在功效成分作用的分子機(jī)理解析方面有巨大的前景，可以預(yù)期斑馬魚在酒類有效成分的功效研究中將大有可為。