楊帆，王帥，龍曼，趙凡，郭勁松，方芳

(重慶大學(xué) 環(huán)境與生態(tài)學(xué)院，重慶 400045)

有關(guān)顆粒污泥EPS的研究比較多[8-10]，但多集中在胞外蛋白方面[11-12]。作為EPS中的主要成分之一，胞外多糖對(duì)顆粒污泥的影響日益受到重視[13]。Sajjad等[14]認(rèn)為胞外多糖中帶負(fù)電的基團(tuán)可與二價(jià)陽(yáng)離子形成架橋作用，將微生物結(jié)合在一起。Lin等[15]認(rèn)為好氧顆粒污泥中的凝膠對(duì)其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定具有重要作用，而多糖則是EPS的主要凝膠成分[16-17]。因此，從胞外多糖的角度深入探討影響Anammox顆粒污泥穩(wěn)定性的原因具有重要意義。

胞外多糖對(duì)Anammox顆粒污泥的形成和穩(wěn)定有重要作用[18]。有學(xué)者指出，胞外多糖通過(guò)形成聚合物來(lái)促進(jìn)微生物間的黏附，從而增強(qiáng)顆粒穩(wěn)定性[13]。此外，多糖交聯(lián)形成水凝膠也是維持顆粒穩(wěn)定的重要因素[16-17]。目前，已在好氧顆粒污泥胞外聚合物中鑒定出alginate多糖和granulan多糖兩種凝膠多糖[15, 19]，它們可以在生物聚集體外形成結(jié)構(gòu)凝膠，有助于聚集體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。胞外多糖通過(guò)氫鍵相連接，促進(jìn)污泥結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[20]。Adav等[21]研究發(fā)現(xiàn)，胞外多糖可以形成網(wǎng)格狀骨干以維持好氧顆粒污泥的穩(wěn)定性。Yuan等[22]認(rèn)為糖是一種具有長(zhǎng)鏈的聚合物，可提供許多結(jié)合位點(diǎn)，并通過(guò)鏈纏結(jié)來(lái)保持顆粒穩(wěn)定[23]。遺憾的是，這些研究沒(méi)有直接從多糖鏈結(jié)構(gòu)角度對(duì)胞外多糖的功能進(jìn)行更全面的認(rèn)識(shí)。

筆者采用可酶解多糖的兩種淀粉酶來(lái)水解Anammox顆粒污泥胞外多糖，研究酶解前后顆粒污泥的穩(wěn)定性，結(jié)合顆粒污泥表面性質(zhì)和XDLVO理論分析微生物的聚集，探討酶解前后污泥EPS的官能團(tuán)組成和胞外多糖空間分布，以期從胞外多糖的角度理解其對(duì)顆粒污泥穩(wěn)定性的影響及機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 反應(yīng)器和廢水性質(zhì)

1.2 實(shí)驗(yàn)方案

多糖是由糖苷鍵結(jié)合形成的糖鏈，為研究胞外多糖對(duì)顆粒污泥穩(wěn)定性的影響及機(jī)理，采用α-淀粉酶和β-淀粉酶分別水解顆粒污泥。α-淀粉酶可隨機(jī)水解α-1,4-糖苷鍵，而β-糖苷鍵則從非還原末端逐次水解α-1,4-糖苷鍵，但切斷至分支點(diǎn)的α-1,6-糖苷鍵前則會(huì)停止。因此，在α-淀粉酶作用下，多糖糖鏈被剪切成短鏈，而經(jīng)β-淀粉酶水解后僅多糖支鏈末端被水解，其主鏈并未被破壞。

將粒徑均勻的30 g顆粒污泥均分為3組并分裝在50 mL離心管中，設(shè)置為對(duì)照組、α-淀粉酶處理組和β-淀粉酶處理組，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。添加酶解液后，將3組污泥在恒溫振蕩器中以150 r/min，37 ℃的條件振蕩1 h。用去離子水沖洗酶解后的污泥，洗去殘留的酶解液，以用于后續(xù)分析，對(duì)于每個(gè)酶處理組和對(duì)照組進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)所用淀粉酶均購(gòu)于Coolaber公司，并按Adav等[21]的實(shí)驗(yàn)方法配置成相應(yīng)濃度的溶液。

表1 酶解顆粒污泥的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3 Anammox顆粒污泥性能測(cè)試

顆粒污泥強(qiáng)度可以用來(lái)反映顆粒污泥酶解前后的穩(wěn)定性，采用超聲法測(cè)定顆粒污泥的強(qiáng)度[25]。將顆粒污泥放入裝有15 mL去離子水的25 mL錐形瓶中，然后將其置于20～25 kHz、65 W的超聲浴中，以2.5(開(kāi))～3 s(關(guān))為周期進(jìn)行超聲處理。收集超聲后的上清液，并用分光光度計(jì)在600 nm處測(cè)定吸光度，該值可代表上清液的濁度。

顆粒污泥表面疏水性采用基于正十二烷-水系統(tǒng)的微生物黏附烷烴試驗(yàn)測(cè)定[26]。將待測(cè)污泥研磨制成細(xì)胞懸浮液，用去離子水將細(xì)胞懸浮液的OD546，0調(diào)整到約0.3，取4 mL懸浮液用漩渦振蕩器充分混合2 min，隨后靜置沉降15 min，測(cè)定OD546.1。另取4 mL懸浮液與1 mL正十二烷充分混合，使用漩渦振蕩器充分混合2 min，隨后靜置15 min以保證分離，此時(shí)部分細(xì)胞懸浮液被吸附到烷烴相，而取水相測(cè)定OD546,2。測(cè)試重復(fù)3次，采用式(1)計(jì)算相對(duì)疏水度。

(1)

Zeta電位可反映污泥表面帶電荷情況，將污泥充分碾磨制成懸浮液，并用0.1 mol/L的NaCl溶液調(diào)整懸浮液的OD546約為0.1，采用納米粒度及Zeta電位分析儀(Zetasizer Nano ZS90,英國(guó))測(cè)試，每個(gè)樣品測(cè)試3次，取平均值。

污泥與水、甲酰胺和1-溴萘的接觸角被用于分析污泥的表面熱力學(xué)特性。接觸角的測(cè)定參照Liu等[27]的方法。用研缽研磨污泥制備污泥懸浮液，以0.45 μm的醋酸纖維素膜過(guò)濾。切下一片膜，用接觸角測(cè)量?jī)x(SDC-100, Shengding, 中國(guó))分別測(cè)定膜上污泥與水、甲酰胺和1-溴萘的接觸角。每個(gè)樣品測(cè)定10次，取平均值。

1.4 表面熱力學(xué)和XDLVO理論

根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)和ζ電位，可以獲得以距離為變量的微生物間的相互作用總能量WT、壓縮雙電層能量WR、范德華能量WA和酸堿相互作用能量WAB[28]，進(jìn)而可以從能量的角度解釋微生物聚集的機(jī)理。WT是WR、WA和WAB的總和，具體計(jì)算過(guò)程和參數(shù)取值在文獻(xiàn)[29]中有詳細(xì)的描述。

1.5 EPS含量及紅外光譜分析

采用堿提法提取顆粒污泥EPS[30]。EPS中的胞外蛋白使用BCA蛋白試劑盒(Solarbio，日本)進(jìn)行測(cè)定[31]，以牛血清蛋白為參考標(biāo)準(zhǔn)。胞外多糖使用蒽酮-硫酸法測(cè)定，并以葡萄糖作為參考標(biāo)準(zhǔn)[32]。

傅里葉紅外光譜(FTIR)可以有效檢測(cè)EPS中的官能團(tuán)[33]。將冷凍干燥的10 mg EPS樣品與KBr混合制成壓片，采用紅外光譜儀(Nicolet iS50, Thermo Fisher Scientific.,美國(guó))在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)對(duì)EPS樣品進(jìn)行紅外光譜掃描。所有FTIR光譜均進(jìn)行歸一化至最大發(fā)射1.0后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.6 共聚焦激光掃描顯微鏡

共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)可以直接觀察多糖的空間分布。參考Adav等[21]和Ni等[18]的方法，分別用20 μL Con A(0.25 g/L)、20 μL CW(0.3 g/L)染色胞外α-D-吡喃葡萄糖多糖和β-D-吡喃葡萄糖多糖。染色后將樣品置于共聚焦激光掃描顯微鏡(TCS SP8 CSU，Leica，德國(guó))下觀察，采用LAS X共聚焦軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并歸一化至最大發(fā)射1.0后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 顆粒污泥穩(wěn)定性

圖1為酶解后Anammox顆粒污泥聚集體外觀形態(tài)和局部顯微鏡圖像。對(duì)照組的污泥形狀規(guī)則，呈橢球狀，邊緣清晰，無(wú)碎片。α-淀粉酶處理組的顆粒污泥外緣發(fā)生輕微溶脹，出現(xiàn)明顯透光現(xiàn)象，但無(wú)明顯破損。β-淀粉酶處理的顆粒污泥中出現(xiàn)了部分小碎片，但并未發(fā)生溶脹，且在顯微鏡下污泥結(jié)構(gòu)密實(shí)，邊界清晰可見(jiàn)。

圖1 Anammox顆粒污泥照片

顆粒污泥結(jié)構(gòu)致密，具有一定的強(qiáng)度。采用超聲法研究多糖對(duì)污泥結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響，A600吸光度的大小可代表污泥經(jīng)超聲處理后上清液的濁度，用于表示污泥解體程度，即間接表明顆粒污泥強(qiáng)度[25]，結(jié)果如圖2所示。β-淀粉酶處理組的顆粒污泥經(jīng)超聲處理后上清液在A600的吸光度迅速上升，表明顆粒發(fā)生了明顯的解體，顆粒污泥強(qiáng)度明顯降低。對(duì)照組和α-淀粉酶處理組的顆粒污泥在超聲處理下A600吸光度的變化較小。與對(duì)照組相比，α-淀粉酶水解后顆粒污泥強(qiáng)度基本不變，但經(jīng)超聲處理20 min后強(qiáng)度略有所下降。

圖2 Anammox顆粒污泥A600吸光度變化

2.2 顆粒污泥表面性質(zhì)

如表2所示，酶解前后污泥表面Zeta電位相差不大，多糖水解并未改變污泥表面的電負(fù)性。與對(duì)照組相比，經(jīng)α-淀粉酶和β-淀粉酶水解后，顆粒污泥的疏水度明顯降低。接觸角測(cè)定結(jié)果顯示，酶處理組與純水的接觸角明顯低于對(duì)照組，同樣表明酶解降低了Anammox顆粒污泥的表面疏水性。同時(shí)，1-溴代萘是一種非極性物質(zhì)，污泥與其接觸角越大則表明污泥親水性越強(qiáng)，即疏水性減弱。

表2 Anammox顆粒污泥表面性質(zhì)

2.3 XDLVO理論分析

以接觸角和Zeta電位值計(jì)算酶解前后Anammox顆粒污泥表面熱力學(xué)參數(shù)，結(jié)果如表3所示。

表3 Anammox顆粒污泥表面熱力學(xué)參數(shù)

進(jìn)一步應(yīng)用XDLVO理論分析微生物相互作用能與其間距的關(guān)系，結(jié)果如圖3所示。淀粉酶處理的顆粒污泥的相互作用總能量(WT)曲線存在能量勢(shì)壘，不利于微生物之間的相互吸引和聚集，而對(duì)照組則沒(méi)有明顯的勢(shì)壘。此外，相對(duì)于壓縮雙電層能量(WR)和范德華能量(WA)，酸堿相互作用能量(WAB)具有很高的值，因而直接影響了WT，并在聚集體的聚集中起關(guān)鍵作用。在3組不同樣品中，對(duì)照組顆粒污泥WAB為負(fù)，表明微生物相互吸引，經(jīng)酶解處理的樣品WAB為正，表明微生物之間相互排斥。

圖3 Anammox污泥熱力學(xué)曲線

2.4 EPS含量及官能團(tuán)組成

圖4為EPS的紅外光譜圖。3 287 cm-1處的振動(dòng)代表O—H的伸縮運(yùn)動(dòng)[35]，酶解后EPS中此峰值有所降低。胞外多糖中與O—H有關(guān)的帶負(fù)電羥基和羧基可被Ca2+、Mg2+等二價(jià)陽(yáng)離子橋接，將細(xì)胞結(jié)合在一起，促進(jìn)微生物聚集。2 883 cm-1附近的吸收峰代表烷烴有機(jī)物和多糖分子中的C—H振動(dòng)[36]，C—H是EPS中最豐富的疏水官能團(tuán)，顆粒污泥被水解后EPS此峰值同樣下降。1 636 cm-1處表示酰胺I區(qū)域的存在[37]，1 562 cm-1處代表了酰胺Ⅱ區(qū)域的C—N和C—H振動(dòng)[37]，代表了疏水性官能團(tuán)[38]，酶解組EPS這些峰值都有所降低。1 050 cm-1的吸收峰歸因于胞外多糖中C—O—C拉伸和C—H的平面內(nèi)彎曲[39]，該峰值只在β-淀粉酶水解后的EPS中發(fā)生變化，表明β-淀粉酶處理并未降低多糖之間的纏結(jié)，這也是顆粒污泥能維持顆粒狀的原因。

圖4 Anammox顆粒污泥EPS的FTIR光譜

2.5 胞外多糖空間分布

原位熒光染色和共聚焦激光掃描顯微鏡可用來(lái)觀察微生物聚集體胞外多聚物的分布情況(圖5)，其中，圖5(c)、(f)、(i)熒光強(qiáng)度曲線圖為沿著顆粒污泥某一直線方向上的熒光強(qiáng)度。對(duì)照組顆粒污泥α-D-吡喃葡萄糖多糖外側(cè)含量低于內(nèi)部，而β-D-吡喃葡萄糖多糖則均勻分布在顆粒污泥中。經(jīng)α-淀粉酶水解后，顆粒污泥邊緣處α-D-吡喃葡萄糖多糖含量明顯降低，這與顆粒污泥外緣在顯微鏡下出現(xiàn)透光現(xiàn)象且發(fā)生明顯溶脹現(xiàn)象一致。經(jīng)過(guò)β-淀粉酶水解后，顆粒污泥中的β-D-吡喃葡萄糖多糖含量明顯降低，且被水解成碎片狀，這可能是顆粒污泥出現(xiàn)了一些細(xì)小的碎片，同時(shí)顆粒穩(wěn)定性發(fā)生明顯下降的原因。

圖5 酶解前后的CLSM圖

3 討論

顆粒污泥被認(rèn)為具有水凝膠的性質(zhì)[17]，水凝膠可通過(guò)氫鍵、疏水性作用和鏈纏結(jié)等保持顆粒污泥的穩(wěn)定[23]。多糖是EPS的主要凝膠成分[15]，可以通過(guò)氫鍵與Ca2+形成穩(wěn)定的鏈間交聯(lián)和橋接，形成將細(xì)胞結(jié)合在一起的“蛋盒模型”[16]。此外，多糖是一種兩親性聚合物，可以將疏水性基團(tuán)插入親水性基團(tuán)中，并通過(guò)這種有序的結(jié)構(gòu)提高顆粒的穩(wěn)定性。因此，采用對(duì)Anammox顆粒污泥進(jìn)行酶解以破壞多糖的結(jié)構(gòu)來(lái)探究多糖對(duì)Anammox顆粒污泥穩(wěn)定性的影響。

顆粒污泥表面特性及熱力學(xué)分析表明，胞外多糖的酶解阻礙了顆粒污泥微生物的聚集，從而影響了顆粒污泥的穩(wěn)定性。疏水性作用對(duì)微生物的聚集非常重要[34]，且疏水性越強(qiáng)顆粒污泥越穩(wěn)定[40]。研究中，酶解導(dǎo)致顆粒污泥疏水度和穩(wěn)定性明顯下降，基于XDLVO理論分析進(jìn)一步表明，酶解提高了污泥聚集的能量勢(shì)壘，阻礙了微生物之間的聚集[41]，從而影響了顆粒污泥內(nèi)部的穩(wěn)定性。因此，多糖可以在疏水性作用下降低微生物聚集的排斥力，促進(jìn)微生物之間的聚集，從而影響顆粒穩(wěn)定性。

α-淀粉酶處理組顆粒污泥被酶解部分發(fā)生明顯溶脹，β-淀粉酶處理組則出現(xiàn)顆粒污泥破碎且顆粒強(qiáng)度下降的現(xiàn)象，這表明多糖之間的交聯(lián)結(jié)合以及鏈結(jié)構(gòu)對(duì)維持顆粒穩(wěn)定性也有著重要作用。Caudan等[20]對(duì)顆粒污泥進(jìn)行染色以及淀粉酶水解的研究發(fā)現(xiàn)，多糖會(huì)在細(xì)菌群落之間交聯(lián)形成水凝膠的屏障，為聚集體提供凝聚力。此外，多糖鏈上豐富的官能團(tuán)可以提供足夠的結(jié)合位點(diǎn)[42]，而其較長(zhǎng)的碳主鏈也可以確保細(xì)胞間相互作用[22]。α-淀粉酶處理組顆粒污泥外緣被酶解，由于對(duì)多糖主鏈以及支鏈的同時(shí)破壞，EPS疏水性官能團(tuán)和羥基含量明顯降低，影響了多糖之間的交聯(lián)結(jié)合，從而導(dǎo)致α-淀粉酶水解后污泥外緣發(fā)生明顯溶脹。而β-淀粉酶僅破壞多糖支鏈末端，因此，β-淀粉酶處理組顆粒污泥外觀并無(wú)明顯變化，這表明多糖主鏈之間的纏結(jié)可以維持顆粒的形態(tài)穩(wěn)定，但顆粒穩(wěn)定性明顯下降，說(shuō)明多糖支鏈末端的結(jié)合位點(diǎn)之間的交聯(lián)也有助于維持顆粒污泥穩(wěn)定。因此，多糖豐富的官能團(tuán)以及長(zhǎng)主鏈可通過(guò)交聯(lián)結(jié)合以及鏈纏結(jié)等作用促進(jìn)顆粒污泥的穩(wěn)定性。

通過(guò)對(duì)顆粒污泥胞外多糖的酶解可以了解到多糖性質(zhì)如何影響聚集體。胞外多糖的疏水性，骨架作用以及形成水凝膠等都會(huì)影響微生物的聚集過(guò)程，進(jìn)而影響聚集體的形態(tài)。不同的反應(yīng)器運(yùn)行工況往往會(huì)影響胞外多糖的性質(zhì)。Yin等[43]研究發(fā)現(xiàn)，在氮不足的情況下，AGS的顆粒結(jié)構(gòu)不規(guī)則且疏松，而且胞外多糖的顯著增加被認(rèn)為是影響顆粒穩(wěn)定性的原因。Liu等[44]研究發(fā)現(xiàn)，更大的剪切力會(huì)刺激胞外多糖的產(chǎn)生，并促進(jìn)造粒。因而可以通過(guò)調(diào)節(jié)反應(yīng)器工況以影響胞外多糖的性質(zhì)，從而影響聚集體形成、形態(tài)以及保持聚集體的穩(wěn)定。

4 結(jié)論

對(duì)Anammox顆粒污泥進(jìn)行酶解的結(jié)果表明，多糖對(duì)顆粒污泥的穩(wěn)定性有著重要作用。經(jīng)α-淀粉酶處理后，顆粒污泥外邊緣出現(xiàn)溶脹，但污泥穩(wěn)定性并無(wú)明顯變化，而經(jīng)β-淀粉酶處理后，顆粒污泥表面并無(wú)變化，但污泥出現(xiàn)破碎且穩(wěn)定性明顯下降。

對(duì)酶解前后污泥表面性質(zhì)的表征發(fā)現(xiàn)，酶解降低了污泥疏水性，但未改變污泥表面電負(fù)性。XDLVO理論的分析表明，Anammox顆粒污泥經(jīng)淀粉酶處理后，污泥微生物聚集的能量勢(shì)壘被提高，即多糖可以促進(jìn)微生物間的聚集從而促進(jìn)顆粒污泥穩(wěn)定性。FTIR結(jié)果表明，經(jīng)淀粉酶水解后，污泥EPS中疏水性官能團(tuán)和羥基含量明顯降低。共聚焦掃描顯微鏡發(fā)現(xiàn)，α-淀粉酶處理組顆粒污泥外緣α-D-吡喃葡萄糖多糖含量明顯下降，而β-淀粉酶處理組β-D-吡喃葡萄糖多糖則呈碎片狀分布。

α-淀粉酶處理組表明胞外多糖的疏水性作用、通過(guò)O—H官能團(tuán)與陽(yáng)離子橋接或相互結(jié)合作用可以促進(jìn)微生物之間的聚集。β-淀粉酶處理組表明胞外多糖長(zhǎng)主鏈之間的纏結(jié)以及支鏈末端豐富的結(jié)合位點(diǎn)橋接形成骨架增強(qiáng)了微生物之間的黏附，有利于顆粒污泥的穩(wěn)定。