金從國，段林燦，沈紅梅，陳曉群，李佳，申昕鷺

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是所有肺癌中最常見的組織學(xué)類型，其5年生存率僅16%[1]。手術(shù)是其首選治療方案，但術(shù)后仍可發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[2]，術(shù)后采取有效的內(nèi)科治療尤為重要。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine-induced killer cells，CIK)是癌癥免疫治療的理想候選細(xì)胞類型，可在體外誘導(dǎo)大量具有腫瘤殺傷作用的外周血單個核細(xì)胞，具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性[3]。鐵皮石斛是一種天然的名貴中藥，具有抗氧化、抗疲勞、增強(qiáng)免疫功能等作用，還可調(diào)控癌細(xì)胞周期抑制癌細(xì)胞增殖，促使其凋亡，并能抑制新生血管生成，發(fā)揮抗腫瘤作用[4]。鑒于此，現(xiàn)觀察鐵皮石斛聯(lián)合CIK應(yīng)用于NSCLC患者術(shù)后治療及其對外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell，CTC)、細(xì)胞免疫功能和預(yù)后的影響，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年2月—2018年6月云南省腫瘤醫(yī)院收治的NSCLC患者360例，采用隨機(jī)、雙盲、平行對照方法分為觀察組和對照組。最終350例完成治療，對照組175例，觀察組175例。2組性別、年齡、吸煙史、飲酒史、家族遺傳史、基礎(chǔ)病、術(shù)后治療方式、TNM分期、病理類型、腫瘤大小、KPS評分比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(201601025)，患者及其家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①均行肺癌根治手術(shù)治療，術(shù)后組織病理學(xué)證實(shí)為NSCLC；②術(shù)后除常規(guī)放化療外未行其他抗腫瘤治療；③KPS評分≥60分，預(yù)計(jì)生存期大于12個月；④中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)≥1.5×109/L，血小板計(jì)數(shù)≥100×109/L；⑤依從性較好。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他類型肺癌或合并其他部位惡性腫瘤；②嚴(yán)重心、肺、肝、腎疾病，自身免疫性疾病，不可控制的活動性感染；③妊娠或哺乳期女性；④對本研究所選治療藥物過敏或治療禁忌。(3)剔除標(biāo)準(zhǔn)：①未遵醫(yī)囑按時按量服用鐵皮石斛者；②CIK治療不足4個療程退出者；③不配合復(fù)診，隨訪失聯(lián)者。

表1 對照組及觀察組臨床資料比較

1.3 治療方法 對照組：采用CIK治療，CIK細(xì)胞制備：采集患者外周血約50 ml加入肝素抗凝試管，分離外周血中單個核細(xì)胞(PBMC)置于Roswell Park Memorial Institute-1640培養(yǎng)基(美國賽默飛公司)，調(diào)整細(xì)胞密度在1×106/ml左右，加入γ-IFN 1 000 U/ml，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱(德國賓德公司)中培養(yǎng)24 h，加入IL-2(美國RD公司)300 U/ml、CD3McAb(美國RD公司)50 ng/ml，每隔3～4 d更換1次培養(yǎng)基，補(bǔ)加IL-2 300 U/ml，培養(yǎng)6 d左右采集CIK細(xì)胞。CIK細(xì)胞回輸：隨機(jī)采集少量CIK細(xì)胞，DxFlEX流式細(xì)胞儀(美國貝克曼庫爾特公司)檢測CD3+CD56+T細(xì)胞比例≥50%，CD3+CD8+T細(xì)胞比例≥30%，且微生物檢測陰性時，生理鹽水洗滌CIK細(xì)胞3次，將其加入含20%人血白蛋白(瑞士杰特貝林生物制品有限公司，規(guī)格20%/50 ml)和生理鹽水共100 ml液體中靜脈回輸，每次回輸細(xì)胞數(shù)(2～6)×109/ml，1次/d，連續(xù)5 d為1個療程。觀察組：在對照組基礎(chǔ)上服用鐵皮石斛(東源石斛公司)，打碎成粉狀，取100 g泡入茶水中口服，3次/d，連續(xù)服用1個月為1個療程。2組2療程中間間隔2個月，均治療4個療程。

1.4 觀察指標(biāo)與方法 分別于治療前，第一、二、三、四療程后采集患者外周靜脈血2 ml注入肝素抗凝試管混勻，采用DxFlEX流式細(xì)胞儀(美國貝克曼庫爾特公司)檢測以下細(xì)胞。

1.4.1 外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)檢測：取肝素抗凝的全血200 μl，加入 CD45-PC5(購自美國貝克曼庫爾特公司)20 μl、 EpCAM-PE(購自美國BD公司)20 μl和 CK18-FITC(購自英國ABCAM公司)20 μl混勻后避光靜置30 min，加入氯化銨2 ml溶血15 min，CD45-EpCAM+CK18+細(xì)胞計(jì)數(shù)，即CTC計(jì)數(shù)。

1.4.2 外周血T細(xì)胞亞群檢測：取肝素抗凝的全血100 μl，加入 CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3-PC5(購自美國BD公司)10 μl混勻避光室溫靜置30 min，加入氯化銨2 ml溶血15 min，DxFlEX流式細(xì)胞儀檢測CD3+細(xì)胞(CD45+CD3+細(xì)胞)、CD4+細(xì)胞(CD45+CD3+CD4+細(xì)胞)、CD8+細(xì)胞(CD45+CD3+CD8+細(xì)胞)。

1.4.3 自然殺傷(NK)細(xì)胞、CIK細(xì)胞檢測：取肝素抗凝的全血100 μl，加入 CD45-PC5 20 μl、CD3-FITC/CD16+56-PE(購自美國貝克曼庫爾特公司)混勻避光室溫靜置30 min，加入氯化銨2 ml溶血15 min，DxFlEX流式細(xì)胞儀檢測NK細(xì)胞(CD45+CD3-CD16+56+細(xì)胞)，CIK細(xì)胞(CD45+CD3+CD16+56+細(xì)胞)。

1.4.4 不良反應(yīng)：記錄治療期間患者體溫升高、興奮、失眠、頭暈、惡心、中毒、過敏等不良反應(yīng)。

1.4.5 隨訪情況：所有患者均定期復(fù)診和接受電話隨訪，隨訪截止時間為2021年6月。統(tǒng)計(jì)隨訪期間腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況。無疾病進(jìn)展生存時間定義為病理確診至腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的時間，總生存時間定義為病理確診至因任何原因?qū)е滤劳龅臅r間或隨訪截止時間。

2 結(jié) 果

2.1 2組外周血CTC水平比較 治療前、第一療程后，2組外周血CTC計(jì)數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療第二、三、四療程后，隨療程延長2組外周血CTC計(jì)數(shù)均逐漸降低，且觀察組低于對照組(P<0.05)，見表2。

2.2 2組外周血T細(xì)胞亞群比較 治療前、第一療程后2組外周血CD3+細(xì)胞占比、CD4+細(xì)胞占比、CD4+/ CD8+比值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療第二、三、四療程后，隨療程延長2組外周血CD3+細(xì)胞占比、CD4+細(xì)胞占比、CD4+/ CD8+比值均逐漸增加，且觀察組高于對照組(P<0.05)。但2組治療前后CD8+細(xì)胞占比比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

2.3 2組外周血NK細(xì)胞、CIK細(xì)胞比較 治療前、第一療程后2組外周血NK細(xì)胞占比、CIK細(xì)胞占比比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療第二、三、四療程后，隨療程延長2組外周血NK細(xì)胞占比、CIK細(xì)胞占比均逐漸升高，且觀察組高于對照組(P<0.05),見表4。

2.4 2組不良反應(yīng)比較 2組治療期間均未出現(xiàn)中毒、過敏病例。對照組出現(xiàn)體溫升高2例，失眠1例，頭暈2例，不良反應(yīng)發(fā)生率2.86%；觀察組出現(xiàn)體溫升高1例，惡心1例，不良反應(yīng)發(fā)生率1.14%。2組均未行特殊治療，停藥后好轉(zhuǎn)。2組不良反應(yīng)發(fā)生率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.502，P=0.220)。

2.5 2組生存情況比較 隨訪截止時間為2021年6月，中位隨訪時間48(36～60)個月。350例患者隨訪失聯(lián)12例，隨訪期間復(fù)發(fā)10例，轉(zhuǎn)移32例，死亡253例，最終無疾病進(jìn)展生存43例，總生存85例。觀察組總生存率、無疾病進(jìn)展生存率均高于對照組(χ2/P=9.667/0.002，13.820/<0.001)，見表5、圖1。

表2 對照組及觀察組患者外周血CTC計(jì)數(shù)比較個)

表4 對照組及觀察組患者外周血NK細(xì)胞、CIK細(xì)胞比較

3 討 論

CTC是脫離實(shí)體病變瘤進(jìn)入外周血循環(huán)的癌細(xì)胞，負(fù)責(zé)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散，與腫瘤隱性微轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的前提和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。越來越多研究發(fā)現(xiàn)，不論是治療前，還是切除原發(fā)病灶后，亦或復(fù)發(fā)腫瘤患者體內(nèi)均可檢測到不同水平的CTC[5]。外周血CTC檢測被認(rèn)為是液體活檢的一部分，屬于相對無創(chuàng)且容易獲得的癌組織樣本，可反映肺癌實(shí)際狀態(tài)，故常被用于指導(dǎo)NSCLC臨床治療及評估NSCLC術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[6-8]。免疫細(xì)胞介導(dǎo)先天免疫反應(yīng)和誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫反應(yīng)，是機(jī)體抗腫瘤免疫的重要機(jī)制，CD4+T 細(xì)胞分泌的干擾素-γ，腫瘤抗原特異性 IgG具有重要的清除腫瘤的功能[9]。NK細(xì)胞是先天免疫系統(tǒng)的主要細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞，占循環(huán)淋巴細(xì)胞的5%～15%，可裂解腫瘤細(xì)胞，具有增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞殺傷的作用[10]。樹突狀細(xì)胞是最有效的抗原呈遞細(xì)胞，能激活幼稚細(xì)胞和記憶免疫反應(yīng)，基于樹突狀細(xì)胞的細(xì)胞免疫療法可增強(qiáng)抗腫瘤免疫力[11]。CIK是效應(yīng)CD3+CD56-、CD3-CD56+和CD3+CD56+自然殺傷 T 細(xì)胞的異質(zhì)群體，自外周血單個核細(xì)胞體外擴(kuò)增，對腫瘤靶標(biāo)具有廣泛而較強(qiáng)的溶細(xì)胞活性[12]。

圖1 對照組和觀察組NSCLC患者無疾病進(jìn)展和總生存曲線比較

表3 對照組及觀察組患者外周血T細(xì)胞亞群比較

表5 對照組及觀察組患者生存情況比較 [例(%)]

本結(jié)果表明，鐵皮石斛、CIK治療后均可抑制外周血CTC水平，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能，提高機(jī)體抗腫瘤能力，而鐵皮石斛聯(lián)合CIK治療可更有效地提高機(jī)體細(xì)胞免疫功能，降低CTC水平，對抑制腫瘤細(xì)胞復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移可能有益。CIK細(xì)胞具有T淋巴細(xì)胞抗瘤活性及NK細(xì)胞非MHC限制性殺傷腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)，不影響機(jī)體免疫功能，直接殺傷腫瘤細(xì)胞，增加機(jī)體免疫功能，被認(rèn)為是腫瘤過繼細(xì)胞免疫治療的首選，CIK在腫瘤免疫治療中也得到廣泛的應(yīng)用，取得了顯著的效果[13-14]。鐵皮石斛是我國傳統(tǒng)中藥材，其主要成分為鐵皮石斛多糖，可抑制超氧化物歧化酶、丙二醛和谷胱甘肽過氧化物酶水平，發(fā)揮抗氧化作用，還可上調(diào)Bax和下調(diào)抗凋亡B細(xì)胞淋巴瘤2、表皮生長因子、表皮生長因子受體等抑制癌細(xì)胞增殖，促使癌細(xì)胞凋亡[15]。鐵皮石斛中天然黃酮苷對癌癥治療也有重要價值，體外研究顯示，鐵皮石斛天然黃酮苷ViceninⅡ可抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β/Smad和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路，促使其失活，進(jìn)而抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導(dǎo)的肺腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[16]。除抗氧化、抗腫瘤作用之外，鐵皮石斛還具有免疫調(diào)節(jié)作用，其成分2,3-O-乙酰化-1,4-β-d-葡甘露聚糖可通過Toll樣受體4和髓樣分化因子88信號通路激活核因子-κB，調(diào)節(jié)免疫炎性反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能[17-18]。因此，鐵皮石斛和CIK治療更有助于增強(qiáng)NSCLC患者術(shù)后免疫功能，清除循環(huán)血中殘余腫瘤細(xì)胞。

從隨訪結(jié)果可以看出，鐵皮石斛和CIK聯(lián)合治療對延長肺癌患者術(shù)后生存有益，這與其增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能，提高抗腫瘤反應(yīng)有關(guān)。鐵皮石斛無明顯不良反應(yīng)，目前鮮有報(bào)道服用鐵皮石斛帶來的不良反應(yīng)，本研究觀察組治療期間亦未發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)，僅出現(xiàn)CIK治療相關(guān)的體溫升高、興奮失眠等癥狀，總不良反應(yīng)發(fā)生率與對照組無差異，說明增加鐵皮石斛治療并不增加不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)，具有較高的安全性。

綜上，NSCLC患者術(shù)后通過鐵皮石斛聯(lián)合CIK治療可明顯降低外周血CTC水平，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能，有助于預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，延長患者生存時間，優(yōu)于單獨(dú)CIK治療。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

金從國：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫；段林燦：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)；沈紅梅：論文審核;陳曉群：資料搜集整理，論文修改;李佳：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;申昕鷺：課題設(shè)計(jì)