王桂芳，索金偉，王 哲，成 豪，胡淵淵，張可偉，吳家勝

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300；2. 浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 311300；3. 浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004）

果實的生長發(fā)育一般具有較長周期，外形上表現(xiàn)為由小變大，內(nèi)部伴隨著營養(yǎng)物質(zhì)的積累與代謝[1]。果實大小主要由細胞分裂和細胞膨大2個階段決定，發(fā)育前期主要以細胞分裂為主，而細胞膨大主要是從細胞分裂結(jié)束后開始的[1]。不同物種果實的生長發(fā)育有著不同的特性。核桃Juglans regia、板栗Castanea mollissima等生長發(fā)育隨時間變化呈現(xiàn)“S”形的生長曲線[2]，桃Amygdalus persica、杏Armeniaca vulgaris等在生長中會有一個緩慢期，生長曲線呈雙“S”形[3]。山核桃Carya cathayensis果實5月初開始膨大，6—7月果實快速生長[4]。銀杏Ginkgo biloba授粉后40～80 d為快速膨大階段，縱徑和體積增長顯著[5]。果實膨大過程涉及一系列生理生化變化[1]。果實內(nèi)部光合同化物的積累與代謝是果實生長發(fā)育的調(diào)控中心環(huán)節(jié)，直接影響果實膨大過程。蔗糖是植物光合同化物的主要積累物質(zhì)，是重要的能量載體，在果實中積累后會被分解為葡萄糖和果糖[6]。這些小分子還原糖進一步參與糖酵解、三羧酸循環(huán)等過程，為果實早期發(fā)育和細胞膨大提供能量和碳骨架[7]。同時，蔗糖、葡萄糖、果糖通過區(qū)隔積累于液泡中，使果實內(nèi)部保持較高的膨壓，促進水分吸收，從而促進果實細胞膨大[8]。此外，旺盛的蔗糖代謝也有利于果實內(nèi)部內(nèi)源激素的積累與分配，提高果實對營養(yǎng)物質(zhì)的調(diào)運能力，使更多的光合同化產(chǎn)物、礦質(zhì)元素源源不斷地流入正在發(fā)育的果實細胞，滿足果實生長發(fā)育的營養(yǎng)需求[8]。果實中的蔗糖主要源于葉片光合同化物的韌皮部輸入，運輸?shù)綆炱鞴俸笸ㄟ^其代謝過程被進一步利用[9]。蔗糖代謝過程涉及到多種酶，主要有蔗糖合成酶(sucrose synthase, SS)，蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase, SPS)和蔗糖轉(zhuǎn)化酶(invertase)。這些蔗糖代謝相關(guān)酶的活性變化對果實發(fā)育過程有著重要影響[10]。研究發(fā)現(xiàn)：果實中蔗糖磷酸合成酶活性與蔗糖積累呈正相關(guān)關(guān)系[11]。GALTIER等[12]在番茄Lycopersicon esculentum中過量表達蔗糖磷酸合成酶基因，轉(zhuǎn)基因番茄中蔗糖磷酸合成酶蛋白含量升高，同時其含糖量也增加。蔗糖水解成己糖后可為果實發(fā)育提供能量，參與蔗糖水解的酶主要有蔗糖轉(zhuǎn)化酶和蔗糖合成酶。蔗糖轉(zhuǎn)化酶根據(jù)在細胞中的定位不同可以分為細胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶(cell wall invertase)、液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶(vacuolar invertase)和細胞質(zhì)蔗糖轉(zhuǎn)化酶(cytoplasmic invertase)[10]。蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性高低可以作為衡量果實庫活力的重要標志[13]。番茄轉(zhuǎn)化酶活性在果實生長發(fā)育的整個階段都有較高水平，有利于己糖積累[14]。蜜柑Satsuma mandarin果實快速膨大期液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性較高[15]。蔗糖合成酶既可以合成蔗糖也可以分解蔗糖。在果實膨大過程中，蔗糖合成酶主要起著分解蔗糖的作用[16]。此外，果實內(nèi)部蔗糖代謝過程也會受到植物激素、光照和水分等因子的影響。研究發(fā)現(xiàn)：吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)能夠增強蔗糖運輸，促進蔗糖向果肉細胞擴散[17]。葡萄Vitis vinifera果實發(fā)育前期，IAA和赤霉素(gibberellins，GAs)促進了果實中蔗糖的輸入[18]。外源GA處理通過增強蔗糖轉(zhuǎn)化酶編碼基因表達，提高果實蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性，促進枇杷Eriobotrya japonica等果實膨大[19]。

香榧Torreya grandis ‘Merrillii’是紅豆杉科Taxaceae榧樹屬Torreya植物，是中國特有的珍稀干果。香榧種仁營養(yǎng)豐富，具有很高的保健、藥用和綜合開發(fā)利用價值[20?22]。然而，人們在長期的生產(chǎn)實踐中發(fā)現(xiàn)，香榧種實膨大率低，部分香榧林分膨大率不足5%，嚴重影響香榧的產(chǎn)量和栽培效益，成為限制香榧產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。本研究通過分析香榧種實膨大過程中蔗糖積累與代謝規(guī)律，探討內(nèi)源激素動態(tài)變化及其與蔗糖代謝之間的相關(guān)性，初步闡明蔗糖及其代謝對香榧種實膨大的影響。同時，篩選鑒定蔗糖代謝關(guān)鍵酶相關(guān)基因，分析蔗糖代謝對香榧種實膨大的調(diào)控作用。研究結(jié)果將為闡明香榧種實發(fā)育機制奠定基礎(chǔ)，同時為提高種實產(chǎn)量、開展良種選育等提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

本研究試驗地位于浙江省杭州市臨安區(qū)錦源村香榧生態(tài)化種植示范基地(30°09′45″N，119°42′36″E)。該種植基地屬亞熱帶季風(fēng)氣候，年均日照時數(shù)為1 710～2 100 h，年均氣溫為15.0～18.0 ℃，年均降水量為980.0～2 000.0 mm?；貎?nèi)的香榧于2007年種植，每年施用復(fù)合肥2～3次，有機肥隔年施用1次。

1.2 種實形態(tài)觀察及生長指標測定

本研究在香榧種實膨大期的不同階段，分別于種實突破種鱗后的30 (5月1日)、60 (6月1日)和90 d時 (7月1日)進行香榧種實樣品采集。選取長勢一致、掛果良好的3株香榧實驗樹，分別于東、南、西、北方向各隨機采集香榧種實10粒(3株樹共120粒)。香榧種實采后放置在冰盒中，立即運回實驗室，去除有損傷的種實。部分種實用于形態(tài)觀察、拍照和含水率測定，其余種實分別取假種皮和種仁組織，切碎后立即用液氮速凍，在?80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。種實橫縱徑用游標卡尺測量，其中以種實中部橫斷面的直徑作為橫徑；單粒質(zhì)量用分析天平(0.001 g)測量，105 ℃殺青0.5 h后，置于80 ℃烘箱中烘至恒量以測定干質(zhì)量，并計算相對含水率。體積采用排水法測定。根據(jù)香榧種實橫縱徑、單粒質(zhì)量、體積變化，將香榧種實生長發(fā)育過程分為幼果期(授粉受精至翌年4月)、膨大期(5—7月)、成熟期 (7—9月)。

1.3 蔗糖、葡萄糖和果糖和淀粉質(zhì)量分數(shù)測定

蔗糖、葡萄糖、果糖和淀粉質(zhì)量分數(shù)參照蒽酮比色法測定。

1.4 香榧種實內(nèi)源激素的測定

取0.1 g樣品，液氮研磨至粉末，置2.5 mL甲醇溶液(甲醇∶水體積比為80∶20)中，于40 ℃下萃取2 h。15 000×g離心10 min，上清液用0.22 μm濾膜過濾并用氮氣干燥，甲醇溶液(甲醇與水體積比為30∶70)復(fù)溶后4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)(LC-MS/MS)對植物激素進行分離和分析，使用Acquity UPLC BEH C18柱 (1.7 μm，2.1 mm×100 mm)在 40 ℃ 下以 0.3 mL·min?1的流速分離樣品。IAA、GA3、GA4等質(zhì)量分數(shù)參照ZHAO等[23]的方法測定。

1.5 糖代謝相關(guān)酶活性測定

蔗糖磷酸合成酶和細胞質(zhì)蔗糖轉(zhuǎn)化酶參照NIELSEN等[24]和LOWELL等[25]的方法提取和測定。液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶和細胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性參照TANG等[26]的方法測定。酶活性單位為μmol·mg?1·min?1。

1.6 香榧種實轉(zhuǎn)錄組分析

使用RNAprep植物總RNA提取試劑盒(中國北京天根生化)提取各個發(fā)育階段種仁的總RNA。使用 NanoDrop ND-1000分光光度計 (NanoDrop Technologies Inc.，美國)和瓊脂糖凝膠電泳檢測總 RNA 的濃度和質(zhì)量。每個樣品使用 3 μg RNA構(gòu)建cDNA 文庫，利用 Illumina Hi Seqogies平臺進行測序。

對原始下機數(shù)據(jù)進行過濾去除低質(zhì)量序列后，利用軟件Trinity v.6.0組裝mRNA序列，并使用美國國家生物信息中心(NCBI)非冗余蛋白質(zhì)序列(Nr，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，NCBI非冗余核苷酸序列(Nt，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，瑞士蛋白數(shù)據(jù)庫(SwissProt，http://www.uniprot.org/)，同源蛋白質(zhì)簇 (COG, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)，京都基因和基因組百科全書 (KEGG, http://www.genome.jp/kegg/)和GO數(shù)據(jù)庫(GO, http://www.geneology.org/)進行單基因簇(unigene)的功能注釋。利用FPKM法計算基因虛擬表達量，差異表達基因(differentially expressed gene, DEG)應(yīng)滿足差異倍數(shù)|log2A|≥2[A表示差異倍數(shù)或變化倍數(shù)(flod change)]、錯誤發(fā)現(xiàn)率[false discovery rate(FDR)]≤0.001、樣本間的差異由抽樣誤差所致的概率小于0.05 (P＜0.05)等條件，并通過GO和KEGG途徑富集分析差異表達基因的功能。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016進行數(shù)據(jù)整理與分析，所有數(shù)據(jù)均是至少3次生物學(xué)重復(fù)的平均值±標準誤；采用SPSS 22.0進行差異顯著性和相關(guān)性分析，并利用Cytoscape 3.0軟件構(gòu)建相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 香榧種實膨大過程中形態(tài)及生長指標變化

由圖1可知：香榧種實膨大過程可分為3個階段，分別是種實突破種鱗后的0～30、30～60和60～90 d，其中，種實突破種鱗后的30～60 d是香榧種實質(zhì)量和體積增大的關(guān)鍵時期。這一階段種實橫徑、縱徑、單粒質(zhì)量和體積都明顯增大，種仁從半透明狀逐漸固化變白，面積占據(jù)整個種實的絕大部分(圖1A～C)。種實突破種鱗后的60～90 d是香榧種實內(nèi)部種仁固化的重要階段。這一階段形態(tài)上，中種皮結(jié)構(gòu)更為明顯，種仁進一步固化充實；種實大小(橫徑、縱徑)、單粒質(zhì)量、體積雖然仍在增大，但趨勢緩慢；種實突破種鱗后90 d時，種實大小和質(zhì)量均與種實突破種鱗后60 d時，相差不大(圖1A～C)。然而，香榧種實膨大過程中假種皮和種仁含水率變化有較大差異，假種皮含水率從種實突破種鱗后30～90 d呈緩慢上升至平穩(wěn)趨勢，而種仁含水率則逐漸下降，尤其是種實突破種鱗后60 ～90 d含水率顯著(P＜0.05)降低 (圖 1D)。

圖1 香榧種實膨大期生長指標變化Figure 1 Changes of growth indexes during T. grandis ‘Merrillii’ seed expansion stages

2.2 種實膨大期糖質(zhì)量分數(shù)及相關(guān)代謝酶活性變化

香榧種實膨大過程中，蔗糖、葡萄糖、果糖以及淀粉質(zhì)量分數(shù)在假種皮和種仁中變化顯著(P＜0.05)，且假種皮和種仁間各物質(zhì)質(zhì)量分數(shù)變化趨勢不同(圖2)。種實突破種鱗后30～90 d，假種皮中蔗糖質(zhì)量分數(shù)從 49.70 mg·g?1上升至 75.83 mg·g?1，隨后又下降至 57.14 mg·g?1；種仁中蔗糖質(zhì)量分數(shù)則持續(xù)下降，在種實突破種鱗后 60～90 d 下降明顯，從 82.89 mg·g?1下降至 55.82 mg·g?1(圖 2A)。隨著香榧種實的膨大，葡萄糖和果糖質(zhì)量分數(shù)在假種皮中同樣先上升后下降，至種實突破種鱗后90 d時分別為5.90和37.0 mg·g?1；種仁中兩者質(zhì)量分數(shù)均顯著下降(P＜0.05)，從種實突破種鱗后60～90 d階段下降了約50% (圖2B～C)。假種皮中淀粉質(zhì)量分數(shù)呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，從種實突破種鱗后30 d時的462.07 mg·g?1下降到 90 d 時的 254.05 mg·g?1，種仁中淀粉則在種實突破種鱗后 90 d 時顯著積累(P＜0.05) (149.72 mg·g?1)，為 30 d 時的 1.5 倍 (圖 2D)。

圖2 香榧種實膨大期蔗糖(A)、葡萄糖(B)、果糖(C)和淀粉(D)質(zhì)量分數(shù)變化Figure 2 Changes of sucrose (A), glucose (B), fructose (C) and starch (D) contents in aril and kernel during T. grandis ‘Merrillii’ seed expansion

蔗糖代謝相關(guān)酶活性分析發(fā)現(xiàn)：香榧種實膨大過程中，蔗糖磷酸合成酶在假種皮中一直呈現(xiàn)上升趨勢，酶活性從 0.46 μmol·mg?1·min?1升高至 1.16 μmol·mg?1·min?1，種仁中蔗糖磷酸合成酶活性則逐漸下降，種實突破種鱗后 90 d時的活性僅為種實突破種鱗后 30 d時的28.82%(圖3A)。參與蔗糖水解的細胞質(zhì)蔗糖轉(zhuǎn)化酶、液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶和細胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶隨著種實的膨大在假種皮中均呈現(xiàn)上升趨勢，酶活性最大值分別為21.91、23.49以及4.93 μmol·mg?1·min?1，而三者在種仁中的活性均有所下降，其中細胞質(zhì)蔗糖轉(zhuǎn)化酶和液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性在種實突破種鱗后30～60 d無顯著差異，而從種實突破種鱗后 60～90 d 顯著下降 (P＜0.05)，分別為 3.69和 4.63 μmol·mg?1·min?1，細胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性則持續(xù)下降，至種實突破種鱗后 90 d 時，活性僅 0.97 μmol·mg?1·min?1(圖 3B～D)。

圖3 香榧種實膨大期蔗糖磷酸合成酶(A)、細胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶(B)、液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶(C)和細胞質(zhì)蔗糖轉(zhuǎn)化酶(D)活性變化Figure 3 Changes of sucrose phosphate synthase (A), cell wall invertase (B), vacuolar invertase (C) and cytoplasmic invertase (D) activities in aril and kernel during T. grandis ‘Merrillii’ seed expansion

2.3 種實膨大期內(nèi)源激素質(zhì)量分數(shù)變化

內(nèi)源激素質(zhì)量分數(shù)變化分析發(fā)現(xiàn)：隨著香榧種實膨大，假種皮中GA4、GA3、水楊酸(SA)質(zhì)量分數(shù)總體呈現(xiàn)顯著積累，并在種實突破種鱗后90 d時達到最高值，分別為種實突破種鱗后30 d時的2、11和8倍，而IAA、脫落酸(ABA)、茉莉酸(JA)和茉莉酸異亮氨酸(JA-ILE)質(zhì)量分數(shù)則顯著降低(P＜0.05)(表1)。此外，乙烯前體物質(zhì)—1-氨基-環(huán)丙烷羧酸(ACC)和多種細胞分裂素(DHZ、tZR、IP等)質(zhì)量分數(shù)也顯著下降(P＜0.05)。種仁中，GA3、SA、ABA也隨著種實膨大逐漸積累，其中ABA質(zhì)量分數(shù)為922.31 ng·g?1。而GA4、IAA、JA、JA-ILE和絕大多數(shù)細胞分裂素[DHZ、tZR、IP、反式玉米素(tZ)]質(zhì)量分數(shù)則顯著降低(P＜0.05) (表1)。

表1 香榧種實膨大期內(nèi)源激素質(zhì)量分數(shù)變化分析Table 1 Analysis of endogenous hormone contents in aril and kernel during T. grandis ‘Merrillii’ seed expansion

2.4 種實膨大期糖代謝及激素質(zhì)量分數(shù)相關(guān)性分析

相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：假種皮中葡萄糖、果糖、淀粉質(zhì)量分數(shù)以及蔗糖代謝相關(guān)酶與種實大小密切相關(guān)，其中葡萄糖、果糖質(zhì)量分數(shù)與種實橫、縱徑，單粒質(zhì)量和含水率呈正相關(guān)關(guān)系，與淀粉質(zhì)量分數(shù)則呈負相關(guān)關(guān)系；蔗糖轉(zhuǎn)化酶和蔗糖磷酸合成酶均與種實大小正相關(guān)(圖4A)。同時，假種皮中蔗糖、葡萄糖、果糖質(zhì)量分數(shù)與細胞質(zhì)蔗糖轉(zhuǎn)化酶、液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶及細胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性變化呈正相關(guān)，而淀粉質(zhì)量分數(shù)與葡萄糖、果糖質(zhì)量分數(shù)，細胞質(zhì)蔗糖轉(zhuǎn)化酶、液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶、細胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶及蔗糖磷酸合成酶活性均呈負相關(guān)關(guān)系(圖4A)。與激素質(zhì)量分數(shù)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：大多數(shù)激素(GA3、IAA、JA、ACC、DHZ、TZR等)與蔗糖、葡萄糖、果糖質(zhì)量分數(shù)以及各種糖代謝酶活性呈負相關(guān)，與種實大小也表現(xiàn)出負相關(guān)關(guān)系(圖4A)。

隨著香榧種實膨大，種仁中蔗糖、葡萄糖、果糖與淀粉質(zhì)量分數(shù)呈負相關(guān)關(guān)系，與細胞質(zhì)蔗糖轉(zhuǎn)化酶、液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶、細胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶和蔗糖磷酸合成酶活性呈正相關(guān)關(guān)系，同時淀粉質(zhì)量分數(shù)與香榧種實單粒質(zhì)量和體積也呈正相關(guān)關(guān)系(圖4B)。與激素的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：GA4和IAA質(zhì)量分數(shù)與蔗糖、葡萄糖、果糖質(zhì)量分數(shù)和4種蔗糖代謝酶活性呈正相關(guān)，而與淀粉質(zhì)量分數(shù)呈負相關(guān)(圖4B)。此外，多種激素質(zhì)量分數(shù)與種仁含水量呈正相關(guān)，SA與種實單粒質(zhì)量和體積也呈正相關(guān)關(guān)系(圖4B)。

圖4 香榧種實膨大期假種皮(A)和種仁(B)中各生長指標、糖質(zhì)量分數(shù)、酶活性和激素質(zhì)量分數(shù)間相關(guān)性分析Figure 4 Correlation analysis of growth index, sugar content, enzyme activity and hormone content in aril (A) and kernel tissues (B) during T.grandis ‘Merrillii’ seed expansion

2.5 種實膨大期糖代謝相關(guān)酶基因表達分析

為了深入分析香榧種實膨大過程中，蔗糖代謝、淀粉代謝以及激素信號途徑相關(guān)基因表達情況及其相互調(diào)控與種實的膨大關(guān)系等，本研究對各膨大階段的香榧種實進行轉(zhuǎn)錄組測序。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)：與種實突破種鱗后30 d相比，在種實突破種鱗后60 d時共鑒定到12 346個差異表達基因，其中，5 456個上調(diào)表達，6 884個下調(diào)表達。與種實突破種鱗后30 d相比，種實突破種鱗后90 d時共鑒定到22 668個差異表達基因，包括10 569個上調(diào)表達基因和12 099個下調(diào)表達基因(圖5A)。KEGG代謝途徑富集分析發(fā)現(xiàn)：在前20個被顯著富集的代謝途徑中，淀粉和蔗糖代謝、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑均被顯著富集(圖5B)。

圖5 香榧種實膨大期差異表達基因(A)及KEGG代謝途徑富集(B)分析Figure 5 Analysis of differential expression genes (A) and KEGG pathway enrichment (B) during T.grandis ‘Merrillii’ seed expansion

進一步差異表達基因分析發(fā)現(xiàn)：36個單基因簇參與香榧種實中蔗糖的轉(zhuǎn)運、合成和水解過程；16個單基因簇參與淀粉的合成與分解過程(圖6A)。其中，蔗糖合成酶編碼基因隨著香榧種實膨大表達量逐漸降低(圖6B)；蔗糖結(jié)合蛋白 (sucrose-binding protein，SBP)和蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白 (sucrose transport protein，SUT)呈明顯上調(diào)表達趨勢，但參與蔗糖及葡萄糖和果糖運輸?shù)奶寝D(zhuǎn)運蛋白(sugar transporter sweet，Sweet)基因呈下調(diào)表達(圖6B)。此外，參與蔗糖水解的細胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶、細胞質(zhì)蔗糖轉(zhuǎn)化酶和液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶其編碼基因隨著香榧種實膨大既有上調(diào)又有下調(diào)情況。參與淀粉合成的可溶性淀粉合成酶 [soluble starch synthase (SSS)]、顆粒結(jié)合型淀粉合成酶 [granule-bound starch synthase (GBSS)]、淀粉分支酶[starch branching enzyme (SBE)]和異淀粉酶[isoamylase (ISA)]基因表達量均隨著香榧種實膨大而呈現(xiàn)上調(diào)表達趨勢(圖6B)；參與淀粉水解的α-淀粉酶(alpha-amylase，AMY)和β-淀粉酶(betaamytase，BAM)香榧種實膨大過程中則分別上調(diào)表達和下調(diào)表達。

圖6 香榧種實膨大過程中蔗糖代謝途徑(A)及相關(guān)基因表達(B)分析Figure 6 Sucrose metabolism pathway (A) and the relative gene expression (B) analysis during T. grandis ‘Merrillii’ seed expansion

3 討論

香榧種實從授粉到成熟跨2 a，歷時17個月之久，其雌球花4月開花授粉，9月完成受精，形成的幼果對生并包裹在種鱗中。次年4月，幼果開始啟動細胞分裂和膨大，5—7月進入快速生長期，種實橫徑、縱徑、單粒質(zhì)量和體積都明顯增大，種仁逐漸固化，含水率降低。這一時期的變化是香榧種實產(chǎn)量和品質(zhì)形成的重要基礎(chǔ)，但由于各種內(nèi)外因素的影響，絕大部分香榧幼果在種實膨大期生長緩慢，甚至停止生長，嚴重制約香榧產(chǎn)量。研究[27]已經(jīng)證實：處于膨大期前的香榧幼果授粉受精狀況良好，發(fā)育正常。因此，香榧種實發(fā)育過程中某些重要生理過程的變化是影響香榧種實膨大的關(guān)鍵因素，對這些生理過程的研究也是提高香榧產(chǎn)量的必要前提。

蔗糖作為光合同化物的主要積累形式，其在果實中積累后會被分解為葡萄糖和果糖。這些小分子還原糖進一步參與糖酵解、三羧酸循環(huán)等過程，為果實早期發(fā)育和細胞膨大提供能量和碳骨架[6]。同時，蔗糖水解產(chǎn)物也會進一步合成淀粉，以淀粉形式儲藏[28]。有報道表明：在蠶豆Vicia faba種實發(fā)育過程中，葡萄糖可能調(diào)節(jié)細胞分裂，而蔗糖則調(diào)節(jié)細胞擴張和儲備物沉積[29]。菠蘿Ananas comosus幼果期蔗糖含量呈下降趨勢，蘋果Malus sieversii果實發(fā)育前期果糖和蔗糖含量較低[30]；咖啡Coffea racemosa果實果皮和胚乳之間存在密切的蔗糖運輸，并且果皮中可溶性糖和還原糖含量隨著果實發(fā)育逐漸降低[31]。本研究發(fā)現(xiàn)：香榧假種皮中的蔗糖、葡萄糖、果糖隨著種實膨大先上升后下降，淀粉質(zhì)量分數(shù)不斷下降；種仁中蔗糖質(zhì)量分數(shù)則持續(xù)下降，淀粉逐漸積累。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：假種皮中葡萄糖、果糖質(zhì)量分數(shù)與種實橫縱徑顯著正相關(guān)，與淀粉質(zhì)量分數(shù)顯著負相關(guān)，種仁中各種糖質(zhì)量分數(shù)與種實體積顯著負相關(guān)，淀粉質(zhì)量分數(shù)與種實體積正相關(guān)。以上結(jié)果表明：膨大前期香榧假種皮中的蔗糖以積累為主，而在種實膨大后期蔗糖和淀粉主要以分解為主，以滿足種實的不斷發(fā)育；種仁中蔗糖則一直以分解為主，供給香榧種實膨大和淀粉積累。

蔗糖代謝及其相關(guān)酶活性和基因表達量的高低是衡量果實庫競爭能力強弱的重要指標，與果實大小和產(chǎn)量密切相關(guān)，但不同植物果實中起主導(dǎo)作用的酶不同。研究發(fā)現(xiàn)：蜜柑果實膨大期液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性較高，蔗糖含量隨著液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性下降而逐漸積累[15]。較高活性的細胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶和細胞質(zhì)蔗糖轉(zhuǎn)化酶則有利于番茄和龍眼Dimocarpus longan果實發(fā)育過程中糖向果實中的分配及代謝過程[32?34]。梨Pyrus spp. 果實中蔗糖合成酶活性和蛋白質(zhì)含量在發(fā)育期的梨果實中明顯增加，催化蔗糖的分解代謝和果實干物質(zhì)積累，促進果實增大[35]。糖轉(zhuǎn)運蛋白和蔗糖磷酸合成酶基因的上調(diào)表達對蘋果果實發(fā)育至關(guān)重要[33]。本研究中，隨著香榧種實膨大，蔗糖磷酸合成酶在假種皮中活性上升，而在種仁中活性下降，蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性在香榧假種皮中也顯著上升。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：蔗糖、葡萄糖、果糖、淀粉質(zhì)量分數(shù)與3種蔗糖轉(zhuǎn)化酶和蔗糖磷酸合成酶活性顯著相關(guān)。結(jié)合基因表達分析發(fā)現(xiàn)：參與蔗糖及還原糖運輸?shù)腟BP和SUT在種實膨大過程中顯著上調(diào)表達，參與蔗糖水解的細胞質(zhì)蔗糖轉(zhuǎn)化酶、液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶編碼基因部分轉(zhuǎn)錄本也隨著種實膨大顯著上調(diào)，而細胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶和蔗糖合成酶編碼基因則明顯下調(diào)表達。進一步表明香榧種實膨大過程中假種皮和種仁之間，以及種仁內(nèi)部存在活躍的碳水化合物運輸和代謝過程，且負責(zé)蔗糖水解的酶主要是蔗糖轉(zhuǎn)化酶，細胞質(zhì)蔗糖轉(zhuǎn)化酶和液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶起到重要作用。同時，在種實膨大后期，種仁中參與淀粉合成的SSS、GBSS、SBE均顯著上調(diào)表達，參與淀粉水解的ISA、AMY上調(diào)表達，BAM下調(diào)表達。上述結(jié)果表明：香榧種實膨大早期，蔗糖分解代謝活躍，主要用于香榧種實的快速膨大；膨大后期蔗糖代謝的同時伴隨淀粉合成，有利于種實成熟過程中營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化積累干物質(zhì)。

此外，果實內(nèi)部蔗糖代謝與激素含量變化存在顯著互作關(guān)系，共同調(diào)控果實生長發(fā)育[36]。草莓Fragaria ananassa果實發(fā)育過程中，蔗糖可作為信號分子，誘導(dǎo)細胞內(nèi)ABA合成途徑基因NCEDs的表達，促進ABA的積累[37]。番茄果實發(fā)育早期，果實中生長素積累有利于蔗糖向果實中運輸及代謝[38]。N-(2-氯-4-吡啶基)-N-苯基脲 (N-(2-chloro-4-pyridyl)-N′-phenylurea, CPPU)處理后的獼猴桃 Actinidia chinensis var. deliciosa‘Hayward’果實通過增加含水率，促進果實膨大[39]。1.25 mmol·L?1GA 處理能夠顯著增加桃果實大小以及蔗糖含量[40]。本研究發(fā)現(xiàn)：香榧種實膨大過程中，假種皮中GA4、GA3、SA質(zhì)量分數(shù)總體呈顯著積累模式，種仁中GA3、SA、ABA也隨著種實膨大逐漸積累。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：種仁中GA和IAA質(zhì)量分數(shù)與蔗糖、葡萄糖、果糖質(zhì)量分數(shù)和4種蔗糖代謝酶活性顯著正相關(guān)，表明香榧種實膨大過程中種仁內(nèi)部激素質(zhì)量分數(shù)變化與糖代謝密切相關(guān)。轉(zhuǎn)錄組代謝途徑富集顯示：激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和蔗糖代謝通路在香榧種實膨大過程中均被顯著富集。結(jié)合基因表達分析發(fā)現(xiàn)：香榧種實膨大過程中伴隨GA3和GA4等激素質(zhì)量分數(shù)的增加，蔗糖轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白、細胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶、細胞質(zhì)蔗糖轉(zhuǎn)化酶、液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶編碼基因均呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)表達，表明這些基因的表達可能受到種實內(nèi)部激素質(zhì)量分數(shù)變化的調(diào)控。與之相似，外源GA處理增強了液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶編碼基因VvGIN1和VvGIN2在葡萄果實中的表達，明顯提高蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性，促進糖在果實中的積累與代謝，增加果實體積[19]。同樣，外源噴施細胞分裂素能夠有效提高逆境下番茄果實蔗糖合成酶和細胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性，抑制轉(zhuǎn)化酶抑制蛋白(Invertase inhibitor，INVINH)的表達，增強果實庫活力，促進果實生長[41?42]。這表明香榧種實中激素質(zhì)量分數(shù)變化可能參與調(diào)控蔗糖代謝相關(guān)基因的表達，促進蔗糖的積累與代謝過程，提高種實庫活力，進而調(diào)控香榧種實的膨大，但具體的調(diào)控機制仍有待深入研究。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)：膨大前期香榧假種皮中的蔗糖以積累為主，在種實膨大后期蔗糖和淀粉以分解為主，提供能量和碳骨架，以滿足種實的不斷發(fā)育；種仁中蔗糖則一直以分解為主，一方面供給香榧種實膨大，另一方面逐漸合成淀粉，為后期成熟過程中營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化積累干物質(zhì)。代謝相關(guān)酶活性及基因表達分析表明：香榧種實膨大過程中假種皮和種仁之間，以及種仁內(nèi)部存在活躍的碳水化合物運輸和代謝過程，且負責(zé)蔗糖水解的酶主要是蔗糖轉(zhuǎn)化酶，細胞質(zhì)蔗糖轉(zhuǎn)化酶和液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶起到重要作用。此外，假種皮中GA4、GA3、SA質(zhì)量分數(shù)總體呈現(xiàn)顯著積累模式，種仁中GA3、SA、ABA也隨著種實膨大逐漸積累，且與蔗糖、淀粉質(zhì)量分數(shù)和代謝酶活性呈現(xiàn)相關(guān)關(guān)系，表明蔗糖代謝的增強可能促進了這些激素的合成和積累，激素質(zhì)量分數(shù)變化進一步調(diào)節(jié)香榧種實中蔗糖代謝活性和基因表達等。