張萌 李悅 張蕾 周明學 李思耐 劉衛(wèi)紅

（首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京市中醫(yī)研究所，北京 100010）

心血管疾病是一類嚴重危害人類健康的疾病。隨著社會經濟的發(fā)展和國民生活方式的轉變，中國心血管病的發(fā)病人數(shù)持續(xù)增加。目前，心血管病死亡已占城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位［1］。動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種大中型動脈的自身免疫性慢性炎癥疾病，是引起心血管疾病的主要病理基礎［2］。

腸道微生物群衍生的代謝物在維持健康的心血管功能方面起著關鍵作用，其代謝失調可能會引發(fā)心血管疾?。?］。通過對3 903例接受擇期冠狀動脈造影的序貫穩(wěn)定性受試者進行隨訪和后續(xù)實驗研究表明，膽堿和甜菜堿對未來主要不良心血管事件的預后價值取決于氧化三甲胺（trimethylamine oxide，TMAO）［4］；一項關于中國城市成年人尿中TMAO水平與冠心病的研究表明，TMAO可促進冠心病的發(fā)生發(fā)展［5］。在接受冠狀動脈造影檢查的受試者中發(fā)現(xiàn)，TMAO水平與臨床AS斑塊負荷之間存在明顯的劑量-反應關系［6］；與對照組相比，F(xiàn)eCl3誘導的頸動脈損傷小鼠的血栓形成隨血漿TMAO濃度增加而增加，當給小鼠飼喂添加TMAO或膽堿的飲食時，血小板聚集顯著增加［7］。這些結果表明，TMAO與AS之間存在因果關系。TMAO可能通過增加AS的發(fā)生率或促進AS的發(fā)展，成為心血管疾病的又一重要危險因素。

1 TMAO的一般特性

1.1 TMAO的化學性質

TMAO化學式為C3H9NO，是一種無色無味的結晶，通常以二水化合物形式存在。TMAO廣泛存在于自然界的水產品中，在海產品中含量較高［8］。

1.2 TMAO的來源及影響因素

TMAO在海洋生物中主要通過內源性合成產生［9］，而人體內的TMAO主要通過腸道微生物代謝產生［10］。人體內的宿主腸道菌群從飲食物攝入的生物堿（主要是膽堿和肉堿）中產生TMAO的前體——三甲胺（trimethylamine，TMA）。其中，膽堿通過腸道菌群中膽堿利用基因簇關鍵基因（膽堿利用基因簇C和膽堿利用基因簇D）編碼膽堿TMA裂解酶的作用以厭氧方式轉化為TMA［11］；肉堿通過基因CntA和CntB編碼的肉堿氧化酶和還原酶轉化為TMA［12］，或先轉化為γ-丁基甜菜堿后再轉化為TMA［13］。產生的大部分TMA被動地吸收到門靜脈循環(huán)中，肝臟中的黃素單加氧酶（flavindependent monooxygenases，F(xiàn)MOs）將TMA氧 化成TMAO，少部分TMA在腸道中經TMA單氧酶的作用直接被氧化成TMAO［14-15］（圖1）。

在所有飲食來源中，食用魚類對循環(huán)中的TMAO濃度影響最大。魚類中含有的TMAO和TMA可直接被吸收，然后被利用或通過尿液排出。實驗顯示，健康年輕人食用魚類后血液循環(huán)中TMAO濃度是食用雞蛋（富含膽堿）或牛肉（富含肉堿和膽堿）的50倍［16］。

腸道微生物也影響TMAO的生物合成。實驗顯示，添加膳食膽堿或TMAO的小鼠（相對于對照組）血漿TMAO水平顯著增加；然而在無菌小鼠中，補充膽堿不能產生TMA，因而不能產生TMAO［8］。另有實驗顯示，以富含普氏桿菌屬為特征的腸型個體血漿TMAO水平高于以富含類桿菌屬為特征的腸型受試者［17］。這些實驗結果表明，腸道微生物的存在及種類對TMAO的生成至關重要。目前，氫氣厭氧球菌、天冬酰胺梭菌、哈氏梭菌、生孢梭菌、遲緩愛德華氏菌、弗格森大腸桿菌、彭納氏變形桿菌和普羅維登西亞雷特氏菌已被證明能夠從膽堿中產生TMA［18］。

FMOs作為TMA氧化過程的催化酶，對TMAO的生成也產生重要影響，其中最主要的是FMO3［19］。實驗證實人FMO3的N61S突變會通過影響氧原子向底物的轉移而導致TMA N-氧合缺陷［20］。膽汁酸可通過FXR介導的途徑上調FMO3的表達而影響TMAO的產生［21］。除此之外，性別也可影響TMAO的產生，與雌性小鼠相比，雄性小鼠肝臟中FMO3的表達和TMAO血液循環(huán)水平較低［22］。

1.3 TMAO的分布、代謝

TMAO在肝臟生物合成后均勻分布于全身［23］。TMAO作為一種小分子化合物很容易經腎臟濾過［24］。超過95%的TMAO通過腎小球濾過和腎小管分泌由腎臟排出［25］。除了經尿液排出之外，TMAO還通過汗液、糞便和呼吸道排出。還有一小部分TMAO被人體腸道中的TMAO還原酶通過厭氧呼吸形式還原為TMA［26］。此外，一些細菌在TMA脫氫酶和TMAO脫甲基酶的作用下消耗TMA和TMAO形成二甲胺和甲醛［27］（圖1）。

Fig.1 The metabolic pathway of TMAO圖1 TMAO的代謝途徑

2 TMAO在AS發(fā)展中的作用

與健康人相比，AS高危人群的血漿TMAO及前體水平更高［28］；與未愈合斑塊的ST段抬高型心肌梗死患者相比，愈合斑塊患者的血漿TMAO水平更高［29］。獨立于心血管疾病傳統(tǒng)危險因素存在的條件下，高水平TMAO可以作為心血管事件發(fā)生的1個新的預測指標，依賴于腸道微生物區(qū)系的途徑有助于AS性冠狀動脈疾病的病理檢測，并提示潛在的治療靶點［30］。

然而，對于TMAO與AS的相關性還存在著相反的結果。在一項以35～55歲人群為研究對象的研究中顯示，TMAO與AS發(fā)展沒有明顯關聯(lián)［31］。我們推測，由于此研究是在相對年輕的個體中進行的，年輕患者大多處于AS進展的早期階段，所以TMAO的心血管效應尚未顯現(xiàn)。此外，年輕人的腎功能較好，TMAO可以被及時排出體外。因此排除年齡因素后，高TMAO水平與AS相關的結論仍具有說服力。

2.1 抑制膽固醇逆向轉運

富含膽固醇酯的泡沫細胞是AS斑塊的標志。許多證據(jù)支持高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）通過ABCA1、ABCG1和SRB1蛋白轉運體促進泡沫細胞膽固醇外流［32］，這是膽固醇逆向轉運（reverse cholesterol transport，RCT）的第一步，是一種很有前景的抗AS策略［33］。RCT通過血漿中的脂蛋白將多余的細胞膽固醇運輸?shù)礁闻K，在肝臟中膽固醇通過轉移到膽汁中以游離膽固醇的形式存在或在轉化為膽汁酸后通過糞便從體內排泄出來，這一過程被認為對減弱AS有一定作用［34］。早期的研究表明，喂食TMAO的小鼠巨噬細胞RCT顯著減少［13］。另有實驗顯示，F(xiàn)MO3基因敲除可以刺激小鼠膽固醇排入糞便，促進巨噬細胞RCT，同時抑制膽汁膽固醇水平和腸道膽固醇吸收［35］。

2.2 上調清道夫受體的表達水平，促進泡沫細胞形成

巨噬細胞來自卵黃囊和胎肝前體，在損傷、感染或炎癥后由骨髓來源的單核細胞進行補充［36］。巨噬細胞通過吞噬氧化低密度脂蛋白（oxidized lowdensity lipoproteins，oxLDL）和少量其他經過修飾的脂蛋白，發(fā)展成為泡沫細胞，成為AS形成的中心參與者［37］。還有一小部分泡沫細胞來源于內皮細胞和血管平滑肌細胞。LDL流入細胞的過程受到多種清道夫受體的調控，如SR-A1、CD36和與oxLDL有親和力的凝集素樣oxLDL受體1（LOX-1）［38］。實驗證實，TMAO可增強清道夫受體LOX-1、SREC和SR-PSOX基因的表達，從而促進泡沫細胞形成，加快AS進程，膳食芹菜素可通過抑制該過程而產生抗AS作用［39］。另有實驗在體內和體外均觀察到TMAO的促AS作用，且發(fā)現(xiàn)CD36/MAPK/JNK通路可能在TMAO誘導的泡沫細胞形成中起重要作用［40］。

2.3 縮小膽汁酸池

膽汁酸是由中心周圍肝細胞中的膽固醇合成的，是膽固醇分解代謝的主要途徑。在人體中每天大約有0.5 g膽固醇被轉化為膽汁酸以平衡糞便流失，這幾乎占到每天身體消耗的膽固醇的一半［41］。膽汁酸池對脂質代謝的調節(jié)有重要作用，膽汁酸池擴大有利于RCT，從而減少AS風險。有實驗顯示，TMAO通過改變膽汁酸分布，進一步激活核受體法尼醇X受體和小異二聚體伴侶，通過降低Cyp7a1的表達來抑制膽汁酸的合成，從而加速小鼠主動脈病變的形成［42］。

2.4 增強血小板反應性、增加血栓形成風險

血小板是AS急性并發(fā)癥的關鍵介質，通過與受損血管壁的內皮細胞和免疫細胞相互作用在疾病晚期導致缺血事件，也是整個斑塊發(fā)展過程中關鍵的炎癥效應因子。在AS的第一步，血液中的炎性白細胞在富含血小板聚集體的區(qū)域與受損的內皮細胞相互作用；在疾病的晚期，血小板會分泌炎癥分子加劇炎癥，誘導疾病從慢性向急性期的轉變，AS病變的不穩(wěn)定性增加，斑塊易破裂和血栓形成。此外，血小板通過調控血管細胞的分化和增殖在慢性炎癥誘導的血管壁重塑中發(fā)揮重要作用［43］。TMAO可誘導細胞內鈣離子釋放，促使血小板活化，并增強血小板功能，使血小板對二磷酸腺苷以及凝血酶的反應性增強；TMAO還可增加血小板對血管膠原蛋白的黏附性，增加血栓形成風險［44］。已有實驗證明TMAO和血小板反應性都是全因死亡率和心血管死亡率的重要且獨立的預測因子［45］。

2.5 損傷血管內皮、促進炎癥反應

AS被認為是一種由血管內皮細胞炎性損傷引起的慢性炎癥性疾病，形成過程始于幾種血漿脂蛋白在血流擾動和內皮功能障礙部位的內皮下空間積聚［46］。TMAO對血管內皮的損傷及炎癥反應的促進作用，主要通過以下兩種途徑實現(xiàn)。

2.5.1 介導mtROS的產生和NLRP3炎性小體的激活

乙酰化酶3（sirtuin3，SIRT3）可與SOD2結合并去乙?；?，抑制SIRT3會降低SOD2的活性，對線粒體活性氧（mitochondrial reactive oxygen species，mtROS）的穩(wěn)態(tài)造成不良影響［47］。ROS的產生會抑制一氧化氮的釋放，從而導致氧化應激和內皮功能障礙［48］，還會使硫氧還蛋白相互作用蛋白（thioredoxin-interactive protein，TXNIP）和硫氧還蛋白（thioredoxin，TRX）解離。TXNIP激活NLRP3炎癥小體，從而上調白介素-1β和白介素-18［49］。多項研究表明，血漿高TMAO水平可通過該途徑導致內皮功能障礙以及由氧化應激增強引起的血管炎癥。TMAO通過激活TXNIP-NLRP3炎癥小體抑制內皮型一氧化氮合酶的活性和一氧化氮的產生，從而觸發(fā)氧化應激并增加白介素-1β和白介素-18的水平［45］；循環(huán)TMAO的升高會通過抑制SIRT的表達而增加氧化應激［50］；在頸動脈內皮細胞中，TMAO激活含有NLRP3炎性小體的NOD樣受體家族嘌呤結構域，從而誘導內皮細胞高通透性，促進炎癥細胞因子的釋放［51］。

2.5.2 激活NF-κB信號通路

TMAO可激活蛋白激酶C，從而促進NF-κB通路的激活，并促進血管細胞黏附分子-1的表達和單核細胞黏附［52］。蛋白激酶C激活后，IκB被磷酸化降解，三聚體被解體釋放活化的NF-κB［53］。NF-κB通路激活后，會發(fā)生一系列的細胞炎癥反應，包括炎性細胞因子的釋放和單核細胞與血管內皮細胞的黏附。TMAO還會增強MAPK/ERK的活性，激活NF-κB通路，從而增強炎癥反應，諾比萊汀可抑制該過程而減輕TMAO引起的血管炎癥［54］。在一項對LDLR基因敲除小鼠和人主動脈內皮細胞和血管平滑肌細胞的研究中證實，TMAO可通過激活MAPK和NF-κB信號通路促進激活的白細胞向內皮細胞募集，加速內皮功能障礙［55］。

3 干預TMAO防治AS的策略

3.1 調整飲食結構

動物實驗發(fā)現(xiàn)，慢性暴露于肉堿飲食使TMA的合成能力增加10倍［13］；素食者空腹TMAO水平比雜食者低［13］；中國人群的TMAO整體水平低于美國人群［56］。這些結果提示，長期攝入TMA前體的飲食會影響TMA的合成能力以及TMAO水平。因此，飲食結構的調整是至關重要的。通過對345名無臨床表現(xiàn)的AS性心血管疾病受試者進行觀察，膳食對腸道微生物區(qū)系的改變和亞臨床頸動脈AS早期階段具有交互作用［57］。這為通過干預飲食預防AS性心血管疾病發(fā)病奠定了基礎。

3.2 調節(jié)腸道菌群

益生菌的使用可對腸道微生物區(qū)系組成產生積極影響：使將膽堿等前體物質轉變成TMA的細菌減少，而使可以清除TMA的細菌增加，甚至可以使細菌基因發(fā)生改變而不能將膽堿和肉堿轉變成TMA［58］。腸道微生物群中普雷沃特氏菌的增加和類桿菌的減少可導致TMAO水平升高［59］。益生菌制劑還能顯著增加抗炎細胞因子白介素-10的產生，并能使主要促炎細胞因子白介素-1、β和白介素-6的分泌減少，還有利于增加巨噬細胞M2表型的抗炎能力［60］。微生物群的組成還受到多種因素的影響，如抗生素?？股刂委熓钦{節(jié)腸道微生物區(qū)系最常用的實驗策略之一，但由于細菌耐藥性和藥物副作用，所以并不支持將其用作治療方法［61］。

3.3 抑制TMA的生物合成

3，3-二甲基-1-丁醇能有效抑制TMA裂解酶的活性和生理性多菌培養(yǎng)物（如腸道內容物、人體糞便）中TMA的產生，并降低喂食高膽堿或L-肉堿飲食小鼠的TMAO水平［62］。然而，3，3-二甲基-1-丁醇并不能完全避免TMAO的合成。研究發(fā)現(xiàn)，膽堿TMA裂解酶和肉堿加氧酶擴增片段與不同的分類群有關［63］。腸道微生物靶向小分子膽堿TMA裂解酶抑制劑還可以改變宿主膽固醇和膽汁酸代謝而發(fā)揮有益作用［64］。但在臨床應用之前，這些實驗結果還需進一步驗證。

3.4 抑制TMA向TMAO的轉化

FMO3基因敲除可顯著降低小鼠全身TMAO水平和血栓形成潛能［65］。然而，F(xiàn)MO3還參與了體內大量藥物、外源性物質和其他化學物質的氧化新陳代謝。肝臟FMO3基因敲除后，TMA會在血漿中蓄積，導致三甲氨基尿癥，并引發(fā)一些新的疾病。所以此方法很難在人體應用。

3.5 天然藥物干預

中醫(yī)藥治療具有療效穩(wěn)定、副作用小等特點，值得開發(fā)和利用，但中醫(yī)藥治療疾病的作用機制還需進一步研究。許多天然藥物成分已被證實可降低血漿TMAO水平，如白藜蘆醇［66］、絞股藍［67］、烏龍茶提取物和柑橘皮多甲氧基黃酮［68］、小檗堿［69］、胡蘆巴堿［70］。還有一些中藥藥對和復方也顯示出降低TMAO水平的功效，如甘草配伍附子［71］、清血消脂方。

清血消脂片對脂代謝紊亂及AS有明確的治療作用［72-74］。實驗證實，清血消脂方可以改善高脂高膽堿飲食喂飼的載脂蛋白E基因敲除小鼠的腸道菌群結構，降低厚壁菌門/擬桿菌門比值（該比值升高是肥胖人群和高脂飲食小鼠腸道菌群的特征），對腸道菌群紊亂的代謝產物有明確的調節(jié)作用［75］，并對TMAO誘導的小鼠單核巨噬細胞白血病細胞炎癥因子白介素-1β和單核細胞趨化蛋白1水平具有干預作用，且通過抑制CD36、SR-A表達干預TMAO促進泡沫細胞的形成［76］。

4 展 望

近年來，越來越多的證據(jù)表明腸道微生物區(qū)系及其代謝產物TMAO在AS的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。腸道微生物區(qū)系及其代謝產物有望成為心血管疾病潛在可調控性因素之一，進而通過干預手段有效減輕AS的發(fā)生和發(fā)展，延緩心血管終末事件的發(fā)生。但干預參與TMAO代謝的菌群種類、如何降低TMAO水平而不引發(fā)新的疾病等問題仍待進一步深入研究。